ES2905107T3 - Procedimientos de modificación de células hospedadoras - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de inserción de una secuencia grande de ADN de inserción heterólogo en un genoma de una célula hospedadora utilizando (i) un plásmido donante que comprende de 5' a 3' (1) una secuencia de reconocimiento de una endonucleasa de restricción codificada por el plásmido auxiliar, (2) una primera región de homología que tiene un tamaño de 0,4-2,0 kb, (3) un ADN de inserción heterólogo de al menos 8 kb, y (4) una segunda región de homología que tiene un tamaño de 0,4-2,0 kb y b) un marcador de contraselección, y ii) un plásmido auxiliar que comprende, bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifique la lambda red recombinasa y, bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifique una endonucleasa de restricción que tenga una secuencia de reconocimiento que no esté presente en el genoma de la célula hospedadora, que comprende las etapas de a) introducción del plásmido donante y el plásmido auxiliar en la célula hospedadora; b) cultivo en condiciones que permitan la expresión de la endonucleasa de restricción y la lambda red recombinasa; y c) selección de clones recombinados que muestren un fenotipo de resistencia a antibióticos consistente con (i) la pérdida de los plásmidos auxiliar y donante y (ii) la presencia del inserto de ADN heterólogo.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos de modificación de células hospedadoras
1. Introducción
En el presente documento se describen nuevos procedimientos para insertar secuencias de ácido nucleico en células hospedadoras. En el presente documento también se describen células hospedadoras genéticamente estables que comprenden secuencias de ácido nucleico insertadas y procedimientos para utilizar dichas células hospedadoras en la generación de proteínas.
2. Antecedentes
La expresión recombinante de genes individuales o pequeños fragmentos de ADN se realiza con mayor frecuencia mediante la proporción del gen recombinante en un plásmido. Los plásmidos se pueden producir y manipular de manera eficaz mediante técnicas de biología molecular [1]. Se insertan rápidamente en una célula hospedadora y se mantienen mediante la selección de antibióticos conferida a la célula hospedadora portadora de plásmidos mediante un casete de resistencia que también se codifica en la molécula de plásmido circular. Normalmente, las proteínas recombinantes se expresan utilizando plásmidos que contienen los genes que codifican las proteínas.
La expresión recombinante de grandes fragmentos de ADN tiene varias limitaciones. Por ejemplo, los plásmidos de expresión estándar a menudo son genéticamente inestables después de la inserción de grandes fragmentos de ADN. A menudo, se utilizan cósmidos y/o fósmidos, que contienen elementos que estabilizan el ADN insertado mediante varios mecanismos, en intentos de superar la inestabilidad del plásmido. Además, los números de copias de plásmidos varían en diferentes órdenes de magnitud, dependiendo del origen de la replicación, y pueden verse influidos adicionalmente por el estado de crecimiento [2], la composición del medio y las diferencias individuales de célula a célula [3]. Además, solo hay un número limitado de cósmidos y fósmidos disponibles. Por lo tanto, generalmente es difícil combinar múltiples fragmentos grandes de ADN en una sola célula. Kuhlman y Cox Nucleic Acids Research vol.
38 (6) p.e92:1-10 desvelan la integración cromosómica específica del sitio de construcciones sintéticas grandes.
Un inconveniente adicional de los plásmidos en general, ya sean grandes o pequeños, es la necesidad de presión de selección para mantener los elementos episomales en la célula. La presión de selección requiere el uso de antibióticos, lo cual es indeseable para la producción de medicamentos debido al peligro de reacciones alérgicas contra los antibióticos y los costes adicionales para la fabricación. Además, la presión de selección a menudo no es completa, lo que da como resultado cultivos bacterianos no homogéneos en los que algunos clones han perdido el plásmido y, por lo tanto, ya no producen productos recombinantes [4].
Además, la inserción cromosómica de grandes fragmentos de ADN en las células hospedadoras es difícil. Si bien se han utilizado estrategias para insertar grandes fragmentos de ADN en el genoma de E. coli [5], los procedimientos actualmente existentes no permiten la inserción de fragmentos de ADN mayores de 8 kb en los sitios deseados en los genomas de células hospedadoras.
3 Sumario
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan procedimientos de inserción de secuencias grandes de ADN de inserción heterólogo en un genoma de una célula hospedadora utilizando (i) un plásmido donante que comprende de 5' a 3' (1) una secuencia de reconocimiento de una endonucleasa de restricción codificada por el plásmido auxiliar, (2) una primera región de homología que tiene un tamaño de 0,4-2,0 kb, (3) un ADN de inserción heterólogo de al menos 8 kb, y (4) una segunda región de homología que tiene un tamaño de 0,4-2,0 kb y b) un marcador de contraselección y ii) un plásmido auxiliar que comprende bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la lambda red recombinasa y bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora que comprende las etapas de: a) introducción del plásmido donante y el plásmido auxiliar en la célula hospedadora; b) cultivo en condiciones que permitan la expresión de la endonucleasa de restricción y la lambda red recombinasa; y c) selección de clones recombinados que muestren un fenotipo de resistencia a antibióticos consistente con (i) la pérdida de los plásmidos auxiliar y donante y (ii) la presencia del inserto de ADN heterólogo. Dichas secuencias de a Dn grandes pueden comprender múltiples componentes, por ejemplo, genes, promotores, terminadores, etc., y se pueden insertar selectivamente en las posiciones deseadas en los genomas de las células hospedadoras. En determinadas realizaciones, las grandes secuencias de ADN se pueden insertar de forma selectiva en las regiones del genoma de las células hospedadoras, de modo que la célula hospedadora expresa uno o más componentes presentes en los fragmentos (por ejemplo, genes), por ejemplo, la célula hospedadora expresa uno o más componentes (por ejemplo, genes) que normalmente no se expresan mediante la célula hospedadora y/o la célula hospedadora expresa un componente (por ejemplo, un gen) que se expresa naturalmente por la célula hospedadora, pero expresa más de dicho componente.
En una realización específica, se proporciona en el presente documento un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicha secuencia de ADN grande comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o más genes. En determinadas realizaciones, los genes presentes en las secuencias de ADN insertadas en células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento están bajo el control de una o múltiples promotores o secuencias reguladoras que también están presentes en las secuencias de ADN. En determinadas realizaciones, las secuencias de ADN insertadas en las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender elementos adicionales esenciales o beneficiosos para la expresión de los genes presentes en la secuencia grande de ADN, por ejemplo, potenciadores, terminadores.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicha secuencia grande de ADN comprende uno o más operones, por ejemplo, un grupo de genes bajo el control de una señal o promotor regulador común.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicho genoma de la célula hospedadora tiene además una eliminación de ADN que normalmente está asociada con el genoma de la célula hospedadora, es decir, el procedimiento resulta tanto en una inserción de ADN heterólogo en el genoma de la célula hospedadora como en la eliminación del ADN normalmente presente del genoma de la célula hospedadora. En realizaciones específicas, la inserción de una secuencia grande de ADN se realiza en el sitio de la eliminación de una secuencia de ADN del genoma de la célula hospedadora del tamaño equivalente, es decir, el ADN del genoma de la célula hospedadora se reemplaza por la secuencia de ADN insertado.
En determinadas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento comprenden la introducción de un plásmido auxiliar y un plásmido donante en una célula hospedadora. Tal como se usa en el presente documento, los plásmidos auxiliares pretenden abarcar plásmidos que comprenden elementos (por ejemplo, genes codificadores) que se requieren para la inserción de una secuencia grande de ADN en el genoma de una célula hospedadora. De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, los plásmidos auxiliares no incorporan ningún ADN en el propio genoma de la célula hospedadora, sino que facilitan la incorporación del ADN de inserción que está presente en los plásmidos donantes descritos en el presente documento. Los plásmidos auxiliares se describen con mayor detalle en la Sección 5.1.1, a continuación. Tal como se usa en el presente documento, los plásmidos donantes pretenden abarcar plásmidos que comprenden la secuencia grande de ADN que se insertará en un genoma de una célula hospedadora, es decir, el plásmido donante "dona" parte de sí mismo al genoma de la célula hospedadora (es decir, dona la secuencia grande de ADN a ser insertada en el genoma de la célula hospedadora). En determinadas realizaciones, los plásmidos donantes proporcionados en el presente documento comprenden otros elementos que son necesarios o útiles para la inserción de la secuencia grande de ADN en el genoma de la célula hospedadora. Los plásmidos donantes se describen con mayor detalle en la Sección 5.1.2, a continuación.
En el presente documento se proporcionan células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras procariotas, por ejemplo, E. coli) que comprenden genomas en los que se han insertado grandes secuencias de ADN de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. Sin pretender quedar vinculados a teoría alguna, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar para generar células hospedadoras genéticamente estables que sean capaces de producir proteínas de interés, por ejemplo, proteínas para su uso como vacunas, proteínas glucosiladas, proteínas para su uso en cosméticos, etc. Como resultado de los procedimientos proporcionados en el presente documento, tales células hospedadoras no necesitan mantenerse y/o propagarse en presencia de ciertos marcadores, por ejemplo, marcadores de selección de antibióticos, debido al hecho de que el ADN que comprende los genes de interés se inserta directamente en el genoma de las células hospedadoras.
En el presente documento se proporciona una célula hospedadora que comprende un plásmido donante y un plásmido auxiliar, (a) en la que el plásmido auxiliar comprende: (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la lambda red recombinasa; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora; y (b) en la que el plásmido donante comprende: (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserción heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contraselección. En una realización específica, la secuencia de reconocimiento comprende al menos 18 pares de bases. En otra realización específica, la endonucleasa de restricción es SceI.
El ADN de inserción heterólogo insertado en los genomas de las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento puede comprender un marcador de selección. En determinadas realizaciones, cuando el ADN de inserción heterólogo comprende un marcador de selección, el marcador de selección está flanqueado por sitios diana de reconocimiento de flipasa (FRT, de sus siglas en inglés). En determinadas realizaciones, la primera y segunda región de homología son homólogas a regiones adyacentes del genoma de la célula hospedadora.
La primera y segunda región de homología de los plásmidos donantes descritos en el presente documento pueden ser de cualquier tamaño necesario o deseado para la inserción del ADN de inserción heterólogo. Por ejemplo, las regiones de homología pueden ser de aproximadamente o al menos 0,5 kb, 0,6 kb, 0,7 kb, 0,8 kb, 0,9 kb, 1 kb, 1,1 kb, 1,2 kb, 1,3 kb, 1,4 kb, 1,5 kb, 1,6 kb, 1,7 kb, 1,8 kb, 1,9 kb, 2,0 kb, o más de 2,0 kb. En determinadas realizaciones, la primera y segunda región de homología pueden ser del mismo tamaño. En determinadas realizaciones, la primera y segunda región de homología pueden ser de diferente tamaño.
El ADN de inserción heterólogo insertado en las células hospedadoras descritas en el presente documento utilizando los procedimientos proporcionados en el presente documento es de gran tamaño, por ejemplo, el ADN de inserción heterólogo es de un tamaño que no es capaz de insertarse en los genomas de las células hospedadoras utilizando procedimientos estándar conocidos en la materia. Por ejemplo, el ADN de inserción heterólogo insertado en las células hospedadoras descritas en el presente documento utilizando los procedimientos proporcionados en el presente documento puede ser de aproximadamente o al menos 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 20 kb, 21 kb, 22 kb, 23 kb, 24 kb, o 25 kb.
3.1 Abreviaturas y terminología
Tal como se usa en el presente documento, las regiones de homología, HR abreviada, se refieren a las regiones de ADN presentes en los plásmidos donantes descritos en el presente documento. Las HR son regiones de ADN que son homólogas a las regiones de ADN presentes en el genoma de las células hospedadoras en las que se pretende insertar el ADN. En determinadas realizaciones, las HR son al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 07%, 98%, 99% o 99,5% homólogas a las regiones de ADN presentes en el genoma de las células hospedadoras en las que se pretende insertar el ADN. En determinadas realizaciones, las HR son 100 % homólogas a las regiones de ADN presentes en el genoma de las células hospedadoras en las que se pretende insertar el ADN. En determinadas realizaciones preferidas, las HR son al menos un 99,5 % homólogas a las regiones de ADN presentes en el genoma de las células hospedadoras en las que se pretende insertar el ADN.
Tal como se usa en el presente documento, los sitios diana se refieren a los sitios presentes en los genomas de las células hospedadoras que son complementarios a las regiones de homología de los plásmidos donantes descritos en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el ADN de inserción heterólogo se refiere a las secuencias de ADN presentes en los plásmidos donantes descritos en el presente documento que se insertan en los genomas de las células hospedadoras diana utilizando los procedimientos descritos en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, en el contexto de ADN, la inserción se refiere al procedimiento de introducción de ADN de inserción heterólogo en otra pieza de ADN (por ejemplo, un genoma de una célula hospedadora), lo que da como resultado una molécula de ADN (por ejemplo, un genoma de una célula hospedadora modificada) que comprende el ADN de inserción heterólogo.
Tal como se usa en el presente documento, las células aceptoras se refieren a células hospedadoras que se modifican de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, las células aceptoras comprenden genomas que se modifican para comprender ADN de inserción heterólogo.
Tal como se usa en el presente documento, casete se refiere a una secuencia de ADN que contiene un gen y sus secuencias reguladoras requeridas para la expresión fenotípica de la función del gen, por ejemplo, la resistencia a antibióticos. Los casetes también pueden contener secuencias flanqueantes que facilitan la eliminación del casete del genoma de una célula aceptora o de otra secuencia de ADN (por ejemplo, un plásmido). Las secuencias flanqueantes ejemplares que pueden asociarse con casetes incluyen sitios diana de reconocimiento de flipasa (FRT). De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, la selección de antibióticos (por ejemplo, la selección de células hospedadoras que expresan marcadores de resistencia a antibióticos específicos) puede realizarse utilizando casetes de selección y antibióticos en los medios de crecimiento. Los casetes se pueden abreviar con la abreviatura de antibiótico seguida de una R mayúscula para la resistencia, por ejemplo, ampR se refiere al casete que confiere resistencia a la ampicilina (amp). Esta nomenclatura describe así un fenotipo en lugar de un genotipo. Las abreviaturas de los antibióticos utilizados de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento se proporcionan en la Tabla 6, a continuación.
Tal como se usa en el presente documento, el grupo de antígenos O y el grupo rfb se refieren a grupos de genes responsables de la biosíntesis de los antígenos O [6].
Tal como se usa en el presente documento, el undecaprenol-fosfato se abrevia como Und-P; y el undecaprenolpirofosfato se abrevia como Und-PP.
Tal como se usa en el presente documento, la exotoxina A desintoxicada de Pseudomonas aeruginosa se abrevia como EPA. La EPA descrita en el presente documento se puede desintoxicar utilizando procedimientos conocidos en la materia [7].
En el presente documento se hace referencia a cepas de E. coli de diferentes colecciones. En tales referencias, upecGVXN"número", CCUG"número" y StGVXN"número" denotan cepas de un estudio epidemiológico que recopila E. coli uropatogénica, la colección de cultivos de Goteborg, Suecia, y la colección de cepas GlycoVaxyn, en las que "número" se refiere al número particular asignado a la cepa.
Figura 1. Mapa esquemático del plásmido donante pDOC-C y elementos relevantes. ampR: casete de ADN que codifica el gen que confiere resistencia a betalactámicos; sacB: casete de expresión que confiere sensibilidad a la sacarosa; oriT: origen de replicación; MCS: sitio de clonación múltiple; SceI: sitio de restricción de la endonucleasa de asentamiento para movilizar el ADN del plásmido donante; Inserto de ADN: tramo de ADN que reemplaza el ADN de la célula aceptora entre HR1 y HR2; HR1, HR2 regiones de homología 1 y 2, estas son las regiones de ADN presentes en la célula hospedadora en las que se produce el cruce y la recombinación homóloga; casete de selección: gen marcador seleccionable para detectar clones integrados, este casete puede estar flanqueado por sitios de recombinación homóloga específicos del sitio que permiten la extracción del casete; ADN de interés: ADN extraño que permanece en la cepa diana en lugar del ADN de la cepa diana después de la extracción del casete de selección.
Figura 2. Esquema de procedimiento de integración. Las diferentes etapas del procedimiento están marcadas mediante números entre paréntesis. La célula diana (rectángulo) que contiene el plásmido auxiliar, plásmido donante (círculos marcados pTKRED y pDOC) y el cromosoma (garabato) se cultivan (1) y se inducen con IPTG y arabinosa (2) para inducir la expresión de la lambda red recombinasa homóloga y la endonucleasa de asentamiento Scel (tijeras). Esta última corta el plásmido donante pDOC y, por lo tanto, moviliza el ADN de inserción que da como resultado el ADN de inserción linealizado dentro de la célula (3). El ADN de inserción linealizado es el sustrato óptimo para la lambda red recombinasa que facilita el cruce y la recombinación homóloga en los sitios de recombinación homóloga HR1 y 2 (barras negras en negrita). La recombinación enzimática está indicada mediante líneas negras delgadas y cruzadas (4). La cepa resultante contiene el ADN de inserción en lugar del ADN anteriormente presente entre HR1 y 2. El plásmido auxiliar y donante se pierden ("curan") de la célula diana mediante diferentes procedimientos como se indica en el texto.
Figura 3. (A) El panel superior muestra el grupo rfb de E. coli 01 de un plásmido donante y las HR flanqueantes están indicadas con líneas finas que se conectan a los sitios diana (sitios homólogos a las regiones de Hr en el ADN de inserción) en el genoma aceptor de la cepa W3110; las cursivas muestran los nombres de los genes, las flechas vacías indican los genes de los plásmidos donantes, las flechas rellenas el grupo aceptor rfb de W3110, que se elimina después de la integración. Las casillas negras, estrechas y rellenas indican los sitios de recombinación específicos del sitio para la eliminación de clmR mediante la recombinación específica del sitio mediada por FLP. El rectángulo grande relleno indica el gen wbbL de W3110 que incluye el elemento de inserción disruptor que hace que el antígeno O de la cepa W3110 sea negativo. Las flechas finas y los números indican las regiones de hibridación y los números de oligonucleótidos utilizados para las pruebas de PCR y la clonación del plásmido donante. (B) representa los resultados de la PCR de colonias para confirmar la presencia del grupo rfb de 01 en las células. Los paneles inferiores son reacciones de prueba de PCR separadas en geles de agarosa mediante electroforesis, teñidas con tinción de ADN de Gel Red e iluminadas con luz UV para visualizar el ADN. Las reacciones de PCR contenían los oligonucleótidos 2241 y 2242 (véase A), y las colonias resuspendidas de las cepas de control y las cepas después de la inserción del grupo rfb, la eliminación de waaL y la eliminación de casetes de selección: 1, W3110 AO16::O1-clmR; 2, W3110 AO16::rfbO1; 3, W3110 AO16::rfbO1 AwaaL::clmR; 4, W3110 AO16::rfbO1 AwaaL 5, W3110 AwaaL; 6, W3110.
Figura 4. Prueba de la expresión de azúcar en O1 en diferentes etapas de la construcción de la cepa. Extractos de células enteras tratadas con proteinasa K de células de E. coli después de la integración del grupo rfb (W3110 ArfbO16::rfbO1-clmR, panel A), la extracción del casete clmR (W3110 ArfbO16::rfbO1, panel B), la interrupción de waaL (W3110 ArjbO16::rjbO1 AwaaL::clmR, panel C) y la eliminación del casete clmR de la eliminación de waaL (W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL, panel D). Los cultivos se cultivaron en medio LB, se incubaron durante la noche a 37 °C y los lisados celulares se trataron mediante disolución en tampón de muestra SDS Lammli e incubación con proteinasa K a 65 °C durante 1 h. Los extractos se separaron mediante SDS PAGE y se desarrollaron directamente utilizando tinción con plata (para visualizar los paneles superiores de LPS, A, C, D), o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia seguida de inmunodetección con antisuero anti-O1 (aO1; paneles inferiores A, B, C, D). Los controles se analizaron en paralelo (Paneles A, B: upecGVXN140, es un aislamiento clínico que se utilizó para amplificar el grupo rfb de O1 para su posterior integración). Los números de carril se indican y las designaciones de cepas se dan en las cajas negras. M: carril marcador, los pesos moleculares se indican en kDa. Las filas marcadas como "Clon" indican diferentes clones analizados de un experimento.
Figura 5. Análisis del antígeno O de O1 de E. coli de la cepa W3110 ArjbO16::rjbO1 AwaaL mediante el marcado 2 AB y MS/MS. A. Análisis por HPLC del antígeno O recombinante de 01 de E. coli. Los extractos celulares se procesaron como se describe: los extractos orgánicos secos de las células se hidrolizaron y se purificaron. Los polisacáridos unidos a Und-PP resultantes se liberaron a partir de lípidos, se purificaron adicionalmente y se marcaron mediante aminación reductora en el extremo reductor con 2 AB. La emisión de fluorescencia se midió tras la separación de los polisacáridos marcados mediante HPLC de fase normal en una columna GlycoSepN. El cromatograma (continuo) es la traza de fluorescencia en función del tiempo de elución (cepa W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL). La traza de puntos es una muestra de control que no expresa el antígeno O (W3110 AwaaL). Los 1, 2, 3, 4 asteriscos indican picos que corresponden a 1, 2, 3 y 4 unidades de repetición de antígeno O; 5 asteriscos son un fragmento de la molécula de 6 unidades de repetición. B. Se seleccionó el análisis MALDI-TOF/TOF de la fracción de elución de HPLC de dos asteriscos del panel A. [m/z] = 1849, correspondiente a la masa esperada de dos aductos de ion Na+ de la unidad de repetición 01, para Ms /Ms , y se indican series de iones de fragmentos Y que confirman la secuencia de monosacáridos esperada.
Figura 6. Prueba de expresión a pequeña escala de la glucoproteína EPA-01 mediante la cepa insertada para la glucosilación O1 de los 4 sitios EPA. Las células de E. coli (W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL) se transformaron con un plásmido de expresión EPA (p659) y cinco plásmidos de expresión pglB diferentes como se describe en los ejemplos, a continuación. Las células se cultivaron y se indujeron con arabinosa e IPTG, después de una incubación durante toda la noche a 37 °C, se recogieron las células y se prepararon extractos de proteína periplásmica. Los extractos se separaron luego mediante SDS PAGe , se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron. Panel izquierdo: transferencia de Western que utiliza antisuero anti-EPA, Panel derecho: transferencia de Western que utiliza antisuero anti-O1. Los plásmidos PglB se indican sobre los carriles (A, p114: expresión de un marcador de HA no optimizado con codones que contiene pglB; B, p939: marcador de HA optimizado con codones; C, p970: marcador de HA optimizado con codones eliminado; D, marcador de HA optimizado con codones que contiene, el sitio de glucosilación natural N534Q eliminado; y E, marcador de HA optimizado con codones que elimina, el sitio de glucosilación natural N534Q eliminado); se indican los tamaños de los carriles marcadores de peso molecular.
Figura 7. Selección de PCR de colonias a partir de la construcción de cepas de las cepas de producción de conjugado de antígeno O de O2 de E. coli en diferentes etapas de construcción. Las células de E. coli de los experimentos de inserción como se indica en el texto se analizaron para determinar las características del genotipado mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos. A. El panel superior muestra el grupo rfb en el plásmido donante y las HR flanqueantes están indicados con líneas finas que se conectan a los sitios diana en el genoma aceptor de la cepa W3110; las cursivas muestran los nombres de los genes, las flechas vacías los genes de los plásmidos donantes, las flechas rellenas el grupo aceptor rfb. Las casillas negras, estrechas y rellenas indican los sitios de recombinación específicos del sitio para la eliminación de clmR mediante la recombinación específica del sitio mediada por FLP. El rectángulo grande relleno indica el gen wbbL interrumpido de W3110 que incluye el elemento de inserción. Las flechas finas y los números indican las regiones de hibridación de los oligonucleótidos utilizados para las pruebas de PCR y la clonación del plásmido donante. B. Los paneles inferiores son geles de agarosa electroforados teñidos con Gel Red iluminados con luz UV para visualizar los productos de las reacciones de la prueba de PCR para probar la eliminación de waaL. Las reacciones de PCR contenían los oligonucleótidos 11l4 y 1326 y las colonias resuspendidas de las cepas de control y las cepas después de la integración, la interrupción de waaL y la eliminación de casetes de selección: 1, St4043 = W3110 AO16::O2-kanR; 2, St4044 = W3110 AO16::O2-kanR AwaaL::clmR; 3, W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL; 4 W3110 AwaaL; 5, W3110; 6,. W3110 AwaaL::clmR. Los tamaños de amplicón esperados son 1,7 kb para la secuencia no modificada, 1,5 kb para la inserción de clmR, 0,5 kb después de la extracción del casete clmR.
Figura 8. Prueba de la expresión del antígeno O de O2 en diferentes etapas de la construcción de la cepa. Los extractos de células enteras tratadas con proteinasa K de células de E. coli después de la integración del grupo rfb (W3110 ArjbO16::rjbO2-kanR, panel A), y la interrupción de waaL seguida de la eliminación del casete clmR y kanR (W3110 ArfibO16::rfibO2 AwaaL, panel B), se prepararon a partir de cultivos cultivados en medio LB, y se incubaron durante la noche a 37 °C. Los lisados celulares se trataron mediante disolución en tampón de muestra SDS Lammli e incubación con proteinasa K a 65 °C durante 1 h. Luego, los extractos se separaron mediante SDS PAGE y se desarrollaron directamente utilizando tinción con plata (para visualizar LPS, panel B, izquierda), o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron con antisuero anti O2 (aO2), para detectar al polisacárido O6 unido a Und-PP (antígeno O unido a Und-PP, panel A, B lado derecho). Las muestras de control se analizaron en paralelo, en la mayoría de los casos las cepas progenitoras parentales. Los números de carril se indican y las designaciones de cepas se dan en las cajas negras. Panel A: el carril 2 contiene un extracto de un aislado clínico que se utilizó para generar el a Dn de interés mediante PCR (upecGVXN116). Panel B: el carril 2 contiene la cepa insertada antes de la eliminación de waaL.
Figura 9. Expresión del antígeno O de O2 de E. coli de la cepa W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL mediante el marcado 2 AB. Las células se procesaron como se describe: los extractos orgánicos secos de las células se hidrolizaron y se purificaron. Los polisacáridos se marcaron mediante aminación reductora en el extremo reductor con 2 AB y se analizaron mediante HPLC de fase normal en una columna GlycoSepN. A. Análisis por HPLC del antígeno O recombinante de O2 de E. coli de la cepa W3110 ArjbO16::rfbO2 AwaaL. El cromatograma (línea continua) es la traza de fluorescencia en función del tiempo de elución. La traza de puntos es una muestra de control que no expresa el antígeno O. Los 1, 2, 3 asteriscos indican picos que corresponden a picos con tiempos de elución consistentes en 1, 2, y 3 unidades de repetición de antígeno O. B. Se seleccionó el análisis MALDl-TOF/TOF de la fracción de pico marcada por dos asteriscos en el panel A. [m/z] = 1817, correspondiente a la masa esperada de dos unidades de repetición de antígeno O de O2 con un ion Na unido, para MS/MS y se indican las series de iones de fragmentos Y que confirman la secuencia correcta de monosacáridos.
Figura 10. Prueba a pequeña escala de cepas integradas para glucosilación de O2 de 4 sitios EPA. Las células de E. coli (W3110 ArjbO16::rjbO2AwaaL) se transformaron con p659 y dos plásmidos de expresión pglB diferentes como se describe en el texto. Las células se cultivaron y se indujeron con arabinosa e IPTG, después de una incubación durante toda la noche a 37 °C, se recogieron las células y se prepararon extractos de proteína periplásmica. Los extractos se separaron luego mediante SDS PAGe , se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron. Panel izquierdo: transferencia de Western que utiliza antisuero antiEPA (aEPA), Panel derecho: transferencia de Western que utiliza antisuero anti O2 (aO2). Los plásmidos se indican sobre los carriles con letras mayúsculas (B, marcador de HA optimizado con codones que contiene el plásmido de expresión pglB (p939), D, marcador de HA optimizado sin codones (p970)), se indican los tamaños de los carriles marcadores de peso molecular. Como control, se analizó un extracto del aislado clínico de E. coli upecGVXN124 (StGVXN3947) que contiene p659 y p939 (carril x).
Figura 11. Selección de PCR de colonias a partir de la construcción de cepas de las cepas de producción de conjugado de antígeno O de O6 de E. coli en diferentes etapas de construcción. Las células de E. coli de los experimentos de integración como se indica en los ejemplos se analizaron para determinar las características del genotipado mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos. El panel A muestra el grupo rfb en el plásmido donante y las HR flanqueantes están indicados con líneas finas que se conectan a regiones HR en los sitios aceptores en el genoma de W3110; las cursivas muestran los nombres de los genes, las flechas vacías los genes de los plásmidos donantes, las flechas rellenas el grupo aceptor rfb en W3110. Las casillas negras, estrechas y rellenas indican los sitios de recombinación específicos del sitio para la eliminación de kanR mediante la recombinación por FLP. La casilla grande rellena indica el gen wbbL interrumpido de W3110. Las flechas finas y los números indican las regiones de hibridación y los números de oligonucleótidos utilizados para las pruebas de PCR y la clonación del plásmido donante. Los paneles inferiores (B-D) son geles de agarosa teñidos con Gel Red iluminados con luz UV para visualizar los productos de las reacciones de la prueba de PCR. Las reacciones de PCR contenían los oligonucleótidos indicados sobre los paneles y las colonias resuspendidas de las cepas de control y las cepas después de la integración, la interrupción de waaL y la eliminación de casetes de selección: 1, W3110; 2, W3110 AwaaL; 3, W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL; 4 y 5, dos clones diferentes de W3110 ArfbO16::rfbO6 AwaaL. Se indican los pares de oligonucleótidos ensayados. La PCR para probar la transición de la región HR en 5' (panel B) da como resultado un producto de PCR de 1,697 kb, para la transición de HR en 3' 3,6 kb o 2,3 kb en presencia o ausencia del casete kanR (panel C), y 0,783 kb para la PCR de wzy (c2564) de O6 (panel D).
Figura 12. Prueba de la expresión del antígeno O de O6 en diferentes etapas de la construcción de la cepa. Los extractos de células enteras tratadas con proteinasa K de células de E. coli después de la integración del grupo rfb (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR, panel A), la interrupción de waaL (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL::clmR, panel B), y la eliminación del casete clmR (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL, panel C), se prepararon a partir de cultivo cultivado en medio LB, y se incubaron durante la noche a 37 °C. Los lisados celulares se prepararon mediante la disolución de sedimentos celulares en tampón de muestra SDS Lammli e incubación con proteinasa K a 65 °C durante 1 h. Luego, los extractos se separaron mediante SDS PAGE y se desarrollaron directamente utilizando tinción con plata (para visualizar LPS, panel B y C, izquierda), o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia, y se inmunodetectaron con antisuero antiO6 (aO6), para detectar el polisacárido de O6 unido a lípidos (antígeno O, panel A, B lado derecho, C lado derecho). Las muestras de control se analizaron en paralelo, en la mayoría de los casos las cepas progenitoras directas como se indica. Los números de carril se indican y las designaciones de cepas se dan en las cajas negras. Panel A: el carril 3 contiene un extracto de una cepa O6 de E. coli de tipo silvestre (CCUG27).
Figura 13. Prueba a pequeña escala de cepas integradas para glucosilación de O6 de EPA que contiene 4 sitios. Las células de E. coli (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL) se transformaron con EPA (p659) y un plásmido de expresión pglB (marcador de HA optimizado con codones, que contiene plásmido de expresión pglB, p939) como se describe en el texto. Las células se cultivaron y se indujeron con arabinosa e IPTG, después de una incubación durante toda la noche a 37 °C, se recogieron las células y se prepararon extractos de proteína periplásmica. Los extractos se separaron luego mediante SDS PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron. Panel izquierdo: transferencia de Western que utiliza antisuero antiEPA (aEPA), Panel derecho: transferencia de Western que utiliza antisuero anti O6 (a06).
Figura 14. Análisis comparativo de diferentes sistemas de producción de glucoconjugados. Se transformaron diferentes células AwaaL de E. coli que producen antígeno O de 01 (panel A), O2 (panel B) y O6 (panel C) con p659 y p939 (marcador de HA optimizado con codones en el extremo C con pglB) y se analizaron para determinar la expresión del glucoconjugado. Los cultivos de expresión se cultivaron en medio TB complementado con mgCh 10 mM a 37 °C. Los cultivos se indujeron a DO600 de 0,4-1,2 en arabinosa al 0,2 % y la adición de IPTG 1 mM. Las células se recogieron después de la inducción durante la noche (20 h) y los extractos periplásmicos se prepararon mediante el procedimiento de la lisozima. Los extractos se separaron luego mediante s Ds PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron con un antisuero anti-EPA (panel izquierdo de A, B y C) y un antisuero específico de antígeno O de O1, O2 u O6 (paneles derechos de A, B, C). Las células hospedadoras eran aislados clínicos de E. coli (carriles 1), insertadas en células W3110 como se describe en esta solicitud de patente (carriles 2: A, W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL, B, W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL, C, W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL), o células AwaaL de W3110 que contienen el grupo rfb respectivo en un cósmido (pLAFR) (carriles 3). Se indican las masas de marcadores de tamaño molecular, así como los sueros de sondeo utilizados para cada transferencia de Western.
Figura 15. Selección por PCR de colonias a partir de la integración del grupo rfb de 017 de P. shigelloides en cepas W3110. Las células de E. coli de los experimentos de integración como se indica en el texto se analizaron para determinar las características del genotipado mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos. Se probaron dos cepas aceptoras diferentes, W3110 y W3110 AwecA-wzzEAwaaL. El panel superior (A) muestra el grupo rfb de P. shigelloides en los plásmidos donantes (sin y con wzz) y la HR flanqueante en las cajas negras, y el sitio diana en el genoma W3110, las cursivas muestran los nombres de los genes, las flechas vacías los genes de los plásmidos donantes, los sitios vacíos de los aceptores. Las casillas negras, estrechas y rellenas indican los sitios de recombinación específicos del sitio para la eliminación de clmR mediante la recombinación específica del sitio mediada por FLP. La casilla grande rellena indica la región del gen wbbL de W3110 interrumpido de manera natural mediante un elemento de inserción. Las flechas y los números indican la ubicación de la hibridación y los nombres de los oligonucleótidos utilizados para las pruebas de PCR. Se probaron los siguientes pares: a) 1226 y 1227 para confirmar la eliminación de wzy de 016 de E. coli, que da como resultado la ausencia de un producto de PCR cuando se elimina wzy, y en un producto de 0,9 kb cuando wzy está presente; b) 1549 y 1550 por la presencia de wzy & wbgVde P. shigelloides, que da como resultado un producto de 1,522 kb; c) 1284 y 1513 para la región de transición HR1 que dé como resultado un producto de 2,545 kb con wzz y 1,403 kb mediante clones sin wzz. B: electroforesis en gel de agarosa de mezclas de reacción de PCR que contienen lisados de colonias de integración (números blancos) y los pares de oligonucleótidos indicados. La ausencia de wzy de 016, la presencia de wzywbgV y las regiones de transición HR1 (en 5') son indicativas de una integración exitosa. Se indican los tamaños de las bandas marcadoras de ADN. Se confirmaron las siguientes cepas: W3110 AwecA-wzzE AwaaL ArfbO16::rfbPsO17-clmR sin wzz: clon 3, W3110 AwecA-wzzE AwaaL ArfbO16::PsO17-clmR con wzz clon 51, W3110 ArfbO16::rfbPsO17-clmR sin wzz clon 7, y W3110 ArfbO16::rfbPsO17-clmR con wzz clon 46.
Figura 16. Prueba de la expresión del antígeno O de P. shigelloides en diferentes etapas de la construcción de la cepa. Las células de E. coli de los experimentos de inserción y seleccionadas mediante selección por PCR se analizaron para determinar la producción de glucolípidos mediante tinción con plata (panel izquierdo) y transferencia de Western utilizando antisuero anti S. sonnei (panel derecho). W3110 AwecA-wzzE AwaaL ArfbO16::rfbPsO17-clmR sin wzz: clon 3 (carril 3), W3110 AwecA-wzzE AwaaL ArfbO16::PsPsO17-clmR con wzz clon 51 (carril 4), W3110 ArfbO16::rfbPsO17-clmR sin wzz clon 7 (carril 1), y W3110 ArfbO16::rfbPsO17-clmR con wzz clon 46 (carril 2).
Figura 17. Prueba de la expresión del antígeno O tipo 1 de S. dysenteriae después de la integración del grupo de genes rfp y rfb, que reemplaza al grupo rfb de W3110. Como cepas diana para la inserción de W3110 y W3110 se utilizaron células AwaaL. Los clones de E. coli de los experimentos de inserción se seleccionaron mediante PCR de colonias. La producción de glucolípidos se analizó mediante tinción con plata (panel izquierdo) y transferencia de Western contra el antisuero anti tipo 1 de S. dysenteriae (panel derecho). Carriles 3, 4: cepas AwaaL de W3110 y W3110 después de la integración; carriles 1, 2: AwaaL de W3110 y W3110 después de la integración y extracción del casete clmR.
Figura 18. Análisis de la expresión del antígeno O de tipo 1 de S. dysenteriae mediante marcaje con 2 AB y HPLC. W3110 ArfbO16::rfbSd1 AwaaL se procesó como se describe en los ejemplos. El cromatograma (panel A) es la traza de fluorescencia en función del tiempo de elución. Los asteriscos indican picos que corresponden a picos con tiempos de elución consistentes con 2 (**), 3, (***) y 4 (****) unidades de repetición de antígeno O analizadas por MALDI-TOF/TOF MS (panel B) [8, 9].
Figura 19. Se produjeron glucoconjugados de antígeno O de tipo 1 de S. dysenteriae en W3110 ArfbO16::rfbSd1 AwaaL utilizando p293 y p114. A. Análisis mediante SEC HPLC. B. Marcaje de PMP para el análisis de la composición de monosacáridos. Se utilizó una mezcla de monosacáridos para calibrar los tiempos de elución de glucosa, ramnosa y 2-N-acetilglucosamina. C. Separación de glucoconjugado mediante SDS PAGE y detección mediante azul de coomassie y detección de antisuero anti S. dysenteriae 1 después de electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa. D. Análisis de hidrazinolisis. El polisacárido en la preparación de glucoproteínas se separó de la proteína mediante hidrazinolisis, se marcó con 2 AB y se analizó mediante HPLC. Los picos indicados se recogieron y el análisis de MS/MS fue consistente con 2 o 3 unidades de repetición de la estructura del antígeno O.
Figura 20. Prueba de expresión de glucolípidos de S. flexneri después del intercambio de la glucosiltransferasa ramificada gtrS mediante gtrII o gtrX. A. Las estructuras de la unidad de repetición de los antígenos O relevantes. La figura muestra que S. flexneri 2a y 3a difieren según el sitio de unión del resto de glucosa ramificado. Los antisueros anti-grupo II y anti-grupo 7, 8 son capaces de discriminar entre esos sitios unidos. B. Análisis mediante PCR de colonias de la integración de gtrII en el genoma W3110. El gen gtrS fue reemplazado mediante un amplicón consistente en gtrII fusionado a un casete clmR. El diagrama muestra el tramo del cromosoma alrededor del grupo gtr después de una recombinación homóloga exitosa, con el casete clmR todavía presente. Las flechas indican las posiciones de hibridación de los oligonucleótidos utilizados para la PCR de colonias. El carril 1 (W3110 AwbbIJK AgtrS::gtrII-clmR) muestra el resultado de una PCR de colonias con un clon recombinado, el carril 2 (W3110 AwbbIJK) es el control. El casete clmR está flanqueado por sitios dif que inducen la escisión del casete mediante recombinación específica del sitio por la recombinasa Xer de E. coli. Esto significa que, en la PCR de colonias, se observan bandas correspondientes al tramo que contiene y carece del casete clmR (los tamaños esperados son 2,8 y 1,8 kb). El control muestra una banda a 1,6 kb como se esperaba para la cepa madre. C. Se analizaron células de E. coli W3110 que contenían el grupo rfb 2457T de S. flexneri en un plásmido mediante tinción con plata (panel izquierdo), transferencia de Western de antisuero anti-grupo II y antisuero anti-grupo 7,8 (paneles medio y derecho). Carril 1: W3110; carril 2: W3110 AgtrS::gtrII, carril 3: W3110 AgtrS::gtrX.
Figura 21. Se produjeron glucoconjugados de antígeno O de tipo 2a de S. flexneri en W3110 ArfbO16::rfbpSf2a AwaaL utilizando p293 y p114. A. Separación de glucoconjugado mediante SDS PAGE y detección mediante tinción con azul de coomassie y detección de antisuero anti tipo II después de electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa. B. Análisis mediante SEC HPLC de glucoproteína EPA purificada. C. Marcaje de PMP para el análisis de la composición de monosacáridos. Se utilizaron monosacáridos para calibrar los tiempos de elución de glucosa, ramnosa y glucosamina. Los tiempos de elución se indican mediante flechas. D. Análisis de hidrazinolisis. El polisacárido en la preparación de glucoproteínas se separó de la proteína mediante hidrazinolisis, se marcó con 2 Ab y se analizó mediante HPLC. Los picos indicados se recogieron y el análisis de MS/MS fue consistente con 2 o 3 unidades de repetición de la estructura del antígeno O y fragmentos del mismo. Cabe destacar que, la rama de glucosa fue claramente detectada por MSMS (no se muestra).
Figura 22. En los sueros de ratas Sprague Dawley inyectadas se analizaron los títulos de IgG contra LPS de S. flexneri 2a. Se muestran títulos de Log de cada suero de rata individual. Se recogieron los sueros 2 semanas después de la tercera inyección. El nivel correspondiente de IgG anti 2a se alcanzó 2 semanas después de la tercera inyección (post 3) y se muestra la diferencia estadística entre los grupos (de acuerdo con la prueba de Mann-Whitney). El título de IgG específico de los sueros animales se ha detectado utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El LPS 2a, extraído de la cepa ATCC700930 de S. flexneri 2a, se adsorbe a los pocillos de una microplaca. El título de anticuerpos 2a se determina luego mediante la adición de diluciones en serie de los sueros a analizar. La peroxidasa de rábano picante acoplada al anticuerpo secundario antiIgG de ratón o de rata se utiliza en una reacción enzimática colorimétrica para determinar el título. El título del punto final se define como la dilución más alta por encima del promedio del grupo preinmunitario 3 veces la desviación estándar de los sueros preinmunitarios, y se expresa como Log10.
Figura 23. Prueba de la expresión del antígeno O de O11 de P. aeruginosa después de la integración del grupo de antígenos PA103 O. Se analizaron células de E. coli de experimentos de integración y se seleccionaron mediante selección por PCR y pruebas fenotípicas para determinar la producción de glucolípidos mediante transferencia de Western contra el antisuero anti grupo E de P. aeruginosa. Se analizaron las cepas diana integradas (carriles 1-4) y los extractos de control que se originan a partir de células DH5a que contienen los plásmidos donantes p1012 (carril 5) y p1013 (carril 6).
Figura 24. Integración de un grupo quimérico de 16 kb compuesto por el grupo rfb de O11 de P. aeruginosa que contiene un casete (compuesto por los genes cap5HIJK fusionados con un casete clmR) que reemplazó al wzy y wbjA de 011 que da como resultado células que pueden producir glucoconjugado recombinante. Los extractos celulares completos se prepararon a partir de células cultivadas durante la noche y se lisaron en tampón SDS Lammli y se trataron con proteinasa K durante 1 h. Se utilizó SDS PAGE para separar los glucolípidos de estas muestras, y se utilizó la tinción con plata o transferencia de Western contra el antisuero anti CP5 para identificar el polisacárido CP5. Carriles 1-3: clones integrados construidos con p471, p477 o p498. p471 contiene HR 1 y 2 correspondientes al ADN cadena arriba de wecA y cadena abajo de las secuencias ORF de wzzE de W3110. La inserción se realizó en células hospedadoras W3110. Los plásmidos donantes también se utilizaron para preparar extractos de control en células DH5a que se analizaron en las calles 5, 6 y 7 (p498, p477 o p471); el carril 4 contiene un control negativo (p473). El carril 8 representa un control positivo preparado a partir de extractos de células W3110 hwecA que contienen el plásmido p393, que produce polisacárido CP5 [10].
La Figura 25 representa un análisis de transferencia de Western de la producción de pglB y 01-EPA mediante la cepa hospedadora mg1655 waaL::pglB-galK de E. coli que alberga un plásmido que expresa un antígeno 01 y un plásmido que expresa EPA. El panel de la izquierda muestra los resultados del sondeo de EPA con un anticuerpo anti-HIS; el panel de la derecha muestra los resultados del sondeo de pglB con un anticuerpo anti-HA.
La Figura 26 representa una estrategia para la purificación de bioconjugados de proteína transportadora-antígeno de azúcar.
La Figura 27 representa un cromatograma del extracto crudo obtenido después del choque osmótico de células hospedadoras que comprende pglB insertado en el genoma de la célula hospedadora y que contiene plásmidos que producen un antígeno de azúcar (Shigella 01) y una proteína transportadora (EPA). El cromatograma muestra los resultados de la ejecución de la fracción de choque osmótico sobre una primera columna de intercambio aniónico (Fuente Q). El O1-EPA identificado en las fracciones combinadas A6-A9 del extracto crudo se representa en un gel teñido con Coomasie (recuadro).
La Figura 28 representa los resultados de la tinción con Coomasie de proteínas presentes en las fracciones obtenidas de proteínas en ejecución aisladas del periplasma de la cepa hospedadora mg 1655 waaL::pglB-galK de E. coli que alberga un plásmido que expresa un antígeno 01 y un plásmido que expresa EPA sobre una primera columna Fuente Q.
La Figura 29 representa los resultados de la tinción con Coomasie de proteínas presentes en las fracciones obtenidas de proteínas en ejecución aisladas del periplasma de la cepa hospedadora mg 1655 waaL::pglB-galK de E. coli que alberga un plásmido que expresa un antígeno 01 y un plásmido que expresa EPA sobre una segunda columna Fuente Q.
La Figura 30 representa un cromatograma del producto obtenido después de que las células hospedadoras que comprenden pglB insertado en el genoma de la célula hospedadora y que contienen plásmidos que producen un antígeno de azúcar (Shigella 01) y una proteína transportadora (EPA) se sometieran a un choque osmótico, se ejecutaran en una primera columna de intercambio aniónico (Fuente Q) y se ejecutaran en una segunda columna de intercambio Aniónico (Fuente Q)
La Figura 31 representa los resultados de la tinción con Coomasie de proteínas presentes en las fracciones obtenidas de proteínas en ejecución aisladas del periplasma de la cepa hospedadora mg 1655 waaL:pglB-galK de E. coli que alberga un plásmido que expresa un antígeno 01 y un plásmido que expresa EPA sobre una columna Superdex 200.
La Figura 32 representa un cromatograma del producto obtenido después de que las células hospedadoras que comprenden pglB insertado en el genoma de la célula hospedadora y que contienen plásmidos que producen un antígeno de azúcar (Shigella 01) y una proteína transportadora (EPA) se sometieran a un choque osmótico, se ejecutaran en una primera Columna de intercambio aniónico (Fuente Q), se ejecutaran en una segunda columna de intercambio aniónico (Fuente Q) y se ejecutaran en una columna Superdex 200.
5 Descripción detallada
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan procedimientos para insertar grandes secuencias contiguas de ADN en los genomas de células hospedadoras. Dichas secuencias de ADN grandes pueden comprender múltiples componentes, por ejemplo, genes, promotores, terminadores, etc., y se pueden insertar selectivamente en las posiciones deseadas en los genomas de las células hospedadoras. En determinadas realizaciones, las grandes secuencias de ADN se pueden insertar de forma selectiva en las regiones del genoma de las células hospedadoras, de modo que la célula hospedadora expresa uno o más componentes presentes en los fragmentos (por ejemplo, genes), por ejemplo, la célula hospedadora expresa uno o más componentes (por ejemplo, genes) que normalmente no se expresan mediante la célula hospedadora y/o la célula hospedadora expresa un componente (por ejemplo, un gen) que se expresa naturalmente por la célula hospedadora, pero expresa más de dicho componente.
En una realización específica, se proporciona en el presente documento un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicha secuencia de ADN grande comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o más genes. En determinadas realizaciones, los genes presentes en las secuencias de ADN insertadas en células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento están bajo el control de una o múltiples promotores o secuencias reguladoras que también están presentes en las secuencias de ADN. En determinadas realizaciones, las secuencias de ADN insertadas en las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender elementos adicionales esenciales o beneficiosos para la expresión de los genes presentes en la secuencia grande de ADN, por ejemplo, potenciadores, terminadores.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicha secuencia grande de ADN comprende uno o más operones, por ejemplo, un grupo de genes bajo el control de una señal o promotor regulador común.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicho genoma de la célula hospedadora tiene además una eliminación de ADN que normalmente está asociada con el genoma de la célula hospedadora, es decir, el procedimiento resulta tanto en una inserción de ADN heterólogo en el genoma de la célula hospedadora como en la eliminación del ADN normalmente presente del genoma de la célula hospedadora. En realizaciones específicas, la inserción de una secuencia grande de ADN se realiza en el sitio de la eliminación de una secuencia de ADN del genoma de la célula hospedadora del tamaño equivalente, es decir, el ADN del genoma de la célula hospedadora se reemplaza por la secuencia de ADN insertado.
En las realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento comprenden la introducción de un plásmido auxiliar y un plásmido donante en una célula hospedadora. Tal como se usa en el presente documento, los plásmidos auxiliares pretenden abarcar plásmidos que comprenden elementos (por ejemplo, genes codificadores) que se requieren para la inserción de una secuencia grande de ADN en el genoma de una célula hospedadora. De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, los plásmidos auxiliares no incorporan ningún ADN en el propio genoma de la célula hospedadora, sino que facilitan la incorporación del ADN de inserción que está presente en los plásmidos donantes descritos en el presente documento. Los plásmidos auxiliares se describen con mayor detalle en la Sección 5.1.1, a continuación. Tal como se usa en el presente documento, los plásmidos donantes pretenden abarcar plásmidos que comprenden la secuencia grande de ADN que se insertará en un genoma de una célula hospedadora, es decir, el plásmido donante "dona" parte de sí mismo al genoma de la célula hospedadora (es decir, dona la secuencia grande de ADN a ser insertada en el genoma de la célula hospedadora). En determinadas realizaciones, los plásmidos donantes proporcionados en el presente documento comprenden otros elementos que son necesarios o útiles para la inserción de la secuencia grande de ADN en el genoma de la célula hospedadora. Los plásmidos donantes se describen con mayor detalle en la Sección 5.1.2, a continuación.
En el presente documento se proporcionan células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras procariotas, por ejemplo, E. coli) que comprenden genomas en los que se han insertado grandes secuencias de ADN de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. Sin pretender quedar vinculados a teoría alguna, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar para generar células hospedadoras genéticamente estables que sean capaces de producir proteínas de interés, por ejemplo, proteínas para su uso como vacunas, proteínas glucosiladas, proteínas para su uso en cosméticos, etc. Como resultado de los procedimientos proporcionados en el presente documento, tales células hospedadoras no necesitan mantenerse y/o propagarse en presencia de ciertos marcadores, por ejemplo, marcadores de selección de antibióticos, debido al hecho de que el ADN que comprende los genes de interés se inserta directamente en el genoma de las células hospedadoras.
En el presente documento se proporciona una célula hospedadora que comprende un plásmido donante y un plásmido auxiliar, (a) en la que el plásmido auxiliar comprende: (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la lambda red recombinasa; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora; y (b) en la que el plásmido donante comprende: (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserción heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contraselección. En una realización específica, la secuencia de reconocimiento comprende al menos 18 pares de bases. En otra realización específica, la endonucleasa de restricción es SceI.
5.1 Procedimientos de inserción de ADN
En el presente documento se proporcionan procedimientos para insertar grandes secuencias de ADN (es decir, ADN de inserción heterólogo) en el genoma de células hospedadoras. Los expertos en la materia apreciarán que los nuevos procedimientos descritos en el presente documento poseen varias ventajas y permitirán la generación de células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras procariotas) que se pueden utilizar para la producción biológica de productos comerciales, incluidas vacunas. Las ventajas ejemplares que poseen las células hospedadoras genéticamente estables generadas de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, (i) la presión de selección es innecesaria para el ADN insertado cromosómicamente, (ii) el número de copias de los genes dentro del ADN de inserción heterólogo está estrictamente regulado a 1 o 2, según el ciclo celular, y (iii) el ADN de inserción heterólogo en los genomas de la célula hospedadora permanece estable durante múltiples generaciones de propagación de la célula hospedadora. Dichas células hospedadoras estables son útiles para, por ejemplo, la fermentación industrial.
Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los nuevos procedimientos de la presente invención se pueden poner en práctica mediante la modificación de diversos componentes utilizados en los procedimientos. Por ejemplo, los plásmidos donantes y los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento pueden comprender múltiples elementos diferentes, siempre que sigan siendo funcionales en los procedimientos descritos en el presente documento. Las modificaciones ejemplares a los plásmidos donantes descritos en el presente documento, los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento y las células hospedadoras descritas en el presente documento se presentan en las Secciones 5.1.1 y siguientes.
En una realización ejemplar, un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN (es decir, ADN de inserción heterólogo) en el genoma de una célula hospedadora comprende el uso de (i) un plásmido donante que comprende (a) ADN de inserción heterólogo flanqueado por regiones de homología (HR), por ejemplo, regiones de homología largas (por ejemplo, HR de cualquier tamaño apropiado, por ejemplo, de 0,4 a 2,0 kb), que dirigen el sitio de recombinación en el genoma de la célula hospedadora (el uso de dicha HR aumenta la eficacia de la inserción) y (b) un marcador de selección de recuento que reprime el crecimiento de células hospedadoras que comprenden el plásmido donante, es decir, el plásmido donante no integrado después de la introducción del plásmido donante en la célula hospedadora (el uso del marcador de selección de recuento elimina los clones falsos positivos [11]); y (ii) un plásmido auxiliar que comprende un marco de lectura abierto que codifica lambda red recombinasa y un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora (por ejemplo, endonucleasa de restricción SceI). En el plásmido auxiliar, el marco de lectura abierto que codifica la lambda red recombinasa y el marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora (por ejemplo, la endonucleasa de restricción SceI) puede estar bajo el control de diferentes promotores (por ejemplo, un primer promotor y un segundo promotor) para la expresión concertada de las proteínas producidas mediante los marcos de lectura abiertos [12]. El plásmido donante también puede comprender la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción presente en el plásmido auxiliar.
Los procedimientos descritos en el presente documento permiten múltiples rondas de inserciones una tras otra, es decir, que primero se puede insertar un inserto de ADN grande en una posición, y luego se pueden realizar más inserciones utilizando el mismo procedimiento. Estas inserciones consecutivas pueden dirigirse a cualquier parte del genoma de la célula hospedadora, es decir, también al ADN insertado previamente o a las secuencias cromosómicas originales presentes en la célula hospedadora. Además, el procedimiento es compatible con otros procedimientos de inserción, como la recombinación homóloga de acuerdo con Datsenko y Wanner (Datsenko KA, Wanner BL: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97(12):6640-6645.). La etapa de inserción de los procedimientos descritos en el presente documento, es decir, la etapa de inserción del ADN de inserción heterólogo en el genoma de una célula hospedadora se basa en la recombinación homóloga, o cruzada, de tramos de ADN homólogo in vivo. Durante la recombinación homóloga, un homólogo del ADN debe estar en el sitio diana, y uno en el constructo donante (es decir, el plásmido donante). De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, los elementos requeridos para la inserción pueden introducirse en la célula hospedadora, por ejemplo, introducirse en uno o más plásmidos que se introducen en la célula hospedadora. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente cómo se pueden introducir los plásmidos en las células hospedadoras, y se proporcionan procedimientos ejemplares para hacerlo en la Sección 5.1.3, a continuación.
Los procedimientos mediante los cuales se puede insertar ADN de inserción heterólogo en el genoma de una célula hospedadora pueden comprender múltiples etapas. Por ejemplo, los plásmidos donantes y/o los plásmidos auxiliares pueden necesitar ingeniería antes de que se pueda realizar el procedimiento. Además, las modificaciones en las células hospedadoras pueden realizarse antes o durante el procedimiento de inserción. Los expertos en la materia entenderán fácilmente qué etapas deben realizarse basándose en el ADN de inserción heterólogo que se desea insertar en una célula hospedadora dada. En general, los procedimientos de inserción de ADN de inserción heterólogo en una célula hospedadora descritos en el presente documento pueden comprender algunas o todas las etapas siguientes:
(1) Se fabrica un plásmido donante. Una secuencia de ADN de inserción heteróloga deseada (es decir, una secuencia de ADN de inserción heteróloga que comprende uno o más genes de interés) se clona en un sitio de clonación (por ejemplo, un sitio de clonación múltiple, abreviado como MCS) de un plásmido adecuado para su uso como plásmido donante (véase Sección 5.1.2). Las secuencias de ADN adecuadas para su uso como regiones de homología (es decir, secuencias de ADN homólogas a la ubicación de inserción en el genoma de la célula hospedadora) también se clonan en el plásmido donante, de modo que las regiones de homología flanquean el ADN de inserción heterólogo. Estos procedimientos de clonación y ensamblaje del plásmido donante se pueden realizar de acuerdo con cualquier tecnología establecida y bien conocida para modificar y sintetizar ADN, tal como, sin limitación, clonación molecular utilizando enzimas de restricción y ligasa, transposasas, síntesis química, etc. cuyas tecnologías son bien conocidas por los expertos en la materia [1].
Además, en determinadas realizaciones un casete de selección que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos se coloca entre los brazos de homología. Las células hospedadoras que comprenden el ADN de inserción heterólogo insertado en su genoma se pueden identificar mediante su cultivo en medios que comprenden el antibiótico al que el gen de resistencia a antibióticos del casete de selección proporciona resistencia. En determinadas realizaciones, el casete de selección puede estar flanqueado por sitios FRT [13], lo que permite la posterior eliminación del casete mediante recombinación dirigida al sitio. La incorporación de los sitios FRT de esta manera en el plásmido donante garantiza así que el casete de selección no permanezca integrado en el genoma de la célula hospedadora. En otra realización, el casete de selección se puede eliminar después de la integración a través de recombinación homóloga dirigida a sitio mediada por sitio dif [14] o mediante otras tecnologías de mutagénesis cromosómica dirigida al sitio.
Los plásmidos donantes descritos en el presente documento también están diseñados para comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteína de contraselección. Cualquier gen que codifique una proteína conocida por los expertos en la materia adecuado para su uso en enfoques de contraselección se puede incorporar en los plásmidos donantes descritos en el presente documento. En una realización específica, el gen sacB se utiliza para la contraselección.
Los plásmidos donantes descritos en el presente documento también están diseñados para comprender un origen de replicación. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que el origen de replicación incorporado en el plásmido donante debería ser adecuado para su uso en la célula hospedadora que está experimentando una modificación del genoma. Por ejemplo, un origen de replicación de E. coli debe estar presente cuando la clonación se está realizando en E. coli. En una realización específica, el origen de la replicación es oriT. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los plásmidos lanzadera (es decir, los plásmidos capaces de replicarse en múltiples células hospedadoras, por ejemplo, múltiples especies bacterianas) se pueden generar utilizando procedimientos conocidos en la materia, y dichos plásmidos se podrían utilizar para la inserción en numerosos tipos de células hospedadoras, por ejemplo, células procariotas, células arqueas, células eubacterianas o células eucariotas. Dichos plásmidos lanzadera pueden comprender elementos de control de expresión específicos del organismo y orígenes de replicación.
(2) Se fabrica un plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar está diseñado para codificar todas las actividades necesarias para mediar la inserción de ADN en las células hospedadoras como se describe en el presente documento y para el mantenimiento del plásmido auxiliar dentro de las células hospedadoras que experimentan recombinación. En determinadas realizaciones, los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento comprenden (i) un casete de selección para el mantenimiento del plásmido en la célula hospedadora, (ii) un regulón para la expresión de una recombinasa, es decir, una enzima o enzimas que apoyan y mejoran el cruce de la eficacia entre tramos de ADN homólogo, (iii) un regulón para la expresión de una función que linealiza el inserto de ADN que da como resultado secuencias homólogas terminales que pueden experimentar una recombinación homóloga, (iv) un regulón que expresa un homólogo de RecA para células hospedadoras que no tienen una copia de recA propia y (v) un origen condicional de replicación. Estos elementos se describen a continuación con más detalle.
En determinadas realizaciones, los plásmidos auxiliares utilizados de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento comprenden componentes similares al plásmido auxiliar pTKRED (Gene bank GU327533.1; [12]). En una realización específica, el plásmido auxiliar pTKRED (Gene bank GU327533.1; [12]) se utiliza en los procedimientos descritos en el presente documento.
(3) El plásmido donante y el plásmido auxiliar se introducen en la misma célula hospedadora. La inserción de plásmidos donantes y auxiliares se puede realizar mediante muchas tecnologías diferentes conocidas por los expertos en la materia, que incluyen, sin limitación, electroporación, el uso de células químicamente competentes, choque térmico y transducción de fagos. Las células hospedadoras se pueden cultivar luego en condiciones selectivas para enriquecer a las células que llevan los plásmidos introducidos.
(4) Se inicia el procedimiento de inserción. Un procedimiento de inserción ejemplar comprende las siguientes etapas: los cultivos durante la noche de clones positivos (es decir, células hospedadoras que comprenden tanto el plásmido auxiliar como el donante) pueden crecer, por ejemplo, a 30 °C en medios que comprenden los antibióticos adecuados para la selección (los expertos en la materia pueden seleccionar fácilmente tales antibióticos en base a los casetes de selección presentes en los plásmidos donante/auxiliar). Los cultivos se pueden entonces diluir y crecer, por ejemplo, a 30 °C hasta la fase exponencial en presencia de antibióticos apropiados. En estas condiciones, los plásmidos auxiliar y donante se mantienen en silencio. A continuación, los medios se reemplazan por medios que contienen los antibióticos para la selección, así como cualquier inductor de elementos condicionales (por ejemplo, promotores inducibles u orígenes condicionales de replicación) presentes en los plásmidos, seguido de una posterior incubación de las células. Durante este tiempo, se expresan la endonucleasa de restricción (por ejemplo, SeeI) en el plásmido auxiliar y la recombinasa (por ejemplo, lambda red recombinasa) en el plásmido auxiliar, lo que conduce a la escisión del plásmido donante en los brazos de homología, y la recombinación homóloga del ADN de homología en los sitios homólogos en el genoma de la célula hospedadora (véase Figura 2). A continuación, las células se colocan en un medio que contiene el componente al que corresponde el marcador de contraselección del plásmido donante (por ejemplo, sacarosa si el marcador de contraselección es sacB). Esta etapa da como resultado la contraselección de células que comprenden el plásmido donante, es decir, las células en las que el plásmido donante existe en un estado no insertado. Dicho medio también comprende el marcador de resistencia presente en el casete de inserción del plásmido donante (es decir, el casete de resistencia a antibióticos que está presente entre la HR del plásmido donante, para seleccionar las células que contienen el ADN del inserción heterólogo). Después de la incubación durante la noche, las células se seleccionan luego en busca de clones recombinados que muestran un fenotipo de resistencia a antibióticos compatible con (i) la pérdida de los plásmidos auxiliar y donante y (ii) la presencia del inserto de ADN heterólogo.
Los expertos en la materia apreciarán que las condiciones anteriores se pueden modificar utilizando enfoques experimentales estándar. Por ejemplo, ciertas condiciones se pueden cambiar en función de las células hospedadoras específicas utilizadas, los marcadores de selección y de contraselección utilizados, etc. Las cepas de inserción ejemplares se presentan en las Tablas 1 y 2.
En una realización específica, un procedimiento para insertar ADN en una célula hospedadora comprende lo siguiente: Cultivos nocturnos de clones positivos (es decir, que contienen plásmidos auxiliares y donantes) se cultivan a 30 °C en medio LB líquido que contiene antibióticos para selección (spec y uno o ambos marcadores seleccionables del plásmido donante), diluidos a DO600 de 0,05 y crecidos a 30 °C hasta la fase exponencial en presencia de espectinomicina y el marcador de selección de inserto de ADN (kanR o clmR). En estas condiciones, el auxiliar y el donante se mantienen en silencio. Después, el medio se reemplaza por medio LB que contiene los antibióticos para la selección, arabinosa al 0,2 % e IPTG 1 mM, y las células se incuban adicionalmente a 30 °C durante varias horas (2, 4, 6, 8 h). Durante este tiempo, se expresan las proteínas recombinasa SceI y Red, lo que conduce a la escisión del plásmido donante en los brazos de homología y a la recombinación homóloga del ADN de homología en los sitios homólogos en el genoma (Figura 2). Después, las células se colocan en placa en medio LB que contiene sacarosa al 10 % (para contrarrestar la selección de células que contienen el plásmido donante), y el marcador de resistencia presente en el casete de inserción (kanR o clmR), para seleccionar las células que aún contienen el inserto de ADN. Otros marcadores de selección y selección de recuento pueden requerir el ajuste de las condiciones. Después de la incubación durante la noche a 37-42 °C, las células se seleccionan en busca de clones recombinados que muestran un fenotipo de resistencia a los antibióticos compatible con i) la pérdida de la ayuda y ii) los plásmidos donantes y iii) la presencia de inserto de ADN. Los clones se replican en placas LM complementados con amp, spec y kan o clm para seleccionar colonias sensibles. Los fenotipos combinados que indican colonias bacterianas candidatas que posiblemente contienen el inserto de ADN son: Sensibilidad a ampicilina (indicativa de la pérdida del plásmido donante); Sensibilidad a espectinomicina (indicativa de la pérdida del plásmido auxiliar); Resistencia clm o kan (indicativa de la presencia de inserto de ADN).
Como se demuestra en los ejemplos de trabajo a continuación, los procedimientos anteriores se utilizaron para insertar secuencias de ADN heterólogas que comprenden antígeno O y grupos de polisacáridos capsulares en ubicaciones específicas del genoma de E. coli, mientras que al mismo tiempo eliminan el antígeno O y los grupos capsulares natural y preexistentes del genoma de E. coli en el procedimiento. Las células hospedadoras resultantes se utilizaron para producir glucoproteínas que consistían en una proteína transportadora expresada en el espacio periplásmico de dichas células hospedadoras que contenían polisacáridos de antígeno O unidos covalentemente en sitios específicos.
Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que tales procedimientos se podrían aplicar para insertar cualquier secuencia de ADN heteróloga deseada en las células hospedadoras.
5.1.1 Plásmidos auxiliares
Los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento y utilizados de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento codifican todos los componentes necesarios para mediar la inserción del ADN y para el mantenimiento del plásmido auxiliar dentro de las células hospedadoras que experimentan recombinación durante el período de tiempo necesario, es decir, las células hospedadoras en las que el a Dn heterólogo se inserta mediante los procedimientos descritos en el presente documento. A continuación, se presentan ciertos componentes que se pueden introducir en los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento.
5.1.1.1 Marcadores seleccionables
Se introducen marcadores seleccionables en los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento para garantizar una introducción adecuada de los plásmidos auxiliares en las células hospedadoras modificadas como se describe en el presente documento. En particular, los marcadores seleccionables se pueden utilizar para seleccionar las células hospedadoras que han aceptado el plásmido después de la transformación, y para mantener el plásmido durante el procedimiento de recombinación. Numerosos sistemas para selección son conocidos en la materia y están disponibles para los expertos en la materia. Los ejemplos incluyen, sin limitación, casetes de genes que confieren (i) resistencia a antibióticos (por ejemplo, amp, kan, spec, clm, gen, tmp, tet) [15]; (ii) crecimiento en medios selectivos, por ejemplo, sistemas de marcadores auxotróficos (Régis Sodoyer, Virginie Courtois, Isabelle Peubez y Charlotte Mignon (2012). Antibiotic-Free Selection for Bio-Production: Moving Towards a New "Gold Standard", Antibiotic Resistant Bacteria - A Continuous Challenge in the New Millennium, Marina Pana (Ed.), ISBN: 978-953-51-0472-8, InTech, Disponible en: http://www.intechopen.com/books/antibiotic-resistant-bacteria-a-continu-ous-challenge-in-thenew-millennium/anti biotic-free-selection-for-bio-production-moving-towards-a-new-gold-stand-ard), (iii) sistemas de toxina-antitoxina, y (iv) resistencia a biocidas como, por ejemplo, triclosán [16]. La Tabla 6, a continuación, también proporciona una lista de antibióticos que se pueden utilizar para la selección.
En una realización específica, se utiliza un casete de resistencia a espectinomicina para la selección del plásmido auxiliar, es decir, para mantener el plásmido auxiliar en la célula diana.
5.1.1.2 Enzimas de recombinasa
Los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento comprenden recombinasas para soportar el cruce (recombinación homóloga) y la re-ligadura de partes homólogas de ADN. Las recombinasas ejemplares que se pueden utilizar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, lambda red recombinasa, RecE/RecT del probacteriófago Rac [17] y RedapA del bacteriófago lambda [18-20].
En una realización específica, la recombinasa usada en los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento es lambda red recombinasa. En otra realización específica, la lambda red recombinasa está bajo el control del promotor lac. La lambda red recombinasa cataliza la reacción de recombinación homóloga (cruce) y consta de tres subunidades funcionales que están codificadas en tres marcos de lectura abiertos en el plásmido. El primer gen es gam, que es un miembro de la familia de la proteína Gam del inhibidor de la nucleasa hospedadora. La proteína Gam inhibe la nucleasa RecBCD y se encuentra tanto en bacterias como en bacteriófagos. El segundo gen es beta y codifica una proteína de la familia RecT. Las proteínas RecT son proteínas de hibridación monocatenarias de ADN (SSAP, de sus siglas en inglés), como RecT, Red-beta, ERF y Rad52, y funcionan en vías de recombinación de ADN dependientes de RecA e independientes de RecA. El tercer gen es el gen exo, que codifica una proteína del dominio recombinasa viral tipo YqaJ. Esta familia de proteínas se encuentra en muchas especies bacterianas diferentes, pero es de origen viral. La proteína forma un oligómero y funciona como una exonucleasa alcalina procesiva que digiere el ADN de doble cadena lineal en una reacción dependiente de mg(2+). Tiene una preferencia por los extremos de ADN fosforilados en 5'. Las tres proteínas promueven eventos de recombinación homóloga en E. coli y otros organismos.
En determinadas realizaciones, las recombinasas presentes en el plásmido auxiliar están bajo el control de promotores distintos del promotor lac. Dichos otros promotores pueden incluir, sin limitación, el promotor araBAD [21], el promotor de ramnosa [22], promotores inducibles por calor [23], el promotor de salicilato [24], el promotor de tetraciclina [25], etc.
5.1.1.3 Endonucleasas
Las endonucleasas en el plásmido auxiliar linealizan el plásmido donante y, por lo tanto, movilizan la pieza de inserción de ADN. Por consiguiente, los plásmidos donantes usados en un procedimiento dado descrito en el presente documento poseen la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción presente en el plásmido auxiliar. La recombinación homóloga mediante enzimas recombinasas depende de los extremos del inserto de ADN de una sola cadena como sustratos para emparejarse con el sitio diana. Por lo tanto, la linealización (es decir, generar extremos de doble cadena) es una etapa importante para la activación del inserto de ADN. Los extremos abiertos del ADN de doble cadena se digieren enzimáticamente en cadenas simples que luego son los sustratos reales para el emparejamiento y la recombinación.
Las endonucleasas utilizadas en el presente documento pueden actuar en el citoplasma de las células hospedadoras, por lo que pueden cortar el plásmido donante, pero no deberían afectar la estabilidad del cromosoma de la célula hospedadora. En general, cualquier enzima de restricción o cortador de doble cadena de ADN se puede utilizar en los procedimientos descritos en el presente documento siempre que no corte el ADN genómico de la célula hospedadora. En realizaciones específicas, se pueden utilizar endonucleasas que funcionan en el citoplasma y se dirigen a sitios de reconocimiento raros y largos, ya que tales endonucleasas son altamente específicas del sitio al tener secuencias de reconocimiento raras. Por ejemplo, las endonucleasas que tienen secuencias de reconocimiento de más de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 2728, 29 o 30 sitios de reconocimiento de pares de bases se pueden seleccionar para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento.
En una realización específica, las endonucleasas de asentamiento se utilizan en los procedimientos descritos en el presente documento. Las endonucleasas de asentamiento son un tipo especial de enzimas de restricción codificadas por intrones o inteínas. Comprenden diferentes grupos estructurales, por ejemplo, las familias de secuencias LAGLIDADG (SEQ ID NO: 1), GIY-YIG (SEQ ID NO: 2), H-N-H y His-Cys. Una lista ejemplar de endonucleasas de asentamiento se proporciona en la Tabla 4, a continuación. Las endonucleasas usadas en el presente documento pueden estar presentes en el plásmido auxiliar de manera que estén bajo el control de un promotor inducible también presente en el plásmido auxiliar.
En una realización específica, la endonucleasa codificada por los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento es SceI. SceI es un miembro de la familia de endonucleasas de ADN LAGLIDADG (SEQ ID NO: 1). Esta es una familia de endonucleasas de ADN específicas del sitio codificadas mediante elementos móviles de ADN. Funcionalmente, SceI es una endonucleasa de restricción de asentamiento que corta una secuencia de reconocimiento de 18 pares de bases TAGGGATAACAGGGTAAT (SEQ ID NO: 3), que nunca ocurre en el genoma de E. coli. La secuencia de reconocimiento específica, rara y larga es crucial para su aplicación en la invención. En determinadas realizaciones, la SceI está bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo, el promotor de arabinosa.
5.1.1.4 RecA
RecA es una enzima bacteriana que desempeña funciones en la recombinación homóloga, la reparación del ADN y la inducción de la respuesta SOS. RecA acopla la hidrólisis de ATP al intercambio de cadenas de ADN, es decir, está catalizando la reacción de recombinación real. Para el fin de la recombinación como se describe en el presente documento, la actividad recA debe estar presente en la célula hospedadora. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la copia presente en el genoma de la célula hospedadora de tipo silvestre es suficiente para que tenga lugar la recombinación. Por lo tanto, no es necesario introducir recA en las células hospedadoras que expresan endógenamente recA.
En las células hospedadoras que no expresan recA, se puede introducir recA en la célula hospedadora en el plásmido auxiliar. Los homólogos de RecA están presentes en casi todos los organismos. Por consiguiente, los expertos en la materia apreciarán que cualquier gen funcional recA se podría utilizar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, es decir, se puede utilizar en base a su presencia natural en la célula hospedadora o se puede utilizar mediante la introducción de la función recA en las células hospedadoras, por ejemplo, células hospedadoras que no comprenden naturalmente recA.
5.1.1.5 Orígenes condicionales de replicación
Se requiere un origen de replicación para la replicación del ADN del plásmido auxiliar y para la distribución de las copias del plásmido a las células hijas durante la división celular. Los orígenes condicionales de replicación se pueden utilizar para mejorar o reducir el número de copias de plásmidos en las células. Por ejemplo, un origen de replicación sensible a la temperatura se puede utilizar en los procedimientos descritos en el presente documento. Dicho origen de replicación no es funcional a temperaturas superiores a 37 °C, lo que da como resultado la pérdida de plásmidos. Otros orígenes condicionales de replicación son conocidos en la materia y se pueden utilizar con los procedimientos descritos en el presente documento [26]. Una lista ejemplar de orígenes condicionales de replicación se proporciona en la Tabla 5.
En una realización específica, el origen de replicación utilizado en el presente documento es un origen de replicación pSC101 sensible a la temperatura [27], que conduce a la pérdida del plásmido durante el crecimiento a altas temperaturas. Otros orígenes de replicación que se pueden utilizar incluyen los de pMB1, ColE1, R100, IncW y otros (véase, por ejemplo, [28]).
5.1.1.6 Promotores e inductores inducibles
La capacidad de controlar la función del plásmido auxiliar es importante para reducir la actividad de recombinación a un tiempo limitado durante el crecimiento celular, ya que pueden producirse reacciones secundarias no deseadas si se promueve la recombinación continua. Por lo tanto, los promotores e inductores inducibles pueden utilizarse para asegurar que ciertos componentes de los plásmidos auxiliares se expresen solo cuando se desee. Los promotores inducibles ejemplares incluyen, sin limitación, el sistema promotor araBAD (inducible por la presencia de arabinosa) y el promotor tac (inducible por la presencia de IPTG). La Tabla 7 proporciona una lista adicional de componentes inducibles que se pueden utilizar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento.
5.1.2 Plásmidos donantes
Los plásmidos donantes descritos en el presente documento "donan" una secuencia de ADN de inserción heteróloga
deseada a una célula hospedadora, dando como resultado células hospedadoras que han integrado de manera estable
el ADN de inserción heterólogo.
En una realización específica, el plásmido donante utilizado en los procedimientos descritos en el presente documento
se basa en el plásmido pDOC-C (Gene bank GQ889494.1; [11]). pDOC-C es un derivado de pEXT100T [29]. El
plásmido contiene un gen de resistencia a la ampicilina para la selección (ampR), un origen para la replicación (oriT)
y el gen sacB. SacB es una proteína secretada del operón levansacarosa que se origina a partir de Bacillus subtilis.
En presencia de sacarosa, sacB confiere letalidad. Por lo tanto, simplemente mediante la adición de sacarosa al medio,
se puede utilizar sacB como un sistema para contrarrestar la selección contra células que llevan el plásmido [30].
Además, pDOC-C codifica un sitio de clonación múltiple que está flanqueado por sitios SceI para la linealización in
vivo.
A continuación, se presentan ciertos componentes que se pueden introducir en los plásmidos auxiliares descritos en
el presente documento.
5.1.2.1 Marcadores seleccionables
Los marcadores seleccionables presentes en los plásmidos donantes descritos en el presente documento pueden
seleccionarse de las mismas listas que se proporcionan en la Sección 5.1.1.1, anteriormente, así como los que se
enumeran en la Tabla 6, a continuación. También se pueden utilizar otros sistemas de selección, por ejemplo, los
sistemas de selección basados en marcadores auxotróficos serían útiles para la selección de eventos de inserción.
Cuando una cepa aceptadora contiene una eliminación en un gen que hace que la cepa sea auxotrófica (es decir, su
crecimiento depende de un determinado componente de los medios), este gen podría incluirse en el inserto de ADN.
En una realización específica, el plásmido donante comprende un casete clmR y/o kanR.
5.1.2.2 ADN de inserción heterólogo
Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que cualquier gen, o combinación de genes, se puede incluir en el
ADN de inserción heterólogo y posteriormente insertarse en los genomas de células hospedadoras utilizando los
procedimientos descritos en el presente documento.
En una realización específica, el ADN de inserción heterólogo insertado en las células hospedadoras descritas en el
presente documento comprende un grupo de genes. En una realización específica, el grupo de genes es uno que
codifica un polisacárido capsular. En otra realización específica, el grupo de genes es uno que codifica el antígeno O.
Las células hospedadoras que comprenden dichos grupos de genes insertados se pueden utilizar, por ejemplo, para
sintetizar la producción de glucoproteínas recombinantes que se pueden utilizar como vacunas.
Los expertos en la materia apreciarán que la presente divulgación permite la inserción estable de grandes secuencias
de ADN en los genomas de células hospedadoras. En determinadas realizaciones, el ADN de inserción heterólogo es
mayor que 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, o 20 kb. En determinadas
realizaciones, el ADN de inserción heterólogo es mayor que 25 kb. En determinadas realizaciones, el ADN de inserción
heterólogo es mayor que 30 kb. En determinadas realizaciones, el ADN de inserción heterólogo es mayor que 35 kb.
En determinadas realizaciones, el ADN de inserción heterólogo es mayor que 40 kb.
En una realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de
ADN que comprende un grupo rfb de una cepa de E. coli en una célula hospedadora. El grupo rfb insertado puede
pertenecer a cualquier antígeno O serogrupo/O conocido en la materia, por ejemplo, 01, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8,
O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29,
O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115,
O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133,
O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150,
O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167,
O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184,
O185, O186 o O187, y subserotipos de los mismos. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula
hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de
ADN que comprende un grupo rfb de una cepa de Pseudomonas en una célula hospedadora. En una realización
específica, la cepa de Pseudomonas es una cepa de P. aeruginosa. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un grupo rfb de una cepa de Salmonella en una célula hospedadora. En una realización específica, la cepa de Salmonella es una cepa de S. entérica. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un grupo rfb de una cepa de Yersinia en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un grupo rfb de una cepa de Klebsiella pneumoniae en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un grupo rfb de una cepa de Francisella tularensis en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un grupo rfb de una cepa de Acinetobacter baumannii en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un grupo rfb de una cepa de Burkholderia en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un grupo rfb de una cepa de Shigella en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se utilizan para insertar una secuencia de ADN que comprende un grupo de genes de polisacáridos capsulares de un organismo en una célula hospedadora. En una realización específica, el organismo es una cepa de E. coli. En otra realización específica, el organismo es una cepa de Streptococcus (por ejemplo, S. pneumoniae, S. pyrogenes, S. agalacticae), una cepa de Staphylococcus (por ejemplo, S. aureus), una cepa de Burkholderia (por ejemplo, B. Mallei, B. pseudomallei, B. thailandensis). En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende una o más enzimas que sintetizan oligo o polisacáridos en el undecaprenilpirofosfato.
En determinadas realizaciones, las células hospedadoras se optimizan mediante la introducción en dichos elementos genéticos de las células hospedadoras que se codifican fuera de un grupo rfb. Por ejemplo, los genes que codifican glucosiltransferasas y acetiltransferasas que se encuentran fuera de los grupos de rfb y los grupos de polisacáridos capsulares y que modifican los polisacáridos recombinantes se pueden introducir en las células hospedadoras. Como otro ejemplo, en los antígenos O de E. coli y Shigella, existen glucosiltransferasas codificadas en grupos de genes de profagos [31, 32]. Estos grupos de genes se denominan gtr y se organizan en un operón que consiste en una glucosiltransferasa que agrega un único resto de glucosa al undecaprenolfosfato (GtrA), GtrB que voltea el undecaprenol unido a glucosa-fosfato a la cara periplásmica de la membrana y el Gtr transferasa específica, que luego transfiere la glucosa unida al undecaprenilfosfato a la cadena de antígeno O en crecimiento. El ADN que comprende dichos genes se puede introducir en las células hospedadoras descritas en el presente documento.
Una modificación similar es la acetilación. La acetilación de los antígenos O es común en Shigella y, en menor medida, en E. coli. La modificación es catalizada mediante una única acetiltransferasa que se codifica a veces dentro de (E. coli 016), pero también fuera del grupo de rfb (S. flexneri 3a) [33]. El ADN que codifica dichas acetil transferasas se puede introducir en las células hospedadoras descritas en el presente documento.
La ramificación y modificación de los antígenos O a menudo es importante para una respuesta inmunitaria eficaz y específica a los polisacáridos. Por lo tanto, estas vías de modificación se pueden incluir en las cepas de producción insertadas para producir conjugados que contienen todos los epítopos posibles encontrados en la naturaleza.
Una realización adicional de la invención es la inserción de casetes de expresión para la producción de proteínas recombinantes que está controlada por un sistema promotor inducible. Esto significa que grandes tramos de ADN que no solo contienen el casete de expresión, sino también construcciones de expresión para proteínas reguladoras son una diana razonable para la tecnología presentada.
Otras secuencias de ADN que se pueden insertar en las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, oligosacariltransferasas y glucosiltransferasas procedentes de fuentes conocidas, por ejemplo, oligosacariltransferasas y glucosiltransferasas procariotas y glicosiltransferasas y/o oligosacariltransferasas y glucosiltransferasas eucariotas.
(a) Selección de regiones de homología
Las longitudes de la región homóloga (HR, de sus siglas en inglés) para su uso de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento se pueden determinar experimentalmente. En general, las HR pueden tener una longitud que varía entre aproximadamente 0,1-3,0 kb, o más. En determinadas realizaciones, las HR pueden son de 0,4-2,0 kb. En determinadas realizaciones, las HR son de longitud idéntica o comparables en longitud. En determinadas realizaciones, las HR no son de longitud idéntica o no son comparables en longitud.
La distancia entre HR también se puede determinar mediante experimentación. La distancia entre HR puede variar desde 0,1 kb a 12 kb, o más, y se puede determinar mediante la longitud del ADN del inserción heterólogo y/o el tramo de ADN en el genoma de la célula hospedadora que se eliminará (por ejemplo, largos tramos del genoma de la célula hospedadora se pueden eliminar siempre que no comprendan un gen esencial para la supervivencia de la célula hospedadora). La ubicación de la inserción del ADN heterólogo se define mediante la secuencia de la HR. Por lo tanto, la inserción se puede realizar en prácticamente cualquier posición en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, en cualquier posición en cualquier cromosoma de una célula hospedadora). En determinadas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar para clonar grandes piezas de ADN en plásmidos presentes en las células diana, siempre que la HR del plásmido donante esté presente en el plásmido diana que está presente en la célula hospedadora, por ejemplo, en lugar de en el cromosoma diana.
Un aspecto importante de los procedimientos descritos en el presente documento es que el inserto de ADN se inserta en una ubicación genómica que se elige mediante selección de las regiones de recombinación homólogas correspondientes (HR1 y HR2, véase figura 1). HR1 y HR2 flanquean el inserto de ADN en el plásmido donante, y también flanquean el ADN que se reemplaza por el inserto de ADN después de la inserción. En los ejemplos de trabajo que se proporcionan a continuación, se seleccionaron HR que se ubican 3 (reemplazo de wecA-wzzE) o 12 kb (reemplazo de grupo de rfb) separadas entre sí en el cromosoma diana, y se observó una inserción exitosa.
Las ubicaciones de inserción se pueden elegir de varias maneras, incluyendo, sin limitación: I) se puede seleccionar una región de inserción porque es deseable eliminar una vía que pueda competir o interferir mediante el reemplazo por la deseada (véase los ejemplos a continuación); II) la inserción se puede elegir en la posición en la que la célula diana contiene naturalmente un grupo similar. El nivel de expresión y la ubicación pueden equilibrarse después para una expresión óptima; III) Una ubicación de inserción puede no estar relacionada con el ADN que se está insertando y se puede elegir empíricamente por completo para el nivel de expresión que el inserto de ADN recombinante muestra en una posición específica, es decir, se podrían hacer múltiples inserciones aleatorias diferentes y elegir la mejor cepa productora; y IV) Una inserción puede eliminar una función no deseada, o eliminar una función que se puede utilizar para la selección de proteínas recombinantes.
(b) Eliminación de ADN en el sitio del inserto
En determinadas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento dan como resultado la eliminación del ADN de la célula hospedadora, por ejemplo, la eliminación del ADN genómico que codifica uno o más genes que pueden interferir con el resultado deseado del ADN insertado. En determinadas realizaciones, el ADN genómico de la célula hospedadora que se va a eliminar se reemplaza directamente con ADN de inserción heterólogo. Este concepto, es decir, eliminar una vía que pueda competir o interferir mediante el reemplazo por la deseada, es una forma razonable de elegir los sitios de inserción de a Dn .
En realizaciones específicas, en los casos en los que se desea diseñar glucoconjugados de proteínas con células hospedadoras modificadas generadas utilizando los procedimientos descritos en el presente documento, es útil eliminar genes que codifican proteínas que reducen los rendimientos de glucoproteínas, incluidos, sin limitación, waaL, genes codificados en el grupo de genes del antígeno común enterobacterial (ECA, de sus siglas en inglés) (también llamado grupo wec), genes de grupos de genes gtr profagos, genes implicados en la biosíntesis de nucleótidos de azúcar, genes que codifican proteasas periplásmicas y genes biosintéticos y de reciclaje Und-P. En algunos casos, las glucosiltransferasas de la célula hospedadora pueden interferir con la producción de polisacáridos recombinantes codificada por el inserto de ADN. Por consiguiente, una realización adicional de la invención es la eliminación de glucosiltransferasas de células hospedadoras que modifican el polisacárido recombinante dando como resultado una estructura híbrida con características no deseadas.
Las secuencias no deseadas e innecesarias son motivo de preocupación cuando se utilizan cepas bacterianas recombinantes para la producción de material clínico bajo GIMp . Por lo tanto, en determinadas realizaciones, las secuencias de ADN auxiliares se eliminan de las células hospedadoras generadas de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento una vez que ya no son necesarias. Por ejemplo, los casetes de selección que se insertan junto con el ADN de interés se pueden eliminar posteriormente para que ya no estén asociados con las células hospedadoras generadas. Para eliminar dichos elementos después de la inserción del ADN, se pueden utilizar diferentes procedimientos [34]. Por ejemplo, se puede utilizar la recombinación específica de sitio procedente de FRT/FLP [35] (véase los Ejemplos). En tales casos, una recombinasa (por ejemplo, una recombinasa FLP que reconoce una secuencia de 28 pb) específica para las secuencias FLP que flanquean la secuencia a eliminar puede recombinar las secuencias, mediante la extracción del ADN entre estas secuencias específicas. Los sistemas de escisión alternativos son loxP/Cre, y los sistemas difXer [14, 36].
5.1.2.3 Otras modificaciones
En determinadas realizaciones, los glucoconjugados descritos en el presente documento se producen en medio de crecimiento optimizado. En determinadas realizaciones, el medio de crecimiento se optimiza mediante la variación de uno o más de (i) la cantidad de extracto de levadura en el medio (por ejemplo, de 5 a 35 g/l), (ii) la concentración de mg2+ del medio (por ejemplo, de 0 a 25 mM), (iii) la concentración de extracto de peptona del medio (por ejemplo, de 5 a 25 g/l), (iv) la concentración de extracto de triptona del medio (por ejemplo, de 5 a 25 g/l), y/o (v) la adición de chaperonas moleculares al medio, por ejemplo, la adición de trehalosa (por ejemplo, 25 mM-50 mM), etilenglicol (por ejemplo, 0,5 %), ácido glutámico (por ejemplo, 0,1 M), putrescina (por ejemplo, 25 mM), trimetil-N-óxido (por ejemplo, 5 mM) y/o L-prolina (por ejemplo, 5 mM).
En determinadas realizaciones, el medio de crecimiento se optimiza mediante la variación del pH del medio. Por ejemplo, las variaciones de pH 6,5 a 8,5 se pueden evaluar para determinar los efectos sobre el rendimiento del glucoconjugado. Ciertos genes se desempeñan de manera óptima a cierto pH. Por consiguiente, el medio de crecimiento se puede utilizar a los valores de pH seleccionados para la optimización de genes específicos. Por ejemplo, la actividad de PglB es óptima a ~ pH 8. Por lo tanto, en realizaciones específicas, el crecimiento de células hospedadoras en los procedimientos descritos en el presente documento se realiza a pH 8. En otra realización específica, el crecimiento de células hospedadoras en los procedimientos descritos en el presente documento se realiza a un pH que varía de 4-6, 5-7, 6-8 o 7-9.
5.1.3 Procedimientos de introducción de plásmidos
Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia para introducir plásmidos, por ejemplo, plásmidos donantes y auxiliares, y ADN en células hospedadoras. Dichos procedimientos pueden incluir, sin limitación, electroporación, transformación química por choque térmico, transformación natural, transducción de fagos y conjugación.
5.1.4 Células hospedadoras
En el presente documento se describen células hospedadoras modificadas por ingeniería genética mediante los procedimientos descritos en el presente documento, en los que dichas células hospedadoras comprenden uno o más genes que codifican proteínas de interés. Las proteínas producidas por las células hospedadoras descritas en el presente documento son antígenos, por ejemplo, antígenos virales o bacterianos que se pueden utilizar en vacunas. Las proteínas producidas por las células hospedadoras descritas en el presente documento son proteínas transportadoras, en las que dichas proteínas transportadoras se modifican por las células hospedadoras descritas en el presente documento para poseer una o más características beneficiosas, por ejemplo, la proteína transportadora está glucosilada.
Los elementos codificados en los plásmidos auxiliares y donantes determinan si la invención se puede utilizar en una determinada célula hospedadora. Los Ejemplos a continuación describen el uso en células hospedadoras de E. coli Gram-negativas; sin embargo, cualquier célula hospedadora conocida por los expertos en la materia se podría utilizar como células aceptoras para la inserción de ADN, incluidas las arqueas, las células hospedadoras procariotas y las células hospedadoras eucariotas. Las células hospedadoras procariotas ejemplares incluyen, sin limitación, especies de Escherichia, especies de Shigella, especies de Klebsiella, especies de Xhantomonas, especies de Salmonella, especies de Yersinia, especies de Lactococcus, especies de Lactobacillus, especies de Pseudomonas, especies de Corynebacterium, especies de Streptomyces, especies de Streptococcus, especies de Staphylococcus, especies de Bacillus y especies de Clostridium.
5.1.5 Procedimientos analíticos
Para la aplicación funcional de la divulgación, es esencial utilizar una combinación de diferentes sistemas de selección para el mantenimiento del plásmido (plásmido auxiliar, plásmido donante) y la selección del inserto de ADN. Estos sistemas de selección deben ser compatibles entre sí, es decir, podrían ser como en el sistema existente (specR, ampR y clmR o kanR), o cualquier combinación alternativa de casetes de antibióticos útiles y/o sistemas de selección de plásmidos alternativos.
Los genotipos de clones de inserción candidatos se pueden verificar mediante cualquier procedimiento utilizado para el análisis de ADN. La detección debe basarse en analizar la presencia del inserto de ADN en el contexto de la ubicación de inserción cromosómica. Esto significa que las inserciones de ADN deben encontrarse junto al sitio diana, es decir, secuencias fuera de la región del sitio diana. La PCR se puede hacer para mostrar la ausencia de un gen que se ha escindido mediante recombinación, por ejemplo, cuando un grupo de antígenos O se intercambia con uno diferente. O se puede utilizar para mostrar la presencia de inserto de ADN. O se puede utilizar para amplificar un tramo de ADN utilizando oligonucleótidos que flanquean las HR, lo que demuestra que se produjo una unión de ADN cromosómico e inserto de ADN. La secuenciación de ADN puede mostrar el mismo resultado, es decir, la secuencia de inserción de ADN debe estar continuamente conectada a las secuencias de ADN cromosómicas no afectadas por la recombinación homóloga. O la transferencia de Southern se podría utilizar para identificar fragmentos de ADN cromosómicos que contienen inserto de ADN y secuencias cromosómicas no afectadas junto al sitio de inserción (HR).
O se puede utilizar la hibridación de colonias con sondas de PCR específicas para una pieza de inserción de ADN.
Otra forma de mostrar la presencia del inserto de ADN es mediante la evaluación de la actividad de los genes insertados. El análisis fenotípico de los clones candidatos permite verificar la actividad del inserto de ADN, pero no la ubicación de inserción correcta. En los ejemplos que se muestran a continuación, se insertó un grupo de genes de biosíntesis de polisacáridos recombinantes, por lo tanto, un experimento simple que muestra la presencia del polisacárido después de la inserción en la célula recombinada es suficiente para confirmar una recombinación exitosa.
Esto se puede hacer mediante inmunotransferencias utilizando antisueros específicos de polisacáridos (transferencia de Western, transferencia de colonias, transferencia de dot, etc.), posiblemente, pero no necesariamente en combinación con la separación de extractos celulares mediante SDS PAGE o cromatografía, seguido de transferencia de Western o ELISA; también, las técnicas de alta resolución como MS, NMR, HPLC o procedimientos de identificación química o física para el producto son útiles para confirmar la actividad del inserto de ADN.
5.2 Aplicaciones
5.2.1 Glucosilación de proteínas
Las células hospedadoras modificadas proporcionadas en el presente documento se pueden utilizar para la glucosilación de proteínas. La glucosilación de proteínas puede diseñarse para producir vacunas conjugadas, es decir, vacunas que contienen polisacáridos y antígenos proteicos del patógeno contra el cual se diseña la vacuna.
5.2.1.1 Antígenos
El ADN que codifica los genes asociados con los siguientes antígenos de polisacáridos se puede utilizar como ADN de inserción de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento:
Antígenos O de E. coli (O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, 075, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186, O187), sp. de Salmonella (S. entérica subsp.
Entérica, S. entérica subsp. Salamae, S. entérica subsp. arizonae, S. entérica subsp. Diarizonae, S. entérica subsp.
Houtenae, S. bongori, y S. entérica subsp. Indica, y O types 1-67, como se detalla en [37], sp. Pseudomonas (P. aeruginosa O serotipos 1-20 [38]), sp. Klebsiella (particularmente K. pneumonia serotipos O1,O2 (y subserotipos), O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, o 11, O12, [39]), antígenos O de Acinetobacter (en particular antígenos O de A. baumannii identificados en [40]), antígenos O de Chlamydia trachomatis (serotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, Ll, L2, L3), antígenos O de Vibrio cholera 01 a 155, sp. Listeria, en particular L. monocytogenes tipo 1,2, 3, 4 y subtipos de la misma, antígenos O de Legionella pneumophila serotipos 1 a 15, antígenos O de Bordetella parapertussis, antígenos O de Burkholderia mallei y pseudomallei, Francisella tularensis, sp. Campylobacter (C. jejuni); polisacáridos capsulares de Clostridium difficile (serotipos A, G, H, K, S1, S4, D, Cd-5, K Toma y col. 1988, y C. perfringens serotipos A, B, C, D y E), Staphylococcus aureus tipo 5 y 8, Streptococcus pyrogenes (polisacáridos del serotipo capsular de estreptococos del grupo B), E. coli, Streptococcus agalacticae (polisacáridos capsulares de estreptococos del grupo B), Neisseria meningitidis (serotipos A, B, C, W, Y, X), Candida albicans, Haemophilus influenza, polisacáridos capsulares de Enterococcus faecalis tipo I-V; y otras estructuras de polisacáridos de superficie, por ejemplo, los glucolípidos de Borrelia burgdorferi ([41]), polisacáridos O de Neisseria meningitidis [42, 43] y lipooligosacárido (LOS), LOS de Haemophilus influenza, lipofosfopolisacáridos de Leishmania major [44, 45]), antígenos de carbohidratados asociados a tumores, fosfatidilinositol glucosil de malaria, arabinomanano de Mycobacterium tuberculosis [46].
5.2.1.2 Proteínas transportadoras
Cualquier proteína transportadora adecuada para su uso en la producción de vacunas conjugadas se puede utilizar en el presente documento. Las proteínas transportadoras ejemplares incluyen, sin limitación, Exotoxina A de P.
aeruginosa (EPA), CRM197, toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A detoxificada de S. aureus, factor de aglutinamiento A, factor de aglutinamiento B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli, variantes detoxificadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidad B de toxina del cólera (CTB, de sus siglas en inglés), toxina del cólera, variantes detoxificadas de la toxina del cólera, proteína sat de E. coli, el dominio pasajero de la proteína sat E. coli, C. jejuni AcrA y glicoproteínas AcrA de C. jejuni y naturales de C. jejuni.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras utilizadas en la generación de las vacunas conjugadas descritas en el presente documento se modifican, por ejemplo, se modifican de tal manera que la proteína es menos tóxica y/o más susceptible a la glucosilación, etc. En una realización específica, las proteínas transportadoras utilizadas en la generación de las vacunas conjugadas descritas en el presente documento se modifican de tal manera que el número de sitios de glucosilación en las proteínas transportadoras se maximiza de una manera que permite que se administren concentraciones más bajas de la proteína, por ejemplo, en una composición inmunogénica, en su forma bioconjugada. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las proteínas transportadoras descritas en el presente documento se modifican para incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más sitios de glucosilación que normalmente estarían asociados con la proteína transportadora (por ejemplo, relativo al número de sitios de glucosilación asociados con la proteína transportadora en su estado nativo/natural, por ejemplo, "tipo silvestre"). En realizaciones específicas, la introducción de sitios de glucosilación se lleva a cabo mediante la inserción de secuencias de consenso de glucosilación en cualquier lugar de la estructura primaria de la proteína. La introducción de dichos sitios de glucosilación se puede lograr, por ejemplo, agregando nuevos aminoácidos a la estructura primaria de la proteína (es decir, los sitios de glucosilación se agregan, en su totalidad o en parte), o mediante la mutación de los aminoácidos existentes en la proteína para generar los sitios de glucosilación (es decir, los aminoácidos no se agregan a la proteína, pero los aminoácidos seleccionados de la proteína se mutan para formar sitios de glucosilación). Los expertos en la materia reconocerán que la secuencia de aminoácidos de una proteína se puede modificar fácilmente utilizando enfoques conocidos en la materia, por ejemplo, enfoques recombinantes que incluyen la modificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína. En realizaciones específicas, las secuencias de consenso de glucosilación se introducen en regiones específicas de la proteína transportadora, por ejemplo, estructuras superficiales de la proteína, en los extremos N o C de la proteína, y/o en bucles que se estabilizan mediante puentes disulfuro en la base de la proteína. En determinadas realizaciones, la secuencia de consenso de glucosilación de 5 aminoácidos clásica puede extenderse mediante restos de lisina para una glucosilación más eficaz y, por lo tanto, la secuencia de consenso insertada puede codificar 5, 6 o 7 aminoácidos que deben insertarse o que reemplazan a los aminoácidos de proteínas aceptoras.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras utilizadas en la generación de las vacunas conjugadas descritas en el presente documento comprenden un "marcador", es decir, una secuencia de aminoácidos que permite el aislamiento y/o la identificación de la proteína transportadora. Por ejemplo, agregar un marcador a una proteína transportadora descrita en el presente documento puede ser útil en la purificación de esa proteína y, por lo tanto, la purificación de vacunas conjugadas que comprenden la proteína transportadora marcada. Los marcadores ejemplares que se pueden utilizar en el presente documento incluyen, sin limitación, marcadores de histidina (HIS) (por ejemplo, marcador hexa histidina o marcador 6XHis), marcadores FLAG-TAG y HA. En determinadas realizaciones, los marcadores usados en el presente documento son extraíbles, por ejemplo, la eliminación mediante agentes químicos o mediante medios enzimáticos, una vez que ya no son necesarios, por ejemplo, después de que la proteína se haya purificado.
5.2.1.3 Modificaciones de la célula hospedadora
Las células hospedadoras usadas para producir las vacunas conjugadas descritas en el presente documento están diseñadas para comprender ácidos nucleicos heterólogos, por ejemplo, ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más proteínas transportadoras y/o ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más proteínas, por ejemplo, genes que codifican una o más proteínas. En una realización específica, pueden introducirse ácidos nucleicos heterólogos que codifican proteínas implicadas en rutas de glucosilación (por ejemplo, rutas de glucosilación procariotas y/o eucariotas) en las células hospedadoras descritas en el presente documento. Dichos ácidos nucleicos pueden codificar proteínas que incluyen, sin limitación, oligosacaril transferasas y/o glucosiltransferasas. Los ácidos nucleicos heterólogos (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican proteínas transportadoras y/o ácidos nucleicos que codifican otras proteínas, por ejemplo, proteínas involucradas en la glucosilación) se pueden introducir en las células hospedadoras descritas en el presente documento utilizando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia, por ejemplo, electroporación, transformación química por choque térmico, transformación natural, transducción de fagos y conjugación. En realizaciones específicas, los ácidos nucleicos heterólogos se introducen en las células hospedadoras descritas en el presente documento utilizando un plásmido, por ejemplo, los ácidos nucleicos heterólogos se expresan en las células hospedadoras mediante un plásmido (por ejemplo, un vector de expresión). En otra realización específica, los ácidos nucleicos heterólogos se introducen en las células hospedadoras descritas en el presente documento utilizando los procedimientos de inserción proporcionados en el presente documento.
En determinadas realizaciones, pueden introducirse modificaciones adicionales (por ejemplo, utilizando técnicas recombinantes) en las células hospedadoras descritas en el presente documento. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la célula hospedadora (por ejemplo, los genes) que codifican proteínas que forman parte de una vía de glucosilación que posiblemente compita o interfiera (por ejemplo, compite o interfiere con uno o más genes heterólogos involucrados en la glucosilación que se introducen de forma recombinante en la célula hospedadora), se pueden eliminar o modificar en el fondo de la célula hospedadora (genoma) de una manera que los hace inactivos/disfuncionales (es decir, los ácidos nucleicos de la célula hospedadora que se eliminan/modifican no codifican una proteína funcional o no codifican una proteína en absoluto). En determinadas realizaciones, cuando los ácidos nucleicos se eliminan del genoma de las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento, se reemplazan por una secuencia deseable, por ejemplo, una secuencia que es útil para la producción de glucoproteínas. Dicha sustitución se puede realizar mediante uno o más de los procedimientos de inserción descritos en el presente documento, en los que el ADN de inserción heterólogo que se inserta en la célula hospedadora puede reemplazar la función del gen o genes eliminados de la célula hospedadora.
Los genes ejemplares que se pueden eliminar en las células hospedadoras (y, en algunos casos, reemplazar con otras secuencias de ácido nucleico deseadas) incluyen genes de las células hospedadoras involucrados en la biosíntesis de glucolípidos, tal como waaL (véase, por ejemplo, Feldman y col., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), grupo de biosíntesis de núcleo del lípido A, grupo de galactosa, grupo de arabinosa, grupo de ácido colónico, grupo de polisacáridos capsulares, genes de biosínteis de undecaprenol-p, genes de reciclaje und-P, enzimas metabólicas involucradas en la biosíntesis de azúcares activados por nucleótidos, grupo de antígenos comunes enterobacterianos y grupos de modificación de antígenos O del profago como el grupo de captadores. En una realización específica, las células hospedadoras descritas en el presente documento se modifican de manera que no producen ningún antígeno O distinto de un antígeno O que se produce como resultado de la inserción de a Dn de inserción heterólogo en el genoma de la célula hospedadora mediante un procedimiento descrito en el presente documento. En otra realización específica, las células hospedadoras descritas en el presente documento se modifican de manera que no producen ningún polisacárido capsular distinto de un polisacárido capsular que se produce como resultado de la inserción de ADN de inserción heterólogo en el genoma de la célula hospedadora mediante un procedimiento descrito en el presente documento.
5.2.1.4 Glucoconjugados
Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar para producir glucoconjugados que comprenden una proteína transportadora glucosilada (véase, por ejemplo, la sección 5.2.1.2). En realizaciones específicas, en el presente documento se proporcionan glucoconjugados que comprenden una proteína transportadora (véase, por ejemplo, la sección 5.2.1.2) glucosilada con un antígeno (por ejemplo, un polisacárido) descrito en el presente documento, por ejemplo, un antígeno descrito en la sección 5.2.11. En realizaciones específicas, la proteína transportadora es EPA.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un glucoconjugado que comprende EPA y uno o más polisacáridos diferentes, por ejemplo, uno o más polisacáridos descritos en la sección 5.2.11.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un glucoconjugado que comprende una proteína transportadora conjugada con una o más de O1, O2, O4, O6, O7, O8, O11, O15, O16, O17, O18, O20, O22, O25, O73, 075 y/o O83 de E. coli. En una realización específica, la proteína transportadora es EPA.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un glucoconjugado que comprende una proteína transportadora conjugada con uno o más polisacáridos diferentes de P. aeruginosa. En una realización específica, la proteína transportadora es EPA.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un glucoconjugado que comprende una proteína transportadora conjugada con uno o más polisacáridos diferentes de K. pneumonia. En una realización específica, la proteína transportadora es EPA.
5.2.1.5 Beneficios
Los procedimientos para producir glucoconjugados descritos en el presente documento son de particular importancia y relevancia comercial, ya que permiten una fermentación a gran escala con un riesgo menor debido al aumento de la estabilidad del ADN insertado cromosómicamente y, por lo tanto, la expresión del ADN de interés durante la fermentación. Los procedimientos conocidos para mantener la expresión del ADN de inserción se basan en los episomas que llevan el ADN de inserción. Estos episomas deben mantenerse mediante la selección de antibióticos. Los procedimientos descritos en el presente documento, de este modo, son ventajosos sobre la expresión del ADN insertado en el plásmido porque, inter alia, no se requiere la selección de antibióticos durante la fermentación una vez que el ADN heterólogo se inserta en el genoma de la célula hospedadora. Es decir, cuando el ADN de inserción se inserta en el cromosoma, no es necesario seleccionarlo, ya que se propaga junto con la replicación del genoma hospedador. Además, es una desventaja conocida en los sistemas transmitidos por plásmidos que con cada generación (es decir, el ciclo de replicación de la célula hospedadora) aumenta el riesgo de perder el plásmido. Esta pérdida de plásmido se debe a la distribución a veces inapropiada de plásmidos a células hijas en la etapa de separación celular durante la división celular. A gran escala, los cultivos de células bacterianas se duplican más a menudo que en escalas de fermentación más pequeñas para alcanzar altas densidades celulares. Por lo tanto, una mayor estabilidad celular y la expresión del ADN de inserción conducen a rendimientos más altos del producto, lo que proporciona una clara ventaja. La estabilidad celular es además un criterio de aceptación del procedimiento para su aprobación por parte de las autoridades reguladoras, mientras que la selección de antibióticos generalmente no se desea durante la fermentación por diversas razones, por ejemplo, los antibióticos presentes como impurezas en los medicamentos finales corren el riesgo de causar reacciones alérgicas y los antibióticos pueden promover la resistencia a los antibióticos (por ejemplo, mediante transferencia de genes o selección de patógenos resistentes).
Otra ventaja de los procedimientos descritos en el presente documento es que se pueden insertar grandes piezas de ADN en el genoma de las células hospedadoras a la vez ("inserción al mismo tiempo"). Los procedimientos existentes para la introducción de ADN en el genoma de células hospedadoras emplean la inserción reproducida de pequeños fragmentos de ADN mediante recombinación homóloga [47]. Por lo tanto, sin quedar limitados a teoría alguna, los procedimientos de inserción al mismo tiempo descritos en el presente documento son ventajosos porque permiten evitar inserciones múltiples.
5.2.1.6 Procedimientos analíticos
Se pueden utilizar varios procedimientos para analizar las composiciones estructurales y las longitudes de la cadena de azúcar de los glucoconjugados descritos en el presente documento.
La hidrazinolisis se puede utilizar para analizar polisacáridos. En primer lugar, los polisacáridos se liberan de sus portadores de proteínas mediante la incubación con hidracina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, Reino Unido). La hidracina nucleófila ataca el enlace glucosídico entre el polisacárido y la proteína transportadora y permite la liberación de los polisacáridos unidos. Los grupos N-acetilo se pierden durante este tratamiento y deben reconstituirse mediante la re-N-acetilación. Los polisacáridos libres se purifican en columnas de carbono y, posteriormente, se marcan en el extremo reductor con el fluoróforo 2-amino benzamida [48]. Los polisacáridos marcados se separan en una columna GlycoSep-N (GL Sciences) de acuerdo con el protocolo de HPLC de Royle y col. [49]. El cromatograma de fluorescencia resultante indica la longitud del polisacárido y el número de unidades que se repiten. La información estructural se puede recopilar mediante la recopilación de picos individuales y, posteriormente, realizar un análisis de MS/MS. De este modo, la composición de monosacáridos y la secuencia de la unidad de repetición se podrían confirmar y, además, se podría identificar la homogeneidad de la composición de polisacáridos. Los cromatogramas de HPLC obtenidos después de la hidrazinolisis y el marcaje con 2 AB se muestran en uno de los ejemplos (Figura 21). Los picos específicos de bajo peso molecular se pueden analizar mediante MALDI-MS/MS y el resultado se utiliza para confirmar la secuencia de polisacáridos. Cada pico corresponde a un polímero que consiste en un determinado número de unidades repetidas y fragmentos de las mismas. El cromatograma permite así medir la distribución de la longitud del polímero. El tiempo de elución es una indicación de la longitud del polímero, la intensidad de fluorescencia se correlaciona con la abundancia molar para el polímero respectivo.
Se puede utilizar SDS-PAGE o electroforesis en gel capilar para evaluar polisacáridos y glucoconjugados. La longitud del polímero para los polisacáridos del antígeno O que se sintetizan aquí se define mediante el número de unidades repetidas que se ensamblan linealmente. Esto significa que el patrón típico de escalera es una consecuencia de los diferentes números de unidades de repetición que componen el polisacárido. Por lo tanto, dos bandas una al lado de la otra en SDS PAGE u otras técnicas que se separan por tamaño difieren en una sola unidad de repetición. Estas diferencias discretas se aprovechan al analizar las glucoproteínas para determinar el tamaño del polisacárido: la proteína transportadora no glucosilada y el glucoconjugado con diferentes longitudes de cadena de polímero se separan de acuerdo con sus movilidades electroforéticas. Se miden el primer número de unidad de repetición detectable (n-i) y el número de unidad de repetición promedio (npromedio) presente en un glucoconjugado. Estos parámetros se pueden utilizar para demostrar la consistencia de lote a lote o la estabilidad de polisacárido.
Se podría aplicar una gran masa de MS y una HPLC de exclusión de tamaño para medir el tamaño de los glucoconjugados completos.
De puede utilizar un ensayo de antrona-ácido sulfúrico para medir los rendimientos de polisacáridos [50].
(a) Cambio en el uso del sitio de glucosilación
Para mostrar que el uso del sitio en una proteína específica se cambia en un sistema de tres plásmidos en lugar de un sistema insertado, se debe cuantificar el uso del sitio de glucosilación. Los procedimientos para hacerlo se enumeran a continuación.
Glucopéptido LC-MS/MS: los glucoconjugados se digieren con proteasa(s), y los péptidos se separan mediante un procedimiento cromatográfico adecuado (C18, HPLC HILIC de interacción hidrófila, columnas GlycoSepN, SE HPLC, AE HPLC) y se identifican los diferentes péptidos utilizando MS/MS. Este procedimiento se puede utilizar con o sin acortamiento previo de la cadena de azúcar mediante procedimientos químicos (degradación de Smith) o enzimáticos. La cuantificación de los picos de glucopéptidos utilizando la detección UV a 215 a 280 nm permite la determinación relativa del uso del sitio de glucosilación.
HPLC de exclusión de tamaño: un mayor uso del sitio de glucosilación se refleja en un tiempo de elución anterior de una columna de SE HPLC. Véase también (a).
(b) Homogeneidad
La homogeneidad del glucoconjugado (es decir, la homogeneidad de los restos de azúcares unidos) se puede evaluar utilizando procedimientos que miden la longitud del polisacárido y el radio hidrodinámico (véase más arriba y en la sección 5.3.5).
5.2.2 Otras posibles aplicaciones clínicas/prácticas
Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar para la construcción de cualquier célula hospedadora para lo cual es deseable introducir grandes fragmentos de ADN en el genoma de la célula hospedadora, en la que los fragmentos de ADN se mantienen durante la producción de la línea celular hospedadora que lleva el ADN de inserción (por ejemplo, la producción a gran escala de la línea celular hospedadora para producir un producto deseado, por ejemplo, una proteína codificada por el ADN de inserción). Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar para producir células hospedadoras que comprenden ADN de inserción que codifica, sin limitación, antibióticos, alcaloides, carotenoides, nicotinamida y otros metabolitos y cofactores secundarios que se sintetizan mediante múltiples reacciones enzimáticas dentro de la misma célula. Por consiguiente, en el presente documento se describen células hospedadoras que comprenden ADN insertado que codifica dichos componentes.
5.2.3 Mayor rendimiento de proteínas
Las cepas integradas pueden producir un mayor rendimiento de glucoconjugados debido a la reducción de la carga de selección de antibióticos en comparación con el sistema de tres plásmidos. Además, se produce una menor degradación proteolítica debido a la reducción de la carga metabólica de las células.
5.2.4 Mayor homogeneidad de proteínas
Las cepas integradas producen glucoconjugados con distribuciones de longitud de polisacáridos más cortas y menos extendidas. Por lo tanto, los glucoconjugados son más fáciles de caracterizar y están mejor definidos. Además, la inserción puede reducir la extensión del estrés periplásmico a las células, lo que puede conducir a una menor proteólisis del producto durante el proceso de fermentación debido a la carga reducida de selección de antibióticos en comparación con el sistema de tres plásmidos.
5.2.5 Mayor estabilidad de la cepa de producción
Los sistemas de glucosilación de proteínas requieren tres elementos recombinantes en el hospedador de producción: un ADN de expresión de proteína transportadora, un ADN de expresión de oligosacaril transferasa y un ADN de expresión de polisacárido. Los sistemas de producción bacteriana de la materia anterior contienen estos tres elementos en plásmidos. Por lo tanto, existe un riesgo de inestabilidad durante la fabricación debido a la pérdida de plásmidos, en particular porque los antibióticos utilizados para el mantenimiento de los plásmidos no deben estar presentes durante la fermentación del material GIMP. Dado que las cepas insertadas contienen aún un elemento móvil menos, son más estables durante muchas generaciones. Esto significa que las fermentaciones a mayor escala y los tiempos de incubación más largos (números de generación más altos) son más factibles. Además, la ausencia de un antibiótico para la selección hace que el producto sea más seguro, debido a la ausencia de antibióticos traza que pueden causar reacciones alérgicas en sujetos sensibles [4].
5.2.6 Mayor reproducibilidad del proceso de producción
Las cepas insertadas son más estables genéticamente debido a la inserción cromosómica fija, lo que conduce a una mayor reproducibilidad de los productos proteicos deseados durante el proceso de producción, por ejemplo, durante el cultivo de la célula hospedadora que comprende ADN heterólogo insertado.
5.2.7 Procedimientos analíticos para probar el beneficio
Rendimiento. El rendimiento se mide como la cantidad de carbohidratos procedente de un litro de cultivo de producción bacteriana crecido en un biorreactor en condiciones controladas y optimizadas. Después de la purificación del glucoconjugado, los rendimientos de carbohidratos se pueden medir directamente ya sea mediante el ensayo de antrona (véase, por ejemplo, la sección 5.2.1.7), o mediante ELISA utilizando un antisuero específico de carbohidratos. Las mediciones indirectas son posibles mediante la utilización de la cantidad de proteína (medida por los bien conocidos ensayos BCA, Lowry o Bradford) y la longitud y estructura del polisacárido para calcular una cantidad teórica de carbohidratos por gramo de proteína. Además, el rendimiento también se puede medir mediante el sacado de la preparación de glucoproteínas a partir de un tampón volátil y la utilización de una balanza para medir el peso.
Homogeneidad. Homogeneidad significa la variabilidad de la longitud del polisacárido y posiblemente el número de sitios de glucosilación. Los procedimientos enumerados anteriormente se pueden utilizar para este fin. SE-HPLC permite la medición del radio hidrodinámico. Un mayor número de sitios de glucosilación en el portador conduce a una mayor variación en el radio hidrodinámico en comparación con un portador con menos sitios de glucosilación. Sin embargo, cuando se analizan cadenas de polisacáridos individuales, pueden ser más homogéneas debido a la longitud más controlada. La longitud del polisacárido se mide mediante hidrazinolisis, SDS PAGE y CGE (véase la sección 5.1.2.7.). Además, la homogeneidad también puede significar que ciertos patrones de uso del sitio de glucosilación cambian a un intervalo más amplio/estrecho. Estos factores se pueden medir mediante glucopéptidos LC-MS/MS (véase la sección 5.1.2.7).
Estabilidad y reproducibilidad de la cepa. La estabilidad de la cepa durante la fermentación bacteriana en ausencia de presión selectiva se mide por procedimientos directos e indirectos que confirman la presencia o ausencia del ADN recombinante en células de cultivo de producción. La influencia del volumen del cultivo se puede simular mediante tiempos de cultivo alargados, lo que significa mayores tiempos de generación. Cuantas más generaciones en fermentación, más probable es que se pierda un elemento recombinante. La pérdida de un elemento recombinante se considera inestabilidad. Los procedimientos indirectos se basan en la asociación de casetes de selección con ADN recombinante, por ejemplo, los casetes de resistencia a antibióticos en un plásmido. Las células de cultivo de producción se colocan en placas sobre medios selectivos, por ejemplo, las placas LB complementadas con antibióticos u otros productos químicos relacionados con un sistema de selección, y las colonias resistentes se consideran positivas para el ADN recombinante asociado al producto químico de selección respectivo. En el caso de un sistema de tres plásmidos, se cuentan las colonias resistentes a los tres antibióticos y la proporción de células que contienen las tres resistencias se considera la población estable. Como alternativa, la PCR cuantitativa se puede utilizar para medir la cantidad de ADN recombinante de los tres elementos recombinantes en presencia, ausencia de selección y en diferentes momentos de fermentación. Por lo tanto, la cantidad relativa y absoluta de ADN recombinante se mide y se compara. La reproducibilidad del proceso de producción se mide mediante el análisis completo de los lotes de consistencia mediante los procedimientos establecidos en esta aplicación.
5.3 Composiciones
5.3.1 Composiciones que comprenden los plásmidos
En el presente documento se describen composiciones que comprenden uno o más de los plásmidos descritos en el presente documento, por ejemplo, uno o más plásmidos donantes o auxiliares.
En el presente documento se describe una composición que comprende un plásmido donante, en la que dicho plásmido donante comprende (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserción heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contraselección.
En el presente documento se describe una composición que comprende un plásmido auxiliar, en la que dicho plásmido auxiliar comprende (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la lambda red recombinasa; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora.
En el presente documento se describe además una composición que comprende un plásmido donante y un plásmido auxiliar, en la que dicho plásmido donante comprende (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserción heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contraselección; y en la que dicho plásmido auxiliar comprende (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la lambda red recombinasa; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora.
5.3.2 Composiciones que comprenden células hospedadoras
En el presente documento se describen composiciones que comprenden las células hospedadoras descritas en el presente documento. Dichas composiciones se pueden utilizar en procedimientos para generar las vacunas conjugadas descritas en el presente documento, por ejemplo, las composiciones se pueden cultivar en condiciones adecuadas para la producción de proteínas. Posteriormente, los bioconjugados se pueden aislar de dichas composiciones.
Las composiciones que comprenden las células hospedadoras descritas en el presente documento pueden comprender componentes adicionales adecuados para el mantenimiento y la supervivencia de las células hospedadoras descritas en el presente documento, y pueden comprender adicionalmente componentes adicionales requeridos o beneficiosos para la producción de proteínas por parte de las células hospedadoras, por ejemplo, inductores para promotores inducibles, tales como arabinosa, IPTG.
5.3.3 Composiciones inmunogénicas
5.3.3.1 Composiciones que comprenden proteínas glucosiladas
En el presente documento se describen composiciones inmunogénicas que comprenden uno o más glucoconjugados producidos por una célula hospedadora generada mediante los procedimientos de inserción de ADN descritos en el presente documento. Dichos glucoconjugados pueden comprender un polisacárido de antígeno O unido a una secuencia de consenso de glucosilación codificada dentro de una proteína, por ejemplo, una proteína transportadora. La proteína transportadora puede ser una exotoxina A que comprende uno o más sitios de glucosilación introducidos, o la proteína transportadora puede ser FimCH y que comprende uno o más sitios de glucosilación introducidos. Como alternativa, la proteína transportadora puede comprender un antígeno de proteína de E. coli que comprende uno o más sitios de glucosilación introducidos. Más específicamente los antígenos O son antígenos O de E. coli de aislados patógenos de E. coli, por ejemplo, 01, O2, O4, O7, O8, O9, O11, O15, O16, O17, O18; O20, O22, O25, O73, 075 o O83.
Como alternativa, una composición inmunogénica proporcionada en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la sección 5.2.1.2) conjugada con un antígeno descrito en el presente documento, por ejemplo, un antígeno descrito en la sección 5.21.1. Específicamente, la proteína transportadora es EPA. Como alternativa, el antígeno es un antígeno de E. coli, por ejemplo, un polisacárido de E. coli.
Como alternativa, una composición inmunogénica descrita en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por el antígeno O de E. coli del serotipo 01 (O1-EPA).
Como alternativa, una composición inmunogénica descrita en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por el antígeno O de E. coli del serotipo O2 (O2-FPA).
Como alternativa, una composición inmunogénica descrita en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por el antígeno O de E. coli del serotipo O6 (O6-FPA).
Como alternativa, una composición inmunogénica descrita en el presente documento comprende una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por un antígeno O de E. coli del serotipo O1, O2, O4, O7, O8, O9, O11, O15, O16, O17, O18; O20, O22, O25, O73, 075 o O83.
Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se pueden utilizar para provocar una respuesta inmunitaria en un hospedador al que se administra la composición. Por lo tanto, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se pueden utilizar como vacunas y, por consiguiente, se pueden formular como composiciones farmacéuticas. Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se usan en la prevención de la infección de sujetos (por ejemplo, sujetos humanos) por E. coli. Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se usan como una vacuna contra una infección del tracto urinario causada por una infección de E. coli.
Por ejemplo, una composición inmunogénica descrita en el presente documento para su uso como una vacuna contra una infección del tracto urinario causada por una infección de E. coli puede comprender una proteína transportadora (por ejemplo, una proteína transportadora descrita en la sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por un antígeno de E. coli (por ejemplo, un antígeno de E. coli descrito en la sección 5.2.1.1). Específicamente, el antígeno de E. coli es un antígeno O de serotipo O1, O2, O4, O7, O8, O9, O11, O15, O16, O17, O18; O20, O22, O25, O73, 075 o O83.
Como alternativa las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se usan en la prevención de la infección de sujetos (por ejemplo, sujetos humanos) por Pseudomonas. Como alternativa, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se usan en la prevención de la infección de sujetos (por ejemplo, sujetos humanos) por Shigella.
Las composiciones que comprenden los bioconjugados descritos en el presente documento pueden comprender cualquier componente adicional adecuado para su uso en administración farmacéutica. Específicamente, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento son formulaciones monovalentes. Como alternativa, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento son formulaciones multivalentes. Por ejemplo, una formulación multivalente comprende más de un bioconjugado descrito en el presente documento.
Las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente un conservante, por ejemplo, el timerosal derivado de mercurio. Específicamente, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden de 0,001 % a 0,01 % de timerosal. Como alternativa, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden un conservante.
Las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, las composiciones inmunogénicas) comprenden, o se administran en combinación con, un adyuvante. El adyuvante para administración en combinación con una composición descrita en el presente documento puede administrarse antes, concomitantemente con, o después de la administración de dicha composición. El término "adyuvante" se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con o como parte de una composición descrita en el presente documento aumenta, mejora y/o impulsa la respuesta inmunitaria a un bioconjugado, pero cuando el compuesto se administra solo no genera una respuesta inmunitaria al bioconjugado. El adyuvante genera una respuesta inmunitaria al péptido poli bioconjugado y no produce una alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden mejorar la respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos, incluyendo, por ejemplo, el reclutamiento de linfocitos, la estimulación de linfocitos B y/o T, y la estimulación de macrófagos. Los ejemplos específicos de adyuvantes incluyen, pero sin limitación, sales de aluminio (alumbre) (como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), lípido A monofosforilo (MPL) 3 des-O-acilado (véase Patente del Reino Unido GB2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase Solicitud Internacional n.° PCT/US2007/064857, publicada como Publicación Internacional n.° WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase Solicitud Internacional n.° PCT/US2007/064858, publicada como Publicación Internacional n.° WO2007/109813) y saponinas, tales como QS21 (véase Kensil y col., en Vaccine Desing: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); la patente de Estados Unidos n.° 5.057.540). Por ejemplo, el adyuvante es el adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (como el escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, como el lípido A monofosforilo (véase Stoute y col., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998).
5.4 Procedimientos de tratamiento e inmunización
En el presente documento se describen procedimientos para tratar una infección en un sujeto que comprende administrar al sujeto un glucoconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo. Específicamente, un procedimiento para tratar una infección descrita en el presente documento comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un glucoconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo.
En el presente documento se describen procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto un glucoconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo. Más específicamente, un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria a un glucoconjugado descrito en el presente documento comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un bioconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo.
En el presente documento se describen procedimientos para generar anticuerpos monoclonales para prevenir infecciones utilizando el bioconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo.
Específicamente, los sujetos a los que se administra un glucoconjugado o una composición del mismo tienen, o son susceptibles a, una infección, por ejemplo, una infección bacteriana. Más específicamente, los sujetos a los que se administra un bioconjugado o una composición del mismo están infectados con, o son susceptibles a la infección con E. coli.
6 Ejemplos
6.1 Ejemplo 1: Construcción de cepa para la producción de conjugado de antígeno O O1 de E. coli
La primera etapa para la inserción es la clonación del grupo rfb de 01 en el plásmido donante pDOC mediante técnicas estándar de clonación molecular [1]. La región del grupo rfb de 01 se clonó en el plásmido pLAFR1 para confirmar la actividad (A, a continuación) y en paralelo en el plásmido donante pDOC para insertar el grupo 01 en el genoma (B, a continuación).
A. El grupo rfb de 01 y sus regiones flanqueantes de 1,5 kb se subclonaron en el vector cósmido pLAFR1 (GenBank: AY532632.1). El grupo 01 se amplificó mediante PCR a partir de ADN cromosómico de un aislado clínico llamado upecGVXN032 (StGVXN3736) utilizando los oligonucleótidos 2193/2161 (véase la tabla 3). Los oligonucleótidos 2193/2161 se hibridan en los genes que flanquean el grupo rfb de 01, es decir, en galF y después de gnd. El producto de la PCR se clonó en los sitios SgsI de p157. p157 es un pLAFR1 que contiene un casete compuesto por dos oligonucleótidos complementarios (300/301) que se clonaron en el sitio EcoRI dando como resultado p947. Utilizando p947 como plantilla, se realizó una PCR para amplificar el ADN del grupo rfb de 01 desde la región flanqueante en el extremo 5' (galF) hasta el final del último gen (wekO) en el grupo utilizando los oligonucleótidos 2198/2166 (véase la figura 3). El producto se clonó en sitios BamHI/SgsI de p967 dando como resultado p985. p967 se clonó a partir de pDOC-C (GenBank: GQ889494.1) y contenía un casete MCS y kanR (para detalles, véase la sección 6.2). p985 se utilizó como plantilla para la PCR del grupo rfb de 01 para una inserción adicional en p562 (véase a continuación).
B. p562 se preparó de la siguiente manera: se generó un inserto resultante de una PCR de ensamblaje utilizando dos productos de PCR y los oligonucleótidos 1187/1188 (véase la tabla 3). Se generó un producto de PCR a partir de pKD3 (GenBank: AY048742.1) utilizando los oligonucleótidos 1188/1189 (véase la tabla 3; que codifica un casete clmR y sitios FRT) y otro fue la región de homología en 3' procedente de la PCR del ADN genómico de W3110 con los oligonucleótidos 1186/1187 (véase la tabla 3; es decir, el ADN cadena abajo del grupo rfb de 016 en el genoma de W3110 que codifica la región intergén y el gen gnd). El ADN ensamblado se cortó utilizando BamHI/EcoRI y se clonó en los mismos sitios en pDOC-C, dando como resultado p482. Un producto de PCR de la región de homología en 5' (que codifica parte del gen galF indicado como galF', y la región intergén entre galF y el primer gen de 016) se generó luego utilizando el ADN cromosómico de W3110 y los oligonucleótidos 1171/1515, cortados con BamHI y SpeI y clonados en los sitios SpeI/BamHI de p482, dando como resultado p562.
p562 codifica las regiones de homología en 5' y 3' (en 5': 1 kb cadena arriba de rmlB del grupo rfb de 016; en 3': 1,6 kb de ADN cadena abajo del último gen en el grupo rfb de 016) con un MCS y un casete de resistencia de clmR invertido en medio. El MCS se utilizó para insertar el grupo rfb de 01 amplificado de p985 utilizando los oligonucleótidos 2214/2215. El plásmido p1003 resultante fue el plásmido donante para la inserción del grupo rfb de 01 y contenía los elementos como se ilustra en la figura 3 A y la tabla 1.
Inserción y selección: el plásmido auxiliar p999 (GenBank: GU327533.1) se introdujo en las células W3110 mediante electroporación. Debido al fenotipo de replicación sensible a la temperatura de p999, las células resultantes se cultivaron a 30 °C en todo momento en LB complementado con espectinomicina para la selección de p999. En una etapa siguiente, se introdujo p1003 en células W3110 que contenían p999 mediante electroporación. Las células se seleccionaron para la resistencia a ampicilina y espectinomicina en medio LB a 30 °C. Los plásmidos se insertaron en las células aceptoras para permitir la expresión de las enzimas codificadas en el plásmido auxiliar en presencia del ADN del plásmido donante dentro de la misma célula.
A continuación, se realizó el procedimiento de inserción. La cepa recién transformada se cultivó en medio LB en presencia de ampicilina y especticomicina a 30 °C a escala de 5 ml durante la noche a 180 rpm. Se transfirieron 10 pl del cultivo denso a un nuevo tubo que contenía 1 ml de LB complementado con spec y amp. El nuevo cultivo se cultivó luego a 180 rpm durante 2 horas a 30 °C, se centrifugaron las células a 5000 rpm durante 5 minutos a 4°C y el sobrenadante se reemplazó por medio LB complementado con spec, arabinosa al 0,2% (w/v) e IPTG 1 mM. La composición de medios admite la selección de plásmidos auxiliares y la expresión de la endonucleasa recombinasa y Scel para permitir la inserción. Las células se resuspendieron y se incubaron adicionalmente a 30 °C durante 4-18 horas a 180 rpm.
En diferentes momentos después del cambio de medio, se colocaron 0,5 ml del cultivo en placas LB complementadas con clm (para la selección del inserto de ADN) y sacarosa al 10 % (p/v) (para contraseleccionar contra el plásmido donante) y se incubaron a 37 °C durante la noche (para seleccionar la pérdida del plásmido auxiliar sensible a la temperatura).
Para rastrear las colonias resultantes para el fenotipo de inserción correcto, las células se replicaron en placas de LB complementadas con spec, amp o clm. Las colonias resistentes a clm (para la presencia del inserto), pero sensibles a amp y spec (para la ausencia del plásmido donante y auxiliar) se analizaron adicionalmente para la inserción.
Para confirmar que la cepa perdió el ADN reemplazado que se origina en W3110 y contenía el inserto de ADN, se realizó una PCR de colonias. Las colonias candidatas con el fenotipo correcto (sensibilidad a la ampicilina, resistencia al cloranfenicol, sensibilidad a espectinomicina, resistencia a sacarosa) se seleccionaron y se sometieron a una prueba de PCR de colonias. Se utilizó una estrategia de PCR [51] para la identificación de serotipos O en cepas de E. coli extraintestinales (ExPEC). Se utilizaron pares de oligonucleótidos específicos para secuencias genéticas únicas presentes en los grupos rfb de los 14 serotipos O de ExPEC comunes. En el caso de la inserción de 01, se utilizaron oligonucleótidos que amplificaban partes de wzx de 01 (2241 y 2242) u 016. Se verificaron varios clones. La inserción exitosa se confirmó en algunos clones por la ausencia de un producto de PCR con los oligonucleótidos específicos de 016 (no mostrado), y la presencia de una señal específica con los oligonucleótidos de 01 (Figura 3 B). Las cepas resultantes se designaron W3110 ArfbO16::rfbO1-clmR.
En una etapa siguiente, el casete clmR se eliminó del ADN que se insertó junto con el grupo rfb de O1 mediante la utilización del plásmido pCP20 sensible a la temperatura que expresa la recombinasa FLP como se informó [35]. Las células resultantes se analizaron para determinar la sensibilidad a clm y luego se analizaron más. Las cepas resultantes se designaron W3110 ArjbO16::rfbO1.
Además, la ligasa del antígeno O (waaL) de la cepa de producción se eliminó para la producción óptima de glucoconjugado. Esto se realizó mediante transducción de fagos. El fago P1vir (centro de inventario genético de E. coli n.° 12133) se utilizó para generar lisado a partir de una cepa W3110 AwaaL::clmR en la que el gen waaL se reemplazó por un casete clmR amplificado mediante PCR de pKD3 utilizando los oligonucleótidos 623 y 624)) [13, 52]. La transducción de fagos se realizó en W3110 ArfbO16::rfbO1 y las cepas resultantes se designaron como W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL::clmR. Posteriormente, el casete resistente al cloranfenicol se eliminó mediante recombinación conducida por FLP (W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL).
En cada etapa de ingeniería recombinante y selección, se realizó una prueba de PCR para detectar la presencia de wzx de 01 para confirmar la presencia del grupo rfb de 01 (Figura 3 B). Se pueden realizar pruebas de PCR adicionales con oligonucleótidos que amplifican específicamente las regiones recombinadas en los extremos 5' y 3' de la inserción, es decir, pares que se hibridan fuera de las regiones HR1 y 2 ('PCR de la región de transición en 5' y 3''). Por ejemplo, se puede generar un oligonucleótido de PCR para hibridarse en el genoma de W3110, y el otro para hibridarse en el inserto de ADN. Por lo tanto, las señales de PCR positivas solo son posibles si la inserción es exitosa. Los productos de la PCR resultantes se pueden secuenciar luego para confirmar la ligadura del ADN de la cepa del aceptor cromosómico e inserto de ADN. Además, la PCR y la secuenciación se pueden utilizar para confirmar las modificaciones de la eliminación del casete de clmR y la transducción de fagos.
Para confirmar la actividad del ADN insertado, la producción de glucolípidos de las cepas insertadas que contienen el polisacárido del antígeno 01 se probó en diferentes etapas de la construcción de la cepa. Los clones candidatos del experimento de inserción inicial se seleccionaron de acuerdo con los resultados positivos de la preselección con antibióticos y el fenotipo de sensibilidad a sacarosa y las pruebas de PCR. Las células se cultivaron durante la noche en medio l B y se prepararon extractos de células enteras. Para analizar los glucolípidos producidos, los extractos se trataron con proteinasa K para eliminar las posibles interferencias de las proteínas. Las muestras resultantes se procesaron en SDS PAGE y se tiñeron mediante tinción con plata o se detectaron mediante inmunotinción utilizando antisueros específicos anti 01 después de la transferencia a membranas de nitrocelulosa. Cuando se analizaron extractos de posibles integrantes mediante tinción con plata, se observó un patrón tipo escala entre 25 y 55 kDa indicativo de LPS (Figura 4 A, panel superior, carriles 1, 2), como en la cepa de control (carril 3). La transferencia de Western mostró señales similares a una escala en el mismo intervalo de peso molecular que confirman que el LPS contenía antígeno 01 (Figura 4 A, parte inferior, carriles 1, 2) como el LPS de control que se origina a partir de un aislado clínico de 01 (carril 3). Estos resultados confirman la producción de antígeno 01 mostrada en el lípido A en W3110 ArfbO16::rfbO1 -clmR.
Las cepas W3110 ArfbO16::rfbO1 se probaron nuevamente (después de retirar el casete clmR) mediante transferencia de Western (Figura 4 B, carriles 1,2) para confirmar la producción de LPS de 01 a pesar de la modificación. Para confirmar la eliminación de waaL mediante la transducción de fagos en las cepas W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL::cat, se analizó nuevamente la producción de LPS (Figura 4 C, carril 1). La señal tipo escala desapareció del ensayo de tinción con plata (arriba) como se esperaba. El análisis de transferencia de Western todavía detectó una señal tipo escala (carril 1, parte inferior), aunque con una intensidad menor que la cepa de control (W3110 ArfbO16::rfbO1) que aún contenía el gen waaL (carril 2) y fue capaz de hacer LPS como se visualiza mediante la tinción con plata. La señal más débil se origina en el antígeno O de 01 unido a Und-PP, que no se puede transferir al lípido A debido a la eliminación del gen waaL. Esto significa que la eliminación de waaL mediante transducción de fagos ocurrió como se esperaba, confirmando el genotipo W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL: :cat. Los clones seleccionados se eligieron para la eliminación del casete clmR de la misma manera que por la recombinación de transmisión por FLP. Los clones resultantes (W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL) se analizaron mediante tinción con plata y transferencia de Western (Figura 4 D) y mostraron un fenotipo comparable al observado en la figura 4 D, carril 1).
La cepa final W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL se caracterizó mediante procedimientos adicionales. Para confirmar la producción de antígeno O en Und-PP por parte de esas células, se utilizó un procedimiento que permite la caracterización molecular de los oligosacáridos unidos a lípidos (antígenos O unidos a Und-PP) mediante marcaje fluorescente con 2 AB seguido de HPLC y MS/MS. W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL y una cepa de control (W3110 AwaaL) se hicieron crecer durante la noche en un matraz de agitación a 37 °C. Se recogieron células equivalentes a una DO600 de 400 y se lavaron una vez con NaCl al 0,9 %. Los sedimentos celulares lavados se liofilizaron. Los lípidos se extrajeron de las células secas con metanol al 95 % (MeOH) mediante repetidas rondas de agitación e incubación en hielo durante 10 min. La suspensión se convirtió en MeOH al 85 % mediante la adición de ddH2O y se incubó adicionalmente durante 10 minutos en hielo mientras se agitaba regularmente. Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante y se secó el extracto bajo N2. Los lípidos secos se disolvieron en 1:1 (v/v) de metanol/agua (M/A) y se sometieron a un cartucho SepPak C18 (Waters Corp., Milford, MA). El cartucho se acondicionó con 10 ml de MeOH, seguido de un equilibrio con 10 ml de TBAP 10 mM en 1:1 M/A Después de cargar la muestra, el cartucho se lavó con 10 ml de TBAP 10 mM en 1:1 M/A y se eluyó con 5 ml de MeOH seguido de 5 ml de cloroformo/metanol/agua 10:10:3 (C/M/A). Las eluciones combinadas se secaron bajo N2.
La muestra de lípidos se hidrolizó mediante la disolución de las muestras secas en 2 ml de ácido trifluoroacético (TFA) 1 M en n-propanol al 50 % y mediante el calentamiento a 50 °C durante 15 min. La muestra hidrolizada se secó bajo N2, se disolvió en 4 ml 3:48:47 C/M/A y se sometió a un cartucho SepPak C18 para separar los lípidos de los polisacáridos hidrolizados. El cartucho se acondicionó con 10 ml de MeOH, seguido de un equilibrio con 10 ml 3:48:47 C/M/A. La muestra se aplicó al cartucho y se recogió el flujo continuo. El cartucho se lavó con 4 ml 3:48:47 C/M/A y los flujos continuos combinados se secaron utilizando un SpeedVac.
Las muestras secas se marcaron con 2-aminobenzamida (2 AB) de acuerdo con Bigge y col. [48]. La limpieza del polisacárido se realizó utilizando el procedimiento del disco de papel como se describe en Merry y col. [53]. La separación de polisacáridos marcados con 2 AB se realizó mediante HPLC utilizando una columna de fase normal GlycoSep N de acuerdo con Royle y col. [49], pero modificado a un sistema de tres disolventes. Disolvente A: formiato de amonio 10 mM, pH 4,4 en acetonitrilo al 80 %. Disolvente B: formiato de amonio 30 mM, pH 4,4 en acetonitrilo al 40 %. Disolvente C: ácido fórmico al 0,5 %. La temperatura de la columna fue de 30 °C y se detectaron polisacáridos marcados con 2 AB mediante fluorescencia (Aex = 330 nm, Aem= 420 nm). Condiciones de gradiente: Un gradiente lineal de A al 100 % a B al 100 % durante 160 min a un caudal de 0,4 ml min-1, seguido de 2 min de B al 100 % a C al 100 %, retornando a A al 100 % durante 2 min y en funcionamiento durante 15 min a A al 100 % a un caudal de 1 ml min-1, luego devolviendo el caudal a 0,4 ml min-1 durante 5 min. Las muestras fueron inyectadas en ddH2O.
Para identificar los polisacáridos específicos del antígeno O, se comparó el perfil de polisacárido 2 AB de las células de control con el perfil obtenido de W3110 ArjbO16::rfbO1 AwaaL (Figura 5 A). Los picos específicos de W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL se recolectaron y se analizaron los polisacáridos 2 AB en un sistema MALDI SYNAPT HDMS Q-TOF (Waters Corp., Milford, MA) (Figura 5 B). Las muestras se disolvieron en acetonitrilo/agua 5:95 y se mancharon 1:1 con 20 mg ml-1 de DHB en metanol/agua 80:20. La calibración se realizó con PEG (solución de mezcla preparada, Waters Corp., Milford, MA), manchado con 1:3 con 5 mg ml-1 de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA, SigmaAldrich, Suiza) en 60:40:0,1 de acetonitrilo/agua/ácido trifluoroacético. El instrumento estaba equipado con un láser UV de estado sólido de 200 Hz. Los espectros de masas se registraron en modo de ion positivo. Para MSMS: la energía del láser se fijó en 240 a una velocidad de disparo de 200 Hz, el gas de colisión era argón, se utilizó un perfil de energía de colisión para aumentar la energía de colisión en función de la m/z. Todos los espectros se combinaron, se restaron de fondo, se suavizaron (Savitzsky Golay) y se centraron utilizando el software MassLynx v4.0 (Waters Corp., Milford, MA). El procedimiento también se describe en el documento US2011/0274720 A1.
Las series de iones de fragmentación procedentes de varios de los picos específicos de W3110 ArjbO16::rfbO1 AwaaL (Figura 5B) mediante MALDI-TOF/t Of fueron consistentes con la secuencia de monosacáridos informada para el subserotipo O1A de E. coli [54]. Por lo tanto, se confirmó la construcción de un antígeno O O1A que produce la cepa de E. coli basada en W 31l0 adecuada para la formación de glucoconjugado.
Para mostrar la producción del glucoconjugado O1A por esta cepa, los plásmidos que codifican la expresión inducible de oligosacaril transferasa PglB de C. jejuni (cinco variantes diferentes, véase a continuación) y la proteína transportadora Exotoxina A de P. aeruginosa (que codifica 4 secuencias de consenso de glucosilación, p659) fueron introducidos mediante electroporación en W3110 ArjbO16::rfbO1 AwaaL. Las células de producción se inocularon en medio LB complementado con mgCh 5 mM, spec y amp, y se cultivaron durante la noche a 37 °C en fase estacionaria. Luego, las células se diluyeron a una DO600 de 0,05 y se cultivaron hasta una DO600 de 0,8 en TB que contenía spec y amp. La expresión de EPA y PglB se inició mediante la adición de arabinosa al 0,2 % e IPTG 1 mM y el cultivo creció durante otras 20 horas. Las células se recogieron mediante centrifugación y se prepararon extractos de células periplásmicas utilizando el procedimiento de lisozima [55]. Los extractos periplásmicos (normalizados a DO600) se separaron mediante SDS PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia después de la electrotransferencia (Figura 6). La detección con el antisuero antiEPA (panel izquierdo) y el antisuero anti 0 l (panel derecho) muestran un patrón tipo escala clara entre 100 a 130 kDa para todas las muestras, lo que es muy indicativo de glucoproteínas que consisten en la proteína EPA y el polisacárido 01. La señal obtenida con el antisuero de EPA solo (por encima de 70 kDa) corresponde a EPA no glucosilado. Es evidente que las diferentes variantes de PglB conducen a diferentes productividades específicas de las glucoproteínas: el rendimiento más pequeño se obtuvo con el PglB correspondiente a la secuencia original de la proteína de tipo silvestre de C. jejuni que contiene un marcador HA en el extremo C (p114, [9]). La optimización de codones solo (p939), la optimización de codones y la eliminación del marcador HA (p970), la optimización de codones y la mutación del sitio de glucosilación natural PglB a N534Q (p948), y la optimización de codones, la eliminación del marcador HA y la eliminación del sitio de glucosilación natural PglB (p971) conducen a señales más fuertes indicativas de rendimientos varias veces mayores. Los rendimientos más altos pueden explicarse por las formas más eficaces de traducción de PglB cuando se usa un gen optimizado con codones, y que el marcador HA del extremo C dificulta la actividad o el plegamiento de la proteína PglB.
Las glucoproteínas se pueden producir por la cepa insertada en un biorreactor a escala 101 para la purificación preparativa de glucoconjugados altamente puros que exhiben longitudes de polisacárido más cortas como se observa con un sistema de tres plásmidos. La electroforesis en gel capilar se puede utilizar para analizar la pureza y el tamaño de los glucoconjugados. Por ejemplo, los polisacáridos unidos a los glucoconjugados se pueden eliminar de la proteína mediante hidrazinolisis y analizar mediante el marcado con 2 AB y HPLC-Ms /MS para el análisis de la estructura y longitud del polisacárido. Dicho análisis se puede utilizar para confirmar la unión del antígeno O O1A al portador de la glucoproteína. Además, el análisis de PMP se puede realizar para la determinación de la composición de monosacáridos, análisis de NMR y cromatografía de gases para la confirmación de la estructura. Además, se puede realizar la inmunización de animales para aumentar los anticuerpos contra el polisacárido y la proteína transportadora. La actividad antiinfecciosa se puede mostrar mediante el uso de ensayos preclínicos, como los ensayos de mortalidad opsonofagocítica y/o la protección pasiva.
6.2 Ejemplo 2: Construcción de cepa para la producción de conjugado de antígeno O O2 de E. coli
La construcción de la cepa se realizó de forma similar al Ejemplo 1. El grupo rfb de O2 se clonó en un plásmido pDOC que consta de las regiones HR y un casete como se detalla en la tabla 1. El grupo rfb de O2 se amplificó a partir del aislamiento clínico upecGVXN116 (StGVXN3949) con los oligos 2207/2166 y se clonó en los sitios BamHI/SgsI de p967. El amplicón rfb de O2 contenía todas las secuencias desde galF hasta wekR. El ADN entre wekR y gnd se omitió en el inserto de ADN. p967 se clonó mediante la inserción de un oligocasete compuesto por dos oligonucleótidos parcialmente complementarios (2167/2168) en los sitios Xhol y BamHI de p946. p946 se obtuvo mediante la digestión de p843 con AscI, el tratamiento del plásmido linealizado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para rellenar los extremos del sitio de restricción cohesivo y la religación consecutiva del plásmido. Se generó p843 mediante la clonación de un amplicón de PCR procedente de pKD4 [13] utilizando los oligonucleótidos 2066 y 2068 (véase la tabla 3) en los sitios BamHI y SgsI de p482 utilizando las mismas enzimas. El plásmido donante resultante p1003 contenía la región HR1 cadena arriba y el grupo rfb del upecGVXN116, seguido de un casete kanR extraíble y seguido de la región HR2 (Figura 7).
El plásmido auxiliar p999 (GenBank: GU327533.1) se introdujo en las células W3110 mediante electroporación [1]. Se mezclaron 5-500 ng de ADN en agua con 50 pl de suspensión de células electrocompetentes en una cubeta de electroporación estándar en hielo y se sometieron a electroporación en un micro pulsador BioRad (BioRad, Hercules, CA) a un voltaje de 1,8 kV durante 2-10 ms. Debido al fenotipo de replicación sensible a la temperatura de p999, las células resultantes se sembraron en placas y se cultivaron a 30 °C en todo momento. En una etapa siguiente, se fabricaron células competentes mediante el cultivo de W3110 que contenía p999 en LB complementado con espectinomicina para la selección de p999 a 30 °C, y p1003 se introdujo en las células mediante electroporación, y las células se seleccionaron para la resistencia a ampicilina y espectinomicina en placas de LB a 30 °C. Los plásmidos se insertaron en las células aceptoras para permitir la expresión de las enzimas codificadas en el plásmido auxiliar en presencia del ADN del plásmido donante dentro de la misma célula.
La cepa recién transformada se cultivó en medio LB en presencia de ampicilina y especticomicina a 30 °C a escala de 5 ml durante la noche a 180 rpm. Se transfirieron 10 pl del cultivo a un nuevo tubo que contenía 1 ml de LB líquido complementado con spec y amp. El nuevo cultivo se cultivó luego a 180 rpm durante 2 horas a 30 °C. Luego, las células se centrifugan a 5000 rpm durante 5 minutos a 4 °C, el sobrenadante descartado y el medio LB complementado con espectinomicina, arabinosa al 0,2 % (p/v) e IPTG 1 mM se agregaron para apoyar la selección del plásmido auxiliar (Spec) y la expresión de recombinasa (arabinosa) y endonucleasa Scel (IPTG). Las células resuspendidas se incubaron adicionalmente a 30 °C durante 4-18 horas a 180 rpm.
En diferentes momentos de 4 a 18 horas después del cambio de medio, se colocaron en placas 0,5 ml del cultivo en LB complementado con kan (para la selección del inserto de ADN) y sacarosa al 10 % (p/v) (para contraseleccionar contra el plásmido donante) y se incubaron a 37 °C durante la noche (para seleccionar la pérdida del plásmido auxiliar sensible a la temperatura).
Para rastrear las colonias resultantes para el fenotipo de inserción correcto, las células se replicaron en placas de LB complementadas con spec, amp, o kan. Las colonias resistentes a kan (para la presencia del inserto), pero sensibles a amp y spec (para la ausencia del plásmido donante y auxiliar) se analizaron adicionalmente para la inserción.
En una etapa siguiente, el gen waaL fue interrumpido por la transducción de fagos como se describe anteriormente. La cepa resultante de la transducción de fagos se seleccionó por la resistencia de clm (eliminación de waaL) y kan (inserción de grupo rfb de O2), dando como resultado el genotipo W3110 ArfbO16::rfbO2-kanR AwaaL::cat.
Los casetes de resistencia a antibióticos para kan (de la inserción del grupo rfb) y clm (eliminación de waaL) se eliminaron en una sola etapa mediante recombinación dirigida por recombinasa FLP utilizando pCP20 como se describe [35].
La inserción del inserto de ADN se probó mediante PCR para determinar la ausencia de wzx de 016 y la presencia de wzy de O2 utilizando los oligonucleótidos 2243 y 2244 publicados anteriormente (Figura 7 A). [51]. Un análisis adicional puede incluir la secuenciación y la PCR de la región de transición en 5' y 3'. La eliminación de waaL se probó mediante un procedimiento de PCR de colonias utilizando los oligonucleótidos 1114 y 1326 (véase la tabla 3) que se hibridan en la región del ADN que flanquea el gen waaL (Figura 7B). Un producto de PCR es más grande que 1,5 kb con estos oligonucleótidos cuando una copia intacta de waaL está presente (en los carriles 1 y 5), ligeramente más pequeña (por debajo de 1,5 kb, carriles 2 y 6) si waaL se reemplaza por el casete clmR, y después de la eliminación en el casete clmR, el amplicón de PCR tiene un tamaño de aproximadamente 0,5 kb (Figura 7 B). Por consiguiente, la eliminación de waaL fue exitosa. La cepa final (W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL) se puede probar mediante PCR de región de transición en 5' y 3'.
Para confirmar los fenotipos de producción de antígeno O durante la construcción de la cepa (Figura 8) se utilizaron análisis de tinción con plata y transferencia de Western utilizando sueros tipográficos de O2 de muestras de LPS. Cuando se probó con antisuero anti O2, se detectó una escala en extractos del posible integrante (W3110 ArfbO16::O2-kanR,, A, carril 1), así como en la cepa de control positivo, un aislado clínico de O2 de E. coli (carril 2). Esto sugirió que el integrante contenía un grupo activo rfb de O2. La cepa final (W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL) se analizó para determinar la producción de antígeno de LPS y Und-PPO mediante tinción con plata (Figura 8 B, panel izquierdo) y transferencia de Western (Figura 8 B, panel derecho). Mientras que la cepa positiva de waaL produjo LPS como se visualizó mediante la tinción con plata con una señal tipo escala (carril 2), la señal estuvo ausente después de la eliminación de waaL y la eliminación de casetes de antibióticos (carril 1). La transferencia de Western (panel B) mostró un patrón tipo escala en ambas muestras, aunque con una intensidad mucho menor en la cepa eliminada por waaL. Esto indica que, efectivamente, la cepa eliminada por waaL produjo un polisacárido reactivo O2 unido a Und-PP.
Para confirmar la producción de antígeno O en Und-PP por parte de esas células, se utilizaron los procedimientos de marcaje 2 AB descritos anteriormente (sección 6.2). Las señales específicas para W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL se observaron cuando las trazas fluorescentes se compararon con una cepa que es incapaz de producir el antígeno O. Los tiempos de elución de picos específicos fueron consistentes con las unidades de repetición de O2 identificadas previamente según lo analizado mediante MALDI MS/MS (Figura 9A). Las series de iones de fragmentación de varios picos recolectados se analizaron mediante MALDI-TOF/TOF como se describió anteriormente. Los patrones de fragmentación son consistentes con la unidad de repetición de antígeno O de O2 (Figura 9 B). Por lo tanto, se confirmó la construcción de un antígeno O de O2 que produce la cepa de E. coli W3110 basada en W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL.
Para mostrar la producción del glucoconjugado O2 mediante W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL, los plásmidos para la expresión inducible de la oligosacaril transferasa PglB de C. jejuni (dos variantes diferentes) y la proteína transportadora EPA (que codifica 4 secuencias de consenso de glucosilación, p659) se introdujeron en W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL mediante electroporación. Las células se inocularon en medio LB complementado con mgCh 5 mM, spec y amp, y se cultivaron durante la noche a 37 °C en fase estacionaria. Luego, las células se diluyeron a una DO600 de 0,05 y se cultivaron hasta una DO600 de 0,8 en TB que contenía spec y amp. La expresión de EPA y PglB se inició mediante la adición de arabinosa al 0,2 % e IPTG 1 mM y el cultivo creció durante otras 20 horas. Las células se recogieron mediante centrifugación y se prepararon extractos de células periplásmicas utilizando el procedimiento de lisozima [55]. Los extractos periplásmicos (normalizados a la densidad celular) se separaron mediante SDS PAGE y se analizaron mediante transferencia de Western (Figura 10). La detección con el antisuero anti EPA (panel izquierdo) y el antisuero anti O2 (panel derecho) muestran dos grupos del patrón tipo escala de antígeno O por encima de l00 kDa, lo que es muy indicativo de glucoproteínas que consisten en la proteína EPA y el polisacárido O2. La señal obtenida con el antisuero de EPA solo (por encima de 70 kDa) corresponde a EPA no glucosilado. El primer grupo (entre 100 y 130 kDa) corresponde a un solo grupo, el segundo grupo más débil (por encima de 130 kDa) a la proteína EPA doblemente glucosilada. Las señales similares a escalas observadas en la transferencia de Western de anti O2 son probablemente productos de degradación del glucoconjugado EPA O2 que todavía contienen la porción de polisacárido. Es evidente que ambas variantes de PglB conducen a productividades específicas similares de las glucoproteínas. upecGVXN124 (StGVXN3947) es un aislado clínico de serotipo O2, en el que se eliminó el gen waaL [13] y se introdujeron los plásmidos p659 y p939 mediante electroporación. utilizando este sistema de expresión de control como un comparador (carril x), se observaron señales más fuertes de los extractos procedentes de W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL (carril B) que del sistema de expresión utilizando un aislado clínico (upecGVXN124) como hospedador de expresión. Por lo tanto, la inserción en W3110 puede dar como resultado mayores rendimientos de glucoconjugados en comparación con la glucosilación en la cepa natural.
Las glucoproteínas también se pueden producir por la cepa insertada en un biorreactor a escala 101 para la purificación preparativa de glucoconjugados altamente puros que exhiben longitudes de polisacárido más cortas como se observa con un sistema de tres plásmidos. La electroforesis en gel capilar se puede utilizar para analizar la pureza, cantidad y tamaño de los glucoconjugados. Los polisacáridos unidos a los glucoconjugados se pueden eliminar de la proteína mediante hidrazinolisis y analizar mediante el marcado con 2 AB y HPLC-MS/MS para el análisis de la estructura y longitud del polisacárido. Este análisis se puede utilizar para confirmar la unión del antígeno O O2 al portador de la glucoproteína. Además, el análisis de PMP se puede realizar para la determinación de la composición de monosacáridos, análisis de NMR y cromatografía de gases para la confirmación de la estructura. Además, se puede realizar la inmunización de animales para aumentar los anticuerpos contra el polisacárido y la proteína transportadora. La actividad antiinfecciosa se puede mostrar mediante el uso de ensayos como los ensayos de mortalidad opsonofagocítica y/o la protección pasiva.
6.3 Ejemplo 3: Construcción de cepa para la producción de conjugado de antígeno O O6 de E. coli
La construcción de la cepa se realizó como se describe anteriormente. El grupo rfb de O6 se clonó en un plásmido pDOC que consta de las regiones HR y un casete kanR como se detalla en la tabla 1. El grupo O6 se amplificó a partir del Ad N genómico de la cepa CCUG11309 de E. coli con los oligonucleótidos 1907/1908 (Figura 11 A) y se clonó en los sitios BamHI y Bcul de p843 dando como resultado p914.
El plásmido auxiliar p999 (GenBank: GU327533.1) se introdujo en las células W3110 mediante electroporación [1]. Se mezclaron 5-500 ng de ADN en agua con 50 pl de suspensión de células electrocompetentes en una cubeta de electroporación estándar en hielo y se sometieron a electroporación en un micro pulsador BioRad (BioRad) a un voltaje de 1,8 kV durante 2-10 ms. Debido al fenotipo de replicación sensible a la temperatura de p999, las células resultantes se sembraron en placas y se cultivaron a 30 °C en todo momento. En una etapa siguiente, p914 se introdujo en W3110 teniendo p999 por electroporación, y las células se seleccionaron para resistencia a amp y spec en placas LB a 30 °C. Los plásmidos se insertaron en las células aceptoras para permitir la expresión de las enzimas codificadas en el plásmido auxiliar en presencia del ADN del plásmido donante dentro de la misma célula.
Los clones electroporados que contenían plásmidos auxiliares y donantes se cultivaron en medio LB en presencia de amp y spec a 30 °C a 5 ml a escala durante la noche a 180 rpm. Se transfirieron 10 pl del cultivo a un nuevo tubo que contenía 1 ml de LB líquido complementado con spec y amp. El nuevo cultivo se cultivó luego a 180 rpm durante 2 horas a 30 °C. Luego, el medio se intercambió: el cultivo se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos a 4 °C, el sobrenadante se descartó y el sedimento celular se resuspendió en medio LB complementado con spec, arabinosa al 0,2 % (p/v), e IPTG 1 mM para apoyar la selección de plásmidos auxiliares (Spec) y la expresión de recombinasa (ara) y endonucleasa Scel (IPTG). Las células resuspendidas se incubaron adicionalmente a 30 °C durante 4-18 horas a 180 rpm para permitir que se produjera el evento de recombinación.
En diferentes momentos de 4 a 18 horas después del cambio de medio, se colocaron en placas 0,5 ml del cultivo en LB complementado con kan (para la selección del inserto de ADN) y sacarosa al 10 % (p/v) (para contraseleccionar contra el plásmido donante) y se incubaron a 37 °C durante la noche (para seleccionar la pérdida del plásmido auxiliar sensible a la temperatura).
Para seleccionar las colonias resultantes para el fenotipo de inserción correcto (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR), las células se replicaron en placas de LB complementadas con spec, amp, o kan. Las colonias resistentes a kan (para la presencia del inserto de ADN), pero sensibles a amp y spec (para la ausencia del plásmido donante y auxiliar) se analizaron adicionalmente para la inserción. Además, se realizó una transferencia de colonias. Las colonias en placa de réplica que crecieron en LB complementado con kan se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante el "levantamiento de colonias": se colocó una membrana redonda de nitrocelulosa en la placa de LB sobre las colonias en crecimiento hasta que la membrana estuvo completamente húmeda. Al levantar la membrana, las colonias que se adhieren a la membrana se lavan en PBS complementado con Tween 20 (0,02 % p/v). Posteriormente, la membrana se procesó como una transferencia de Western utilizando el antisuero anti O6 para la detección de colonias que produjeron el antígeno O6. Las colonias positivas aparecieron como puntos oscuros después del desarrollo de las membranas.
Los casetes de resistencia a antibióticos para kan (de la inserción del grupo rfb) y clm (eliminación de waaL) se eliminaron en una sola etapa mediante recombinación dirigida por recombinasa FLP utilizando el plásmido pCP20 como se describe [35].
La inserción del inserto de ADN se probó mediante PCR para determinar la ausencia de wzx de O16 y la presencia de wzy de O6 [51] (Figura 11 D), mediante PCR de la región de transición en 5' (Figura 11 B) y 3' (Figura 11 C), tinción con plata de muestras de LPS y análisis de transferencia de Western utilizando sueros de tipo O6 (Figura 12). Solo el clon A (Figura 12A, carril 1) generó una señal de antígeno O tipo escala cuando los extractos se analizaron con suero anti 06 (como la cepa de control O6 de E. coli, carril 3), mientras que el clon B fue negativo (carril 2). Todas las pruebas adicionales fueron positivas para la actividad funcional del grupo de rfb.
En una etapa siguiente, el gen waaL fue interrumpido por la transducción de fagos del clon A como se describe anteriormente [52]. La tinción con plata muestra que el antígeno O está ausente de una cepa de eliminación waaL (Figura 12 B, panel izquierdo, carril 1), y el análisis de western muestra el antígeno O de o 6 unido a Und-PP como una típica señal débil tipo escala en los mismos extractos (Figura 12 B, panel derecho, carril 1). Antes de la eliminación de waaL, se observa claramente el LPS (ambos paneles, carriles 2). Este resultado mostró una eliminación exitosa de waaL.
Los casetes de resistencia a antibióticos para clm (eliminación de waaL), y luego para kan (inserción de grupo rfb) se eliminaron en dos etapas consecutivas mediante recombinación de FLP [35]. La Figura 12 C muestra dos clones (carriles 1, 2) después de la eliminación de clmR con las señales enlazadas Und-PP restantes (transferencia de Western, panel derecho). Las cepas finales (dos clones, W3110 ArfbO16::rfbO6 AwaaL) se analizaron mediante PCR de las regiones de transición en 5 'y 3' (Figuras 11 A y B). La tinción con plata de LPS, la transferencia de western y el marcaje con 2 AB fluorescente seguido por HPLC y análisis MS/MS de polisacáridos unidos a Und-PP se puede hacer para confirmar. Todos los datos pueden confirmar la inserción exitosa y la actividad funcional del grupo rfb en los dos clones seleccionados.
Para mostrar la producción de glucoconjugado O6, se introdujeron plásmidos que proporcionan una expresión inducible de la oligosacaril transferasa PglB de C. jejuni (p939) y la proteína transportadora EPA (que codifica 4 secuencias de consenso de glucosilación, p659) en W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL (es decir, el antecesor de la cepa final W3110 ArfbO16::rfbO6 AwaaL) mediante electroporación. Se cultivaron las células y se agregaron inductores, y las células se cultivaron adicionalmente durante la noche. Se recogieron muestras y se prepararon extractos de células periplásmicas utilizando el procedimiento de lisozima [55]. Los extractos periplásmicos (normalizados a la densidad celular) se separaron mediante SDS PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia después de la electrotransferencia. La detección con el antisuero anti EPA y el antisuero anti O6 muestran dos grupos claros de señales de tipo escala, uno entre 100 y 130, y otro por encima de 130 kDa (Figura 13). Estas señales son fuertemente indicativas de glucoproteínas que consisten en la proteína EPA y el polisacárido O6. La señal obtenida con el antisuero de EPA solo (por encima de 70 kDa) corresponde a EPA no glucosilado. Es evidente que se detectan dos grupos de escala, indicativos de EPA glucosilada en dos sitios.
Las glucoproteínas también se pueden producir por la cepa insertada en un biorreactor a escala 101 para la purificación preparativa de glucoconjugados. Los polisacáridos unidos a los glucoconjugados se pueden eliminar de la proteína mediante hidrazinolisis y analizar mediante marcaje con 2 AB y HPLC-MS/MS como antígeno O unido a Und-PP. Este análisis puede confirmar la unión del antígeno O6 al portador de la glucoproteína.
Para analizar las cepas insertadas en términos de calidad y cantidad de producción de conjugado, se comparó el rendimiento de las cepas insertadas para la producción de glucoconjugados EPA de 01, O2 y O6 con sistemas de producción alternativos, que son los "sistemas de tres plásmidos", es decir, los sistemas con el grupo rfb codificado en un episoma como se describe en la materia anterior [9], o el sistema de "cepa de tipo silvestre". En el primero, se usa una cepa W3110 AwaaL como un hospedador de expresión. Existen algunas diferencias técnicas en ese sistema en comparación con los sistemas insertados y de tipo silvestre. El sistema de tres plásmidos requiere la introducción y el mantenimiento de tres plásmidos en el hospedador. Esto significa que se deben agregar tres antibióticos diferentes a los medios de crecimiento durante la fermentación para garantizar el mantenimiento del plásmido. La coexistencia de tres plásmidos requiere cadenas principales vectoriales compatibles. Especialmente las grandes secuencias de grupos de rfb requieren un sistema de mantenimiento específico y una presión de selección intensa. El mantenimiento del plásmido es una causa permanente de rendimientos reducidos en los procesos de producción de productos de fermentación microbiana recombinantes, principalmente porque se produce una pérdida del plásmido y, por lo tanto, las células afectadas dejan de producir el producto recombinante, o porque el mantenimiento del plásmido implica una carga para la célula que produce una caída. Debido a los posibles efectos adversos alérgicos de los seres humanos a los antibióticos, existe una creciente demanda de las agencias reguladoras para procesos de producción libres de antibióticos. Por lo tanto, hay una clara ventaja en la integración del grupo biosintético anteriormente presente en un episoma al cromosoma.
El segundo sistema de producción posible se basa en aislamientos clínicos naturales procedentes de individuos infectados o del campo, y los utiliza como plataformas de producción. Como naturalmente producen el antígeno O de interés, una simple eliminación de waaL hace que esas cepas adecuadas, se inserten naturalmente en las cepas de producción. Sin embargo, dado que muchas toxinas y factores se codifican y expresan en aislados clínicos de E. coli, las agencias reguladoras requieren estándares de mayor calidad para los productos de tales sistemas, lo cual es costoso y consume mucho tiempo. Por lo tanto, la inserción en el hospedador W3110 bien estudiado y seguro representa una alternativa adecuada: se reducen las desventajas asociadas con el plásmido y se cumplen los requisitos económicos.
Se analizan los tres sistemas de producción para los tres antígenos O de E. coli (Figura 14). Los plásmidos de expresión para EPA (p659) y PglB (p939) se introdujeron en células hospedadoras que contenían el locus rfb en el genoma (cepas insertadas o aislados clínicos) o en un plásmido (sistema de tres plásmidos). Los cultivos bacterianos se cultivaron primero durante la noche en medio LB que contenía todos los antibióticos necesarios para mantener los plásmidos presentes en las células. Después, el cultivo se diluyó a DO600 de 0,05 en medio TB y creció hasta DO600 de 0,4-1,2 y se agregaron inductores (arabinosa al 0,2 %, IPTG 1 mM). 20 horas después de la inducción a 37 °C, las células se recogieron y se prepararon extractos periplásmicos utilizando el procedimiento de lisozima. Los lisados periplásmicos se analizaron luego mediante SDS PAGe e inmunodetección (transferencia de Western).
Se observa EPA no glucosilada por encima de 70 kDa en las transferencias anti-EPA. Los patrones tipo escala agrupados por encima de 100 kDa representan glucoconjugados de longitud completa con la distribución de longitud de polisacárido del antígeno O típica. En general, todos los sistemas producen glucoconjugados en un orden de magnitud similar. Sin embargo, los sistemas de tres plásmidos producen señales tipo escalas en transferencias de Western de anti EPA y anti polisacárido que aparecen más ampliamente extendidas (Figura 14, panel A, compárense en los carriles 3 y 2) o alcanzan niveles de peso molecular más altos (todos los paneles, compárense los carriles 3 y 2) que las cepas insertadas (tipo silvestre e insertadas). Esto muestra que la estrategia de inserción es una poderosa herramienta de ajuste del proceso para la producción de glucoconjugado (Figura 14).
Las comparaciones preclínicas de los glucoconjugados de polisacáridos largos (realizados por el sistema de tres plásmidos) y las cepas insertadas se pueden realizar para determinar si los conjugados últimos son más inmunogénicos y más definidos.
La comparación de la homogeneidad del cultivo y el mantenimiento de los elementos de ADN recombinante en cultivos de producción se puede realizar para mostrar que las células de las cepas hospedadoras insertadas son capaces de producir niveles más altos de producto, exhiben un mejor patrón de reproducibilidad y son genéticamente más estables, lo que confirma que esa inserción es superior debido a la alta viabilidad de la ampliación de escala.
6.4 Ejemplo 4: Construcción de cepa para la producción de antígeno O de S. sonnei
El grupo 017 de P. shigelloides es funcionalmente idéntico al grupo rfb de S. sonnei, pero no está codificado en un plásmido de patogenicidad inestable y, por lo tanto, se clonó a partir de P. shigelloides. El grupo se amplificó a partir del ADN genómico de 017 de P. shigelloides con los oligonucleótidos 1508/1509 (sin wzz) y 1528/1509 (con wzz). El grupo rfb de O17 de P. shigelloides se clonó en el plásmido p562 procedente de pDOC que dio como resultado p563 (en el que se incluyó wzz) y p568 (que carece del gen wzz). Los plásmidos auxiliares consistían en las regiones HR y un casete de selección como se detalla en la tabla 1. La construcción de la cepa se realizó como se describe en el Ejemplo 1. La inserción del inserto de ADN se probó mediante PCR para determinar la ausencia de wzy de 016 y la presencia de wzy-wbgV de S. sonnei, mediante PCR de la región de transición en 5 'y 3' (Figura 15), tinción con plata de muestras de LPS y análisis de transferencia de Western utilizando sueros de tipificación de S. sonnei (Figura 16).
6.5 Ejemplo 5: Cepa insertada para la producción del glucoconjugado del antígeno O de S. dysenteriae
Aunque los grupos rfp y rfb de S. dysenteriae forman una unidad funcional que produce el antígeno O en E. coli, en el genoma de S. dysenteriae están presentes en diferentes ubicaciones ([8]). Ambos grupos se clonaron en un plásmido pDOC que consiste en las regiones HR y un casete de selección como se detalla en la tabla 1. Un fragmento BamHI del plásmido pSDM7 que contenía rfb/rfp ([8]) se subclonó en pLAFR1 que contenía un casete de MCS adecuado. Desde allí, los oligonucleótidos 1261 y 1272 (véase la tabla 3) se utilizaron para clonar rfp/rfb en un amplicón en p503 procedente de pDOC, dando como resultado p504. p503 se clonó a partir de p482 (véase la sección 6.1): un amplicón de PCR que codifica la región HR1 para la inserción, que contiene parte de galF (galF') y la región intergénica entre galF y rmlB de la cepa W3110 (utilizando los oligonucleótidos 1171/1263) se digirió con SpeI y BamHI y se ligó en p482 digerido con las mismas enzimas (que dieron como resultado p503). rfp y rfb se encuentran como dos grupos separados en el genoma de S. dysenteriae tipo I y se clonaron en que la dirección de la traducción era la misma para galF’, rfp, rfb y gnd cuando se expresaban desde p504. La inserción del inserto de ADN se realizó en cepas positivas y negativas de waaL y se analizó mediante PCR para determinar la ausencia de wzy de 016, mediante p Cr en la región de transición en 5' y 3', tinción con plata de muestras de LPS y análisis de transferencia de Western utilizando sueros de tipificación (no se muestra). La figura 17 muestra el análisis de glucolípidos de W3110 ArfbO16::rfbSd1 AwaaL y W3110 ArfbO16::rfbSd1 insertados antes y después de la extracción del casete clmR. Cuando los extractos se analizaron mediante tinción con plata después de SDS PAGE, solo las cepas positivas a waaL mostraron el patrón de antígeno O típico de LPS, no las cepas AwaaL. Todas las cepas respondieron al antisuero específico de anti antígeno O de S. disenteriae 1 que confirma la producción de antígeno O recombinante en estas cepas (Figura 17).
Para analizar la estructura del antígeno O recombinante en detalle molecular, el conjunto de polisacáridos unido a Und-PP de W3110 ArfbO16::rfbSd1-clmR AwaaL se analizó mediante el marcaje con 2 AB de extractos orgánicos hidrolizados de células y HPLC de fase normal (Figura 18). La traza muestra el patrón tipo escala que se observa a menudo en la PAGINA SDS. El análisis de MS/MS de determinados picos se puede utilizar para confirmar la secuencia de polisacáridos tipo 1 de S. dysenteriae.
W3110 ArfbO16::rfbSd1-clmR AwaaL fue el hospedador para la producción del conjugado de EPA de S. dysenteriae 1 como se describe a continuación. Para confirmar la producción de candidatos de vacunas de glucoconjugado utilizando esta cepa, los plásmidos de expresión p293 y p114 se transformaron en la cepa y se fermentaron a escala 101 en un biorreactor. El conjugado de EPA se purificó y la EPA no glucosilado se eliminó mediante cromatografía clásica. El volumen final resultante se analizó para confirmar la estructura del azúcar y la calidad del conjugado mediante HPLC SEC (Figura 19 A), SDS PAGE seguida de tinción con coomassie o inmunodetección (Figura 19 C), análisis de composición de monosacáridos (Figura 19 B) e hidrazinolisis seguida de marcaje con 2 AB, análisis de HPLC y MS/MS (Figura 19 D).
6.6 Ejemplo 6: Cepa insertada para la producción del glucoconjugado del antígeno O 2a de S. flexneri
Los antígenos O de Shigella son inmunológicamente diversos. Para una vacuna completa contra la shigelosis que utiliza el polisacárido del antígeno O como un antígeno, se cree que se deben incluir estructuras de antígeno O de al menos cinco serotipos, para obtener una cobertura suficiente. El objetivo es incluir tantos elementos antigénicos como sea posible de las cepas infecciosas más prevalentes y contener los antígenos O 2a y 3a de S. dysenteriae tipo 1, S. sonnei y S. flexneri tipo 6 y S. flexneri [56].
Los serotipos 2a y 3a se basan en la misma estructura de polisacárido de cadena principal del antígeno O, que se denomina serotipo Y. Existe una gran diversidad de serotipos O en S. flexneri. Es debido a modificaciones de las unidades de repetición del serotipo Y por los grupos de glucosa y acetilo. Las modificaciones de este tipo son responsables de la constitución de las estructuras de los serotipos 2a o 3a (Figura 20 A). Las modificaciones de la cadena principal de Y son diversas y combinaciones diferentes de modificaciones conducen a muchas estructuras de polisacáridos con reactividad cruzada serológica. Los serotipos 2a y 3a contienen dos modificaciones diferentes de la glucosa y una de ramificación de la acetilación que se encuentran a menudo en Shigella y, por lo tanto, se incluyen en una vacuna para detectar contra otros antígenos de reacción cruzada.
Las enzimas decorativas que generan la diversidad estructural son las transferasas específicas que unen los restos de glucosa y acetilo a la cadena principal del serotipo Y. Mientras que la cadena principal está completamente codificada en el grupo de rfb, las enzimas responsables de la adición de grupos de glucosa o acetilo están codificadas fuera de los grupos rfb. Se realizó la misma observación para algunos antígenos O de E. coli (por ejemplo, 016). Como en muchos casos se cree que las modificaciones de la cadena principal son importantes para la inmunogenicidad, deben incluirse en las cepas de producción insertadas.
Para la construcción de una cepa de E. coli insertada que produce el antígeno O que requiere una glucosiltransferasa (o acetiltransferasa) que se ubica fuera del grupo rfb, primero se construyó una cepa hospedadora que contenía la transferasa adicional, y se probó su funcionalidad mediante la coexpresión del grupo rfb de un plásmido. En una etapa adicional, se realiza la inserción del grupo del antígeno O en lugar del grupo rfb de W3110. El orden de estos eventos es puramente práctico y no sistemático, es decir, el orden podría invertirse. Este procedimiento se ejecutó para producir el antígeno O 2a de S. flexneri, y se demostró que el glucoconjugado producido con esta cepa es funcionalmente activo en pruebas preclínicas.
Se elige W3110 de E. coli como la cepa hospedadora para la producción del glucoconjugado 2a y 3a porque tiene una capacidad probada para la producción eficaz de glucoconjugado. W3110 es deficiente en la producción de antígeno O debido a un gen de la glucosiltransferasa alterado en el grupo rfb de 016. Sin embargo, para evitar posibles interferencias por las actividades restantes del grupo rfb con los ensayos planificados, se eliminaron los genes rfb glucosilo y acetiltransferasa wbbIJK [13]. El casete de selección se eliminó automáticamente mediante la utilización de la recombinación específica del sitio que funciona con los sitios dif utilizados por una recombinasa de E. coli [14]. Cuando se expresó el grupo rfb de S. flexneri clonado a partir de la cepa 2457T de Shigella flexneri (serotipo 2a), el análisis con glucolípidos de los extractos mostró el fenotipo de serotipo Y de S. flexneri. El LPS de estos extractos no fue reactivo a los antisueros específicos anti-grupo II y anti-grupo 7, 8 de modificación de la cadena lateral (Figura 20 C, carril 1).
Para la adición de las decoraciones de glucosa al serotipo Y, se aprovechó la ventaja del sistema de modificación existente presente en W3110 de E. coli. Las modificaciones de la glucosa a menudo se catalizan por una maquinaria enzimática que se origina a partir de un inserto de ADN de profago [57]. W3110 de E. coli contiene este elemento genético llamado el operón gtr. El operón gtr contiene tres genes. Los dos primeros genes están altamente conservados y son comunes a la mayoría de los grupos gtr identificados hasta la fecha (gtrAB). El tercer gen codifica la glucosiltransferasa que agrega glucosa a una ubicación específica en la cadena de antígeno O en crecimiento en el lado periplásmico de la membrana. En el caso de W3110, este gen se llama gtrS. En 2a y 3a de S. flexneri, los grupos gtr están presentes. Los respectivos genes gtrAB son altamente homólogos, mientras que los terceros genes (gtrII en 2a y gtrX en 3a) son diferentes [32]. Debido a su homología mecánica con el sistema W3110, se razonó que el intercambio de gtrS con gtrlI o gtrX también transferiría la actividad de decoración de la glucosa.
Para ensayar esta hipótesis, el gen gtrS se intercambió por gtrlI o gtrX por recombinación homóloga [13], utilizando una estrategia de escisión de casete como se describe en [14]. Un casete clmR flanqueado por sitios dif se colocó cadena abajo para obtener ORF de gtrlI o gtrX sintetizadas químicamente en el plásmido p411. Los oligonucleótidos 1018 y 1019 se utilizaron para generar un fragmento de PCR que codifica gtrlI y clmR a partir de p411. Los salientes de oligonucleótidos fueron idénticos a las secuencias cadena arriba (secuencias gtrB) y cadena abajo de la ORF de gtrS. Mediante la utilización de este amplicón, se realizó una recombinación homóloga [13]. La recombinación correcta se verificó mediante PCR de colonias (utilizando los oligonucleótidos 1016/1017) y los productos de PCR se secuenciaron (Figura 20 B). Para comprobar si las enzimas gtr pueden decorar la estructura de la cadena principal de tipo Y, las cepas positivas se transformaron con el plásmido que expresa el grupo rfb de la cepa 2457T. Los extractos de estas células contenían LPS según se analizó mediante tinción con plata, pero su movilidad electroforética parecía ligeramente diferente como la cepa de control que expresaba el grupo de rfb solo (Figura 20 C, panel izquierdo, compárense en los carriles 1,2, 3). Los mismos extractos se probaron como antes con el antisuero específico de la cadena lateral de glucosa y, como se esperaba, el antisuero anti grupo II generó una señal con la cepa W3110 AgtrS::gtrII, y la cepa W3110 AgtrS::gtrXgeneró una señal con el antisuero anti grupo 7, 8. Por lo tanto, el intercambio de los genes gtr transfirió la capacidad específica para la decoración de la glucosa a W3110 de E. coli, dando como resultado las cepas W3110 AgtrS::gtrII y W3110 AgtrS::gtrX. De manera similar, se podría insertar todo el grupo gtr o también el tercer gen solo (es decir, la glucosiltransferasa específica) en una cepa hospedadora adecuada para generar la actividad de decoración en una cepa de expresión de glucoconjugado recombinante.
Para completar la estructura de 3a de S. flexneri con modificaciones de acetilación, los genes de acetiltransferasa conocidos se pueden insertar en la cepa de producción utilizando una estrategia similar. Para el serotipo 2a, se puede utilizar la secuenciación del genoma y el análisis de homología para identificar los genes de acetiltransferasa candidatos que se pueden probar para determinar la actividad decorativa del polisacárido.
Para acomodar la glucosilación de proteínas con el antígeno O de 2a recombinante, el gen waaL se eliminó mediante recombinación homóloga [13, 14] dando como resultado la cepa W3110 AgtrS::gtrXAwaaL. Además, el grupo rfb de W3110 de E. coli se intercambió por el de 2457T de S. flexneri como se describe en el ejemplo 1, dando como resultado W3110 ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrX AwaaL. El plásmido donante p487 se construyó a partir de p482 mediante la inserción de un amplicón de PCR preparado utilizando los oligonucleótidos 1171 y 1172. Además, para evitar la degradación metabólica de la arabinosa utilizada para la inducción de la proteína transportadora, el grupo araBAD se interrumpió en esta cepa. Es bien sabido que la eliminación de araBAD aumenta los rendimientos cuando las proteínas recombinantes están controladas por el sistema promotor araBAD. Por lo tanto, la cepa W3110 ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrX AwaaL se transdujo con lisado de fago preparado a partir de la cepa W3110 AaraBAD::cat. W3110 AaraBAD::clmR se preparó mediante recombinación homóloga utilizando un inserto de ADN fabricado mediante PCR utilizando los oligonucleótidos 1562 y 1563 y pKD3 como plantilla [13].
Para utilizar la cepa resultante W3110 AaraBAD::clmR ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrII AwaaL para la producción de vacunas candidatas a escala industrial, los plásmidos de expresión para la proteína transportadora EPA contienen 2 sitios de glicosilación (p293) y para el oligosacaril transferasa pglB que contiene un marcador HA (p114) se introdujeron en W3110 AaraBAD::clmR ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrII AwaaL mediante electroporación. La cepa resultante se fermentó a escala 10 1 y el glucoconjugado de EPA se purificó a partir de la biomasa resultante. La purificación se realizó para eliminar las impurezas de la célula hospedadora y la proteína transportadora no glucosilada. Los conjugados se caracterizaron mediante HPLC SEC (Figura 21 B), SDS PAGE seguido por tinción con coomassie e inmunodetección (Figura 21 A), hidrazinolisis seguida por MS/MS (Figura 21 D), análisis de composición de monosacáridos (Figura 21 C) y GC-MS para configuración absoluta de monosacáridos (no se muestra) (véase 5.2.1.7 y 5.3.5). Estos datos confirmaron que la inserción y la modificación cromosómica de la cepa dieron como resultado un sistema de producción eficaz para la generación de un producto de vacuna de 2a de S. flexneri candidato.
Para demostrar que la vacuna candidata era funcional en modelos animales, se probó la inmunogenicidad de una vacuna de glucoconjugado de 2a-EPAE de E. coli producida en la cepa insertada W3110 AaraBAD::clmR ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrII AwaaL que contiene p114 y p293. Se administraron a las ratas tres veces con un intervalo de tres semanas por vía subcutánea con conjugado 2a-EPA que contenía 2,5 |jg de carbohidrato en PBS o PBS solo (Figura 22). Los resultados muestran una seroconversión significativa en la mayoría de los individuos, y que el título logarítmico medio fue estadísticamente significativo más alto en animales inmunizados (grupos di-BC y Flex-BC) en comparación con los animales que recibieron inyecciones de control (PBS). Este resultado también muestra que para la inmunogenicidad y, por lo tanto, probablemente para la eficacia, no se requiere la acetilación del antígeno O. El glucoconjugado 2a-EPA acetilado (Flex-BC) se produjo en una cepa de 2a de S. flexneri atenuada (cepa 2457T) mediante la utilización del mismo procedimiento, pero la cepa de producción 2a de S. flexneri AwaaL, con p114 y p293 introducidos. Se sabe que la cepa 2457T acetila su antígeno O [58].
6.7 Ejemplo 7: Cepa insertada para la producción del antígeno O de O11 de P. aeruginosa
El grupo de antígeno O de O11 se clonó en el plásmido pDOC que consiste en las regiones HR y un casete de selección como se detalla en la tabla 1. El grupo de antígenos O se amplificó a partir de la cepa PA103 de P. aeruginosa con los oligonucleótidos 2245/2247 (véase la tabla 3). La construcción de la cepa se realizó como se describe en el ejemplo 1. La inserción del inserto de ADN (con wzz) en W3110 AwaaL se probó mediante PCR para determinar la ausencia de wzx de 016 y la presencia de O11, mediante PCR en la región de transición en 5' y 3', tinción con plata de muestras de LPS y análisis de transferencia de Western utilizando suero tipificado de anti grupo E (O11) de P. aeruginosa. En el ejemplo mostrado, 4 clones con fenotipos de resistencia correctos a los antibióticos se analizaron para determinar la producción de antígeno O de O11 (A a D, carriles 1-4) y crearon la señal del antígeno O tipo escala típica con movilidad electroforética correspondiente a un tamaño de alrededor de 34 kDa cuando se analizó con el suero anti grupo E (Figura 23). Como controles, se utilizaron células DH5a de E. coli que contenían el plásmido donante con wzz y sin wzz (carriles 5 y 6). La cepa de control contiene un gen waaL activo y, por lo tanto, produce LPS O11, que muestra un patrón diferente al Und-PP de O11 (carriles 1-4). Por consiguiente, las señales son más intensas y se observan en un intervalo de peso molecular más alto. En ausencia de wzz (carril 6), la señal se concentra a pesos moleculares más pequeños, lo que indica que el wzz de 016 de E. coli puede asumir esta función de manera eficaz. En conjunto, estos resultados mostraron una inserción exitosa y una expresión funcional del grupo de antígenos O de O11 de P. aeruginosa en E. coli. Datos adicionales indican que wzz de O11 de P. aeruginosa está activo para la regulación de la cadena en DH5a de E. coli, y que su actividad se puede reemplazar funcionalmente por enzimas reguladoras de la longitud de la cadena de E. coli de la clase wzz.
6.8. Ejemplo 8: Inserción de un grupo quimérico, no natural
Se logró la producción de polisacáridos capsulares gram positivos y la glucosilación de proteínas transportadoras utilizando este polisacárido en E. coli [10]. El polisacárido se sintetizó mediante el ADN introducido compuesto por construcciones de fusión que consisten en fragmentos de grupos de antígeno O y fragmentos de grupos de CPS para producir un antígeno O recombinante con una estructura de CPS.
Dichos grupos quiméricos construidos se insertaron en dos posiciones diferentes en el genoma de W3110 para probar la productividad de Und-PP-CP5. Para dirigir la inserción, se clonaron diferentes regiones de homología en los plásmidos donantes.
En un caso, el sitio diana fue el grupo rfb de W3110 como en los ejemplos anteriores, es decir, las regiones HR fueron las regiones cadena arriba y cadena abajo de las ORF contenidas en el grupo rfb de 016. Para insertar los sitios de HR en pDOC-C, pDOC-C se escindió con HindlII y Xhol y se ligó un producto de PCR de ensamblaje cortado con las mismas enzimas. El ensamblaje se realizó con los oligonucleótidos 1182 y 1184 en dos productos de PCR que se generaron utilizando i) los oligonucleótidos 1181 y 1182, o ii) 1183 y 1184, y en ambos casos el ADN genómico de W3110 AwaaL como plantilla de ADN. El plásmido resultante fue p473. Los oligonucleótidos 1142 y 771 (o 1281) se utilizaron para amplificar el grupo de genes que producen CP5 quimérico a partir de un plásmido (p393, US2011/0274720 A1) para clonar en p473 mediante la utilización de Eco81I, dando como resultado p477 (o p498). p498 se clonó de manera que wzz y wzx del grupo O11 se eliminaron en este plásmido (en comparación con p477, donde wzz y wzx están presentes).
En el otro caso, la inserción se realizó en los sitios diana que flanquean los genes wecA y wzzE de ECA. Dado que wecA puede competir con el polisacárido recombinante por el Und-P disponible en las células, la eliminación de wecA se razonó para dar como resultado rendimientos más altos del polisacárido CP5. Para hacer un plásmido donante que permita la sustitución de wecA y wzzE, pDOC-C se modificó primero con las dos regiones HR y luego se insertó el grupo quimérico CP5. Los oligonucleótidos 1126 y 1129, así como 1127 y 1128 se utilizaron para amplificar las regiones 1 y 2 de HR utilizando el ADN cromosómico de W3110 como plantilla. Los productos de la PCR se ensamblaron utilizando los oligonucleótidos 1126 y 1127, y las HR ensambladas se clonaron en los sitios Xhol y HindlII de pDOC-C, dando como resultado p467. Los oligonucleótidos 1142 y 771 se utilizaron para amplificar el grupo de genes que producen CP5 quimérico a partir de un plásmido (p393, US2011/0274720 A1), y el producto de PCR correspondiente se clonó en el sitio Eco81l de p467 dando como resultado p471.
La inserción en ambas ubicaciones utilizando p471, p498 y p477 se realizó en detalle cómo se describe en el ejemplo 1. Los plásmidos donantes y auxiliares se sometieron a electroporación en células W3110, y las células se trataron como se describió anteriormente. Se utilizaron procedimientos de PCR de colonias para confirmar la ubicación de inserción correcta. Para mostrar que la inserción dio lugar a cepas capaces de producir un antígeno O recombinante, los lisados celulares tratados con proteinasa K de los clones insertados y las células de control se separaron mediante SDS PAGE y se tiñeron con plata o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondaron con un antisuero específico anti CP5. Como controles, se analizaron extractos de células DH5a que contienen plásmidos donantes correspondientes o W3110 AwecA que contiene el cósmido p393 que expresa el antígeno O modificado con CP5 (US2011/0274720 A1). Se obtuvieron diferentes intensidades de señal tipo escala (Figura 24), más fuertes con el plásmido donante p471 (carril 7), igualmente fuertes con p498 (carril 5), débilmente con p477 (carril 6). El carril 4 contiene células de control negativo con p473, que no contienen el grupo CP5 quimérico, solo las regiones HR1 y 2 y no hay señales CP5. Las señales tipo escala en peso molecular bajo se deben probablemente a un polisacárido ECA y no a CP5, ya que no se detectan con el antisuero específico anti CP5. p498 y p477 difieren en un pequeño tramo de ADN que codifica los genes wzz y wzx de O11 de P. aeruginosa, que está presente en p477. Por lo tanto, se concluyó que wzz-wzx limita la producción de glucolípidos debido a un efecto promotor. p471, que contiene el grupo quimérico que incluye wzz-wzx, se transcribe muy probablemente desde el promotor de ECA presente en HR1. Por lo tanto, la ubicación en p471 soporta la biosíntesis de CP5. Los clones insertados se prepararon utilizando p471 (carril 1), p477 (carril 2) y p498 (carril 3) como plásmidos donantes. Aunque las señales fueron en general mucho más débiles, se detectó una detección específica de la banda de la escala central y una banda de bajo peso molecular. Las intensidades fueron más fuertes para el clon procedente del plásmido donante más fuerte (Figura 24). Por lo tanto, estos datos confirman que los procedimientos de inserción presentados pueden insertar piezas de ADN de al menos hasta 16 kb de largo en diferentes ubicaciones seleccionables.
6.9. Ejemplo 9: Una cepa bacteriana con una oligosacaril transferasa insertada produce bioconjugados
Este ejemplo demuestra que los bioconjugados se pueden producir con éxito mediante una cepa hospedadora bacteriana que ha sido modificada genéticamente mediante la inserción de un ácido nucleico que codifica una oligosacaril transferasa en el genoma de la célula hospedadora bacteriana.
El gen pglB de C. jejuni, con un marcador HA, se insertó de forma estable en el genoma de la cepa mg1655 (K12) de E. coli utilizando la tecnología Staby™ Codon T7 (Delphi Genetics, Charleroi, Bélgica). Como parte del procedimiento para generar la cepa de E. coli con pglB insertado, se aisló pglB del plásmido p114, se fusionó con el gen galK y se insertó en el genoma de la célula hospedadora en lugar del gen waaL Se confirmó que la cepa de E. coli resultante, mg1655 waaL::pglB-galK, contenía pglB integrado establemente de secuencia correcta.
Para evaluar la capacidad de mg1655 waaL::pglB-galK para producir bioconjugados, se introdujeron dos plásmidos en la cepa. El primer plásmido, p64, comprende ácidos nucleicos que codifican el grupo de genes O1 de Shigella dysenteriae. El segundo plásmido, p271, comprende ácidos nucleicos que codifican una proteína transportadora de EPA con un marcador de histidina. Las células hospedadoras se cultivaron durante 4 horas o toda la noche (ON, forma siglada de overnight), se aislaron y se sometieron a análisis de transferencia de Western con un anticuerpo anti-HA para identificar la producción de pglB y un anticuerpo anti-his para identificar la producción de EPA. Las transferencias de Western confirmaron que la cepa hospedadora mg 1655 waaL::pglB-galK que expresa los plásmidos p64 y p271 produjo con éxito las proteínas EPA y pglB. Véase la Figura 25. Cabe destacar que, se identificaron los bioconjugados de 01-EPA, lo que indica la capacidad del gen pglB insertado para producir una oligosacaril transferasa funcional en las células hospedadoras y, por lo tanto, demuestra que el gen pglB se puede insertar en las células hospedadoras bacterianas y conservar su función. Véase la Figura 25.
En otro experimento, para evaluar la capacidad de mg1655 waaL::pglB-galK para producir bioconjugados, se introdujeron diferentes plásmidos en la cepa. El primer plásmido, p281, comprende ácidos nucleicos que codifican el grupo de genes O1 de Shigella dysenteriae. El segundo plásmido, p293, comprende ácidos nucleicos que codifican una proteína transportadora de EPA. Las células hospedadoras se cultivaron durante hasta 16 horas en un biorreactor. En diversos puntos temporales, la producción de pglB y EPA se evaluó mediante análisis de transferencia de Western utilizando anticuerpos anti-EPA y anti-HA. Como se muestra en la figura 26, las transferencias de Western confirmaron que la cepa hospedadora mg1655 waaL::pglB-galK que expresa los plásmidos p281 y p293 produjo con éxito las proteínas EPA y pglB. Cabe destacar que, como se observó con la cepa hospedadora mg1655 waaL::pglB-galK que expresa los plásmidos p64 y p271, la cepa hospedadora mg1655 waaL::pglB-galK que expresa los plásmidos p281 y p293 produjo bioconjugados O1-EPA, lo que indica la capacidad del gen pglB insertado para producir una oligosacaril transferasa funcional en las células hospedadoras y así confirmar que el gen pglB se puede insertar en células hospedadoras bacterianas y conservar su función.
A continuación, los bioconjugados de O1-EPA producidos mediante la cepa hospedadora mg1655 waaL::pglB-galK que expresa los plásmidos p281 y p293 se aislaron exitosamente utilizando una estrategia de purificación de bioconjugado. Véase la Figura 26. En resumen, las proteínas aisladas de la fracción periplásmica de la cepa hospedadora mg1655 waaL::pglB-galK que expresa los plásmidos p281 y p293 cultivados durante la noche se ejecutaron sobre una primera columna de Q-Sepharose. En la Figura 27 se muestra un cromatograma que representa los resultados; se observó una fuerte producción de O1-EPA (véanse las fracciones A6-A9 y la imagen del recuadro). Las fracciones se realizaron en geles de SDS-PAGE seguido de tinción con Coomasie para identificar las fracciones que contenían O1-EPA. Véase la Figura 28. Las fracciones A6-A9, identificadas como abundantes en O1-EPA, se agruparon y se ejecutaron en una segunda columna de Q-Sepharose y las fracciones obtenidas de la segunda columna se ejecutaron en geles de SDS-PAGE seguido de tinción de Coomasie para identificar las fracciones que contenían O1-EPA. Véase la Figura 29. En la Figura 30 se muestra un cromatograma que representa los resultados; se observó una fuerte producción de O1-EPA en las fracciones B4-B6. Finalmente, las fracciones B4-B6, identificadas como abundantes en O1-EPA, se agruparon y se ejecutaron sobre una columna Superdex 200, seguido de tinción con Coomasie para identificar las fracciones que comprenden bioconjugados de O1-EPA purificados. El conjunto final de bioconjugados de O1-EPA aislados, mostrado por la tinción de Coomasie en la Figura 31, se encontró que estaba altamente purificado (véase la figura 32) y demostró ser de idéntica calidad a los bioconjugados de O1-EPA preparados utilizando un sistema de tres plásmidos, en el que el gen pglB se introdujo en una célula hospedadora de E. coli por medio de un plásmido, en lugar de mediante inserción en el genoma de la célula hospedadora.
En conclusión, se ha demostrado que los bioconjugados se pueden producir con éxito utilizando una célula hospedadora bacteriana que ha sido diseñada para expresar de manera estable, como parte de su genoma, una oligosacaril transferasa, que es un componente esencial de la producción de bioconjugados. Ventajosamente, se requirieron menos plásmidos para la producción de bioconjugados utilizando este nuevo sistema que en los sistemas conocidos actualmente para generar bioconjugados en células hospedadoras mediante el uso de maquinaria de glucosilación heteróloga.
Tabla 1: Cepas de inserción.
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continuación
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Tabla 2. Cepas de inserción adicionales
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Tabla 3. Lista de oligonucleótidos
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continuación
Figure imgf000040_0003
continuación
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Tabla 4: lista de endonucleasas de asentamiento
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Figure imgf000042_0001
(continuación)
Figure imgf000043_0001
(continuación)
Figure imgf000044_0001
Tabla 5: lista de orígenes de replicación
Figure imgf000044_0002
Tabla 6. Antibióticos utilizados en biología molecular
Figure imgf000044_0003
continuación
Figure imgf000045_0002
Tabla 7: Promotores inducibles utilizados en la expresión bacteriana
Figure imgf000045_0001
continuación
Figure imgf000046_0001
continuación
Figure imgf000047_0001
Tabla 8: cepas de expresión bacteriana
Figure imgf000048_0001
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de inserción de una secuencia grande de ADN de inserción heterólogo en un genoma de una célula hospedadora utilizando (i) un plásmido donante que comprende de 5' a 3' (1) una secuencia de reconocimiento de una endonucleasa de restricción codificada por el plásmido auxiliar, (2) una primera región de homología que tiene un tamaño de 0,4-2,0 kb, (3) un ADN de inserción heterólogo de al menos 8 kb, y (4) una segunda región de homología que tiene un tamaño de 0,4-2,0 kb y b) un marcador de contraselección, y ii) un plásmido auxiliar que comprende, bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifique la lambda red recombinasa y, bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifique una endonucleasa de restricción que tenga una secuencia de reconocimiento que no esté presente en el genoma de la célula hospedadora, que comprende las etapas de a) introducción del plásmido donante y el plásmido auxiliar en la célula hospedadora; b) cultivo en condiciones que permitan la expresión de la endonucleasa de restricción y la lambda red recombinasa; y c) selección de clones recombinados que muestren un fenotipo de resistencia a antibióticos consistente con (i) la pérdida de los plásmidos auxiliar y donante y (ii) la presencia del inserto de ADN heterólogo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el marcador de contraselección está flanqueado por sitios FRT o sitios dif.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el plásmido donante comprende un origen de replicación.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el plásmido auxiliar comprende un casete de selección.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el plásmido auxiliar comprende un regulón para la expresión de un homólogo de RecA.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el plásmido auxiliar comprende un origen condicional de replicación.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el ADN de inserción heterólogo tiene un tamaño de al menos 10 kb.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el ADN genómico de la célula hospedadora se elimina y se sustituye directamente por el ADN de inserción heterólogo.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que se elimina el gen waaL del ADN genómico de la célula hospedadora.
10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que se eliminan del ADN genómico de la célula hospedadora los genes que codifican las glucosiltransferasas.
11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que se eliminan del ADN genómico de la célula hospedadora genes que codifican la biosíntesis de azúcares de nucleótidos o genes que codifican proteasas periplásmicas.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el ADN de inserción heterólogo codifica una oligosacariltransferasa y/o glucosiltransferasas.
13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el ADN de inserción heterólogo codifica una proteína transportadora modificada para incluir al menos un sitio de glucosilación.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la primera y la segunda regiones de homología son homólogas a regiones de ADN presentes en el genoma de la célula hospedadora.
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