CN109385417A

CN109385417A - 体内dna无缝组装方法

Info

Publication number: CN109385417A
Application number: CN201710656725.XA
Authority: CN
Inventors: 徐锋; 庄英萍
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2019-02-26

Abstract

本发明涉及体内DNA无缝组装方法。揭示了一种简便、易于操作的DNA无缝连接方法。本发明的方法可以实现多个DNA片段之间的无缝连接，或可以将多个DNA片段无缝组装到染色体上。采用本发明的方法，可以把任意长度的DNA片段整合到胞内染色体上。

Description

体内DNA无缝组装方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，更具体地，本发明涉及体内DNA无缝组装方法。

背景技术

DNA组装技术是合成生物学实现各种目标的重要环节及关键步骤。根据组装时所处的环境，DNA组装可分为体内组装和体外组装。体外组装最常见的就是用限制性内切酶和连接酶来完成的方法。但是这种方法对于多基因或者大片段的组装是不行的，因为受到限制性内切酶识别位点的限制。最近这些年发展起来的体外组装技术归类主要有：①连接酶链式反应与PCR的结合(LCR-PCR)；②重叠多片段短核苷酸与PCR的结合，该方法类似于重叠延伸PCR(OE-PCR)；③利用同尾酶酶切连接技术，包括BioBrick、BglBrick和iBrick等；④利用IIs限制性内切酶或其他酶辅助的DNA组装技术，如Golden Gate组装法、MASTER连接法、USER克隆等；⑤配对选择组装法(PSA)；⑥利用特殊的重组酶来完成的DNA组装，如Gateway、In-Fusion等；⑦依赖DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性来完成的DNA组装技术，如SLIC、Gibson恒温组装法等。

体内DNA组装方法相对要少很多，根据不同的宿主目前主要有这么几类：①以酵母为宿主的方法：主要是利用酵母自身体内所具有的重组功能，可以实现多个DNA片段在酵母体内一步完成组装。Gibson体内组装法、DNAassembler、体内迭代法等都是利用了酵母体内的重组功能。但是酵母可能对大肠杆菌复制子进行修饰，导致组装后的载体无法工作。②以枯草芽孢杆菌为宿主的方法：在枯草芽孢杆菌体内进行DNA组装主要是日本科学家Itaya实验室建立起来的，他们使用Bacillus subtilis 168基因组(4.2Mb)作为克隆载体(BGM)，首先将光合细菌Synechocystis PCC6803染色体上间隔排列的多段序列LPS(每段约5kb)克隆到LPA质粒，然后通过同源重组将LPS序列整合到BGM上，然后再次进行同源重组，将Synechocystis PCC6803染色体上大约30kb的序列整合到BGM上，随后再将另外一个LPA质粒上的LPS序列整合到BGM上，然后将紧邻Synechocystis PCC6803染色体上另外一段约30kb的序列整合到BGM上，依次迭代，将光合细菌Synechocystis PCC6803 3.5Mb的染色体克隆到BGM上。但是该方法需要100kb以上的DNA片段作为模板，其应用很受限。随后，他们改变了策略，首先通过PCR将染色体上相互重叠的序列(约4-6kb)克隆到质粒pCISP401和pCISP402上，然后再通过PCR从质粒上将要整合的序列克隆下来，并在两侧带上了同源臂，然后再通过同源重组将各个片段依次拼接在BGM上，通过这样的方法，将小鼠线粒体基因组(16.3kb)和水稻叶绿体基因组(134.5kb)组装成功。③以大肠杆菌为宿主的方法和酵母及枯草芽孢杆菌不同，线性DNA序列并不容易直接转化进E.coli，因为ATP依赖的外切酶RecBCD能够消化掉线性DNA片段。在E.coli中，通常用λRed重组酶系统和RecET重组系统来进行同源重组。λRed重组酶系统更加适合线性和环状DNA之间的重组，而RecET重组系统更加适合两个线性DNA片段之间的重组。对于DNA片段整合到E.coli染色体上，随着DNA片段长度的增加，整合的效率会大幅度降低，Kuhlman等人设计了一种系统，利用Red重组系统和I-sceI内切酶，可以最大将7kb的DNA片段一次整合到E.coli染色体上。但该方法需要使用三个质粒，两次转化，用的时间也较长。

综上，本领域中还需要进一步研究更为简便，易于操作的方法，来提高DNA体内组装效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体内DNA无缝组装方法。

在本发明的第一方面，提供一种DNA无缝组装方法，所述方法包括：

(1)扩增获得基因A的序列，其5’端加上其上游同源序列；在其3’端加上一段与基因B的5’端相同的序列片段1；

(2)扩增获得tetA的序列，在其5’端加上(5’→3’)I-sceI识别序列及一段与基因B的5’端相同的序列片段2，以及I-sceI识别序列；在其3’端加上(5’→3’)I-sceI识别序列及与基因B的5’端相同的序列片段3；

(3)扩增获得基因B的序列，其3’端加上其下游同源序列；

(4)将前述步骤(1)～(3)获得的扩增产物混合作为模板，进行PCR，获得“基因A-tetA-基因B”序列；

(5)在宿主细胞中诱导表达RED重组系统，将步骤(4)获得的“基因A-tetA-基因B”序列转入宿主细胞，使“基因A-tetA-基因B”序列整合到染色体上；

(6)诱导表达RED重组系统以及该系统中的I-sceI限制性内切酶，获得基因A和基因B发生无缝组装的融合基因。

在一个优选例中，步骤(6)之后，还包括：(7)将步骤(6)获得的基因A和基因B发生无缝组装的融合基因与其它1个或多个基因无缝组装的步骤(重复步骤(1)～(6)，以基因B替换基因A，以其它基因替换基因B)。

在另一优选例中，所述的RED重组系统是同时含有能用不同诱导剂诱导表达RED重组系统和I-sceI酶的质粒；较佳地包括：帮助质粒pTKRED。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的与基因B的5’端相同的序列片段1的长度至少为25bp，较佳地25～40bp。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的与基因B的5’端相同的序列片段2的长度至少为25bp；较佳地25～40bp。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的与基因B的5’端相同的序列片段3的长度至少为25bp；较佳地25～40bp。

在另一优选例中，所述的上游同源序列的长度至少为25bp；较佳地40～1000bp。

在另一优选例中，所述的下游同源序列的长度至少为25bp；较佳地40～1000bp。

在另一优选例中，所述的I-sceI识别序列为：TAGGGATAACAGGGTAAT或其反向互补序列。

在另一优选例中，所述的tetA的序列包括：启动子和tetA基因序列。

在另一优选例中，所述的启动子的序列如SEQ ID NO:1。

在另一优选例中，所述的tetA基因序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞；较佳地，为大肠杆菌细胞或沙门氏菌细胞。

在另一优选例中，所述的基因A为crtE，所述的基因B为crtB，所述的其它基因为crtI。

在本发明的另一方面，提供一种用于进行DNA无缝组装的试剂盒，所述试剂盒中包括：tetA基因或含有tetA基因序列的质粒；较佳地，所述的tetA基因包括启动子；更佳地，所述的启动子的序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：同时含有能用不同诱导剂诱导表达RED重组系统和I-sceI酶的质粒；较佳地包括：帮助质粒pTKRED。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：四环素类抗生素。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、本发明改造的质粒pJK58的图谱。

图1B、本发明改造的质粒pJK70的图谱。

图2、本发明的DNA无缝组装的序列拼接的原理示意图。图中，tetA区段包含了位于编码序列5’端的启动子序列(在tetA启动子的5’端加上与基因B的5’端相同的序列片段2)。

图3、本发明的DNA无缝组装实施过程的原理示意图。

图4、无缝组装(crtE、crtB和crtI组装)在细胞内完成之后，细胞在BMA培养基上进行负筛的表型。

图5、DNA无缝组装(crtE、crtB和crtI组装)后获得的组装部位序列(crtE、crtB和crtI组装)的测序结果，清楚显示出组装过程没有引入任何附加序列。

图6、把组装好的序列(crtE、crtB和crtI组装)克隆到载体pJK58上，转化到大肠杆菌中，使用阿拉伯糖诱导表达，检测番茄红素的表达情况，结果进一步表明组装是成功的。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种简便、易于操作的DNA无缝连接方法。本发明的方法可以实现多个DNA片段之间的无缝组装，或可以将多个DNA片段无缝组装到染色体上。采用本发明的方法，可以把任意长度的DNA片段整合到细胞(如E.coli)染色体上。

如本文所用，所述的“DNA”、“基因”包括了“DNA片段”、“基因片段”。

如本文所用，鉴于DNA的互补特点，所述的“基因X的5’端相同的序列”，涵盖与基因X的5’端序列完全一致的序列，或经转录或扩增后与之完全一致的序列。

本发明的方法的具体原理如图2～图3所示。

根据图2，首先，通过扩增获得基因A的序列，其5’端加上其上游同源序列；在其3’端加上一段与基因B的5’端相同的序列片段；然后，扩增获得tetA的序列，在其5’端加上(5’→3’)I-sceI识别序列及基因B的5’端序列片段；在其3’端加上(5’→3’)I-sceI识别序列与基因B的5’端相同的序列片段；第三，扩增获得基因B的序列，其3’端加上其下游同源序列；第四，将前述步骤(1)～(3)获得的扩增产物混合作为模板，进行PCR获得“基因A-tetA-基因B”序列。

根据图3，首先诱导表达RED重组系统，对前述获得的“基因A-tetA-基因B”序列整合到宿主染色体上，使用tetA正向选择，获得阳性克隆并测序确认。随后同时诱导表达RED重组系统和I-sceI限制性内切酶，I-sceI酶识别酶切位点并对序列进行剪切，再藉由RED重组系统进行同源重组，使用tetA负筛方法获得基因A和基因B发生无缝组装的宿主细胞并测序验证，从而获得基因A和基因B发生无缝组装的融合基因。

如上方法，可以实现基因A与基因B的无缝组装。

本发明中，以tetA基因作为实现基因A与基因B无缝连接的中间基因。tetA基因编码一种跨膜泵蛋白，能从细胞内将四环素类抗生素排出。作为本发明的优选方式，本发明人通过优化比较，对tetA使用了高效启动子序列，tetA序列也进行了优化选择，使得负筛效率可以达到100％。因此，作为本发明的优选方式，应用SEQ ID NO:1所示的序列作为驱动tetA基因表达的启动子，应用SEQ ID NO:2所示的序列作为tetA基因编码序列。

本发明中，使用RED重组系统进行序列重组。Red同源重组技术是一项可在染色体水平上进行遗传操作技术，只需较短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程。

本发明中，使用I-sceI限制性内切酶进行序列剪切。I-sceI识别位点含有18个碱基，所以在染色体上含有此识别位点的概率非常低，这保证了该方法能够用于基因序列在染色体上无缝组装。

本发明方法，只需要一个帮助质粒，一次转化，通过使用tetA负筛来找到最终的阳性克隆。

基于本发明的新方法，本发明还提供了一种用于进行DNA无缝组装的试剂盒，所述试剂盒中包括在本发明的方法中所应用的部分或全部的试剂。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中包括选自以下的试剂：tetA基因或含有tetA基因序列的质粒，所述的tetA基因包括启动子和tetA DNA序列；pTKRED质粒，四环素类抗生素。

所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中描述了本发明的进行DNA无缝组装的方法，以便于本领域技术人员应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

菌种

采用大肠杆菌E.coli K-12MG1655。

质粒

采用pTKRED(购买自Addgene)、pJK58(本实验室构建)、pJK70(本实验室构建)和pUCtetA(本实验室构建)。

pJK58的构建方法：bla基因通过PCR从pUC18质粒上克隆得到，前向引物包含了T4-g32终止子序列，pUCori复制子从pUC18质粒上PCR克隆得到，随后进行overlap PCR，使得前面得到的两段序列融合成一条序列。araC基因序列及阿拉伯糖诱导型启动子序列pBAD从pTKRED载体上PCR克隆获得，然后对得到的两条序列进行酶切连接，构建成质粒pJK58(见图1A)。

pJK70：以pJK58为基础，采用iBRICK的方法，把crtE、crtB和crtI组装到pJK58上形成了pJK70(见图1B)。

pUCtetA：在pUC18上连接tetA基因及所需的启动子序列，连接入HindIII和EcoRI之间，形成了新的质粒pUCtetA。

LB培养基(/L)

蛋白质(tryptone)：10g；

酵母菌(Yeast Extract)：5g；

NaCl：10g；

调节pH值到7.0，然后121℃湿热灭菌。

BMA培养基配方：

瓶A：Agar 12g；蛋白胨4g；酵母抽提物4g；加ddH₂O到400mL；

瓶B：NaCl 8g；NaH₂PO₄ 8g；加ddH₂O到400mL。

各自灭菌20分钟，冷却到适当温度后，在瓶A中加入500μl Fusaric acid(即9.6mgFusaric acid溶于dimethylformamide)，在瓶B中加入4ml 20mM ZnCl₂。然后混合瓶A和瓶B。混合好之后开始倒平板，避光，在36小时内使用这些平板。

PCR试剂使用全式金的fastPFU DNA聚合酶及配套的试剂。

实施例1、拼接crtE、crtB和crtI三个基因的引物及方法设计

本实施例中，以无缝拼接crtE、crtB和crtI三个基因为例。以tetA基因负筛技术来选择阳性克隆。先以crtE作为基因A，crtB作为基因B。

本实施例中，所涉及的各个基因的DNA序列如下：

(1)tetA基因使用的启动子序列(SEQ ID NO:1)：

ATCGTTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCTACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAG

(2)tetA基因序列(SEQ ID NO:2)：

ATGAATAGTTCGACAAAGATCGCATTGGTAATTACGTTACTCGATGCCATGGGGATTGGCCTTATCATGCCAGTCTTGCCAACGTTATTACGTGAATTTATTGCTTCGGAAGATATCGCTAACCACTTTGGCGTATTGCTTGCACTTTATGCGTTAATGCAGGTTATCTTTGCTCCTTGGCTTGGAAAAATGTCTGACCGATTTGGTCGGCGCCCAGTGCTGTTGTTGTCATTAATAGGCGCATCGCTGGATTACTTATTGCTGGCTTTTTCAAGTGCGCTTTGGATGCTGTATTTAGGCCGTTTGCTTTCAGGGATCACAGGAGCTACTGGGGCTGTCGCGGCATCGGTCATTGCCGATACCACCTCAGCTTCTCAACGCGTGAAGTGGTTCGGTTGGTTAGGGGCAAGTTTTGGGCTTGGTTTAATAGCGGGGCCTATTATTGGTGGTTTTGCAGGAGAGATTTCACCGCATAGTCCCTTTTTTATCGCTGCGTTGCTAAATATTGTCACTTTCCTTGTGGTTATGTTTTGGTTCCGTGAAACCAAAAATACACGTGATAATACAGATACCGAAGTAGGGGTTGAGACGCAATCAAATTCGGTGTACATCACTTTATTTAAAACGATGCCCATTTTGTTGATTATTTATTTTTCAGCGCAATTGATAGGCCAAATTCCCGCAACGGTGTGGGTGCTATTTACCGAAAATCGTTTTGGATGGAATAGCATGATGGTTGGCTTTTCATTAGCGGGTCTTGGTCTTTTACACTCAGTATTCCAAGCCTTTGTGGCAGGAAGAATAGCCACTAAATGGGGCGAAAAAACGGCAGTACTGCTCGGATTTATTGCAGATAGTAGTGCATTTGCCTTTTTAGCGTTTATATCTGAAGGTTGGTTAGTTTTCCCTGTTTTAATTTTATTGGCTGGTGGTGGGATCGCTTTACCTGCATTACAGGGAGTGATGTCTATCCAAACAAAGAGTCATCAGCAAGGTGCTTTACAGGGATTATTGGTGAGCCTTACCAATGCAACCGGTGTTATTGGCCCATTACTGTTTGCTGTTATTTATAATCATTCACTACCAATTTGGGATGGCTGGATTTGGATTATTGGTTTAGCGTTTTACTGTATTATTATCCTGCTATCAATGACCTTCATGTTGACCCCTCAAGCTCAGGGGAGTAAACAGGAGACAAGTGCTTAG(SEQ ID NO:2)

(3)crtE基因序列(SEQ ID NO:3)

ATGACGGTCTGCGCAAAAAAACACGTTCATCTCACTCGCGATGCTGCGGAGCAGTTACTGGCTGATATTGATCGACGCCTTGATCAGTTATTGCCCGTGGAGGGAGAACGGGATGTTGTGGGTGCCGCGATGCGTGAAGGTGCGCTGGCACCGGGAAAACGTATTCGCCCCATGTTGCTGTTGCTGACCGCCCGCGATCTGGGTTGCGCTGTCAGCCATGACGGATTACTGGATTTGGCCTGTGCGGTGGAAATGGTCCACGCGGCTTCGCTGATCCTTGACGATATGCCCTGCATGGACGATGCGAAGCTGCGGCGCGGACGCCCTACCATTCATTCTCATTACGGAGAGCATGTGGCAATACTGGCGGCGGTTGCCTTGCTGAGTAAAGCCTTTGGCGTAATTGCCGATGCAGATGGCCTCACGCCGCTGGCAAAAAATCGGGCGGTTTCTGAACTGTCAAACGCCATCGGCATGCAAGGATTGGTTCAGGGTCAGTTCAAGGATCTGTCTGAAGGGGATAAGCCGCGCAGCGCTGAAGCTATTTTGATGACGAATCACTTTAAAACCAGCACGCTGTTTTGTGCCTCCATGCAGATGGCCTCGATTGTTGCGAATGCCTCCAGCGAAGCGCGTGATTGCCTGCATCGTTTTTCACTTGATCTTGGTCAGGCATTTCAACTGCTGGACGATTTGACCGATGGCATGACCGACACCGGTAAGGATAGCAATCAGGACGCCGGTAAATCGACGCTGGTCAATCTGTTAGGCCCGAGGGCGGTTGAAGAACGTCTGAGACAACATCTTCAGCTTGCCAGTGAGCATCTCTCTGCGGCCTGCCAACACGGGCACGCCACTCAACATTTTATTCAGGCCTGGTTTGACAAAAAACTCGCTGCCGTCAGTTAA

(4)crtB基因序列(SEQ ID NO:4)

ATGAATAATCCGTCGTTACTCAATCATGCGGTCGAAACGATGGCAGTTGGCTCGAAAAGTTTTGCGACAGCCTCAAAGTTATTTGATGCAAAAACCCGGCGCAGCGTACTGATGCTCTACGCCTGGTGCCGCCATTGTGACGATGTTATTGACGATCAGACGCTGGGCTTTCAGGCCCGGCAGCCTGCCTTACAAACGCCCGAACAACGTCTGATGCAACTTGAGATGAAAACGCGCCAGGCCTATGCAGGATCGCAGATGCACGAACCGGCGTTTGCGGCTTTTCAGGAAGTGGCTATGGCTCATGATATCGCCCCGGCTTACGCGTTTGATCATCTGGAAGGCTTCGCCATGGATGTACGCGAAGCGCAATACAGCCAACTGGATGATACGCTGCGCTATTGCTATCACGTTGCAGGCGTTGTCGGCTTGATGATGGCGCAAATCATGGGCGTGCGGGATAACGCCACGCTGGACCGCGCCTGTGACCTTGGGCTGGCATTTCAGTTGACCAATATTGCTCGCGATATTGTGGACGATGCGCATGCGGGCCGCTGTTATCTGCCGGCAAGCTGGCTGGAGCATGAAGGTCTGAACAAAGAGAATTATGCGGCACCTGAAAACCGTCAGGCGCTGAGCCGTATCGCCCGTCGTTTGGTGCAGGAAGCAGAACCTTACTATTTGTCTGCCACAGCCGGCCTGGCAGGGTTGCCCCTGCGTTCCGCCTGGGCAATCGCTACGGCGAAGCAGGTTTACCGGAAAATAGGTGTCAAAGTTGAACAGGCCGGTCAGCAAGCCTGGGATCAGCGGCAGTCAACGACCACGCCCGAAAAATTAACGCTGCTGCTGGCCGCCTCTGGTCAGGCCCTTACTTCCCGGATGCGGGCTCATCCTCCCCGCCCTGCGCATCTCTGGCAGCGCCCGCTCTAG

(5)crtI基因序列(SEQ ID NO:5)

ATGAAACCAACTACGGTAATTGGTGCAGGCTTCGGTGGCCTGGCACTGGCAATTCGTCTACAAGCTGCGGGGATCCCCGTCTTACTGCTTGAACAACGTGATAAACCCGGCGGTCGGGCTTATGTCTACGAGGATCAGGGGTTTACCTTTGATGCAGGCCCGACGGTTATCACCGATCCCAGTGCCATTGAAGAACTGTTTGCACTGGCAGGAAAACAGTTAAAAGAGTATGTCGAACTGCTGCCGGTTACGCCGTTTTACCGCCTGTGTTGGGAGTCAGGGAAGGTCTTTAATTACGATAACGATCAAACCCGGCTCGAAGCGCAGATTCAGCAGTTTAATCCCCGCGATGTCGAAGGTTATCGTCAGTTTCTGGACTATTCACGCGCGGTGTTTAAAGAAGGCTATCTAAAGCTCGGTACTGTCCCTTTTTTATCGTTCAGAGACATGCTTCGCGCCGCACCTCAACTGGCGAAACTGCAAGCATGGAGAAGCGTTTACAGTAAGGTTGCCAGTTACATCGAAGATGAACATCTGCGCCAGGCGTTTTCTTTCCACTCGCTGTTGGTGGGCGGCAATCCCTTCGCCACCTCATCCATTTATACGTTGATACACGCGCTGGAGCGTGAGTGGGGCGTCTGGTTTCCGCGTGGCGGCACCGGCGCATTAGTTCAGGGGATGATAAAGCTGTTTCAGGATCTGGGTGGCGAAGTCGTGTTAAACGCCAGAGTCAGCCATATGGAAACGACAGGAAACAAGATTGAAGCCGTGCATTTAGAGGACGGTCGCAGGTTCCTGACGCAAGCCGTCGCGTCAAATGCAGATGTGGTTCATACCTATCGCGACCTGTTAAGCCAGCACCCTGCCGCGGTTAAGCAGTCCAACAAACTGCAAACTAAGCGCATGAGTAACTCTCTGTTTGTGCTCTATTTTGGTTTGAATCACCATCATGATCAGCTCGCGCATCACACGGTTTGTTTCGGCCCGCGTTACCGCGAGCTGATTGACGAAATTTTTAATCATGATGGCCTCGCAGAGGACTTCTCACTTTATCTGCACGCGCCCTGTGTCACGGATTCGTCACTGGCGCCTGAAGGTTGCGGCAGTTACTATGTGTTGGCGCCGGTGCCGCATTTAGGCACCGCGAACCTCGACTGGACGGTTGAGGGGCCAAAACTACGCGACCGTATTTTTGCGTACCTTGAGCAGCATTACATGCCTGGCTTACGGAGTCAGCTGGTCACGCACCGGATGTTTACGCCGTTTGATTTTCGCGACCAGCTTAATGCCTATCATGGCTCAGCCTTTTCTGTGGAGCCCGTTCTTACCCAGAGCGCCTGGTTTCGGCCGCATAACCGCGATAAAACCATTACTAATCTCTACCTGGTCGGCGCAGGCACGCATCCCGGCGCAGGCATTCCTGGCGTCATCGGCTCGGCAAAAGCGACAGCAGGTTTGATGCTGGAGGATCTGATATGA

本实施例中所使用的引物如下：

(1)第一轮中，用于连接crtE与crtB的引物

用于扩增上游同源序列的引物(该引物扩增后，可以在crtE的加上上游同源序列)：

crtE-H-F1：TGTCGGCGTGTAGTAGTGAACCTGTTC(SEQ ID NO:6)；

crtE-H-R1：GCAGACCGTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTTCTTGCCGCTCC

CCTGCATT(SEQ ID NO:7)。

用于扩增crtE的引物(该引物扩增后，可以在crtE的3’端加上一段crtB的5’端相同的序列片段)：

crtE-F：AATGCAGGGGAGCGGCAAGAAAAGAGGAGAAATACTAGATGA

CGGTCTGCG(SEQ ID NO:8)；

crtE-R1：ACGACGGATTATTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTTTAACTGACG

GCAGCGAGTTTTTTGT(SEQ ID NO:9)；

crtE-R2：GTTATCCCTAACCGCATGATTGAGTAACGACGGATTATTCA

TCTAGTATTTCTCCTCTTT(SEQ ID NO:10)；在crtE-R1和crtE-R2中下划线标示的序列用于在crtE的3’端加上一段crtB的5’端相同的序列片段。

用于扩增tetA及其启动子的引物(第一轮)(该引物扩增后，可以在tetA的两端加上I-sceI识别序列及crtB的5’端序列片段)：

tetA-F1：ATGAATAATCCGTCGTTACTCAATCATGCGGTTAGGGATAACA

GGGTAATATCGTTG(SEQ ID NO:11)；其中，曲线下划线标示序列为crtB编码区的1-32区间，直线下划线标示序列为I-sceI识别序列。

tetA-R1：ATTATTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTATTACCCTGTTATCCC

TACTAAGCACTTGTCTC(SEQ ID NO:12)；其中，直线下划线标示序列为crtB的1-9区间的反向互补序列，曲线双下划线标示序列为I-sceI识别序列。

用于扩增crtB的引物：

crtB-F1：ATAACAGGGTAATAAAGAGGAGAAATACTAGATGAATAAT

CCGTCGTTACTCAATCATGC(SEQ ID NO:13)；

crtB-R1：CTTAAATGTGATTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTCTAGAG

CGGGCGCTGCCAG(SEQ ID NO:14)；其中，下划线部分用于在crtB序列的3’端加上其下游同源序列。

用于扩增下游同源序列的引物：

crtB-H-F1：TCTGGCAGCGCCCGCTCTAGAAGACTTTCTCCAGTGATGT

TGAATCACATTT(SEQ ID NO:15)；

crtB-H-R1：CAATTTCGCCAGACAAGCAGAATCAAG(SEQ ID NO:16)。

(2)第二轮，用于将crtI连接到crtE-crtB所需的引物

第二轮用于扩增上游同源序列的引物：

tetA-H-F：CTATGCAGGATCGCAGATGCACGAA(SEQ ID NO:17)；

tetA-H-R1：ACCGTAGTTGGTTTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTAGAGCGGGCGCTGCCAGAG(SEQ ID NO:18)；

tetA-H-R2：GCCACCGAAGCCTGCACCAATTACCGTAGTTGGTTTCATCTAGTATTTCTCCTCTTT(SEQ ID NO:19)；

tetA-H-R3：GTCAACGATATTACCCTGTTATCCCTAGCCACCGAAGCCTGCACCAATT(SEQ IDNO:20)；

用于扩增tetA的引物(第二轮)：

tetA-F2：AATTGGTGCAGGCTTCGGTGGCTAGGGATAACAGGGTAATATCGTTGACGG(SEQ IDNO:21)；

tetA-R2：ATTACCCTGTTATCCCTACTAAGCACTTGTCTC(SEQ ID NO:22)。

用于扩增crtI序列：

crtI-F1：GATAACAGGGTAATAAAGAGGAGAAATACTAGATGAAACCAACTACGGTAATTGGTGCAG(SEQ ID NO:23)；

crtI-F2：AAACAGGAGACAAGTGCTTAGTAGGGATAACAGGGTAATAAAGAGGAGAAATACTAGATG(SEQ ID NO:24)；

crtI-R1：GTGATTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTTCATATCAGATCCTCCAGCATCAAACCT(SEQID NO:25)；

用于扩增下游同源序列(第二轮)：

crtI-H-F1：AGGTTTGATGCTGGAGGATCTGATATGAAAGACTTTCTCCAGTGATGTTGAATCACATTT(SEQ ID NO:26)；

反向引物使用crtB-H-R1。

(3)克隆到载体的引物

组装好的crtE、crtB和crtI基因克隆到载体pJK58所用的引物：

crtEBI-f1：TACCTTGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGTAAAGAGGAGAAATACTAGATGACGGTCTGC(SEQ ID NO:27)；

crtEBI-r1：TAGGATACCCATAATACCCATAATAGCTGTTTGCCATCATA

TCAGATCCTCCAGCATCAAACCT(SEQ ID NO:28)。

实施例2、DNA片段制备

根据图2所示，首先进行PCR，扩增得到所需要的DNA序列。PCR共分为两轮。

1、第一轮

(1)、获得crtE序列及其上游同源序列的融合序列

以E.coli染色体为模板，使用引物crtE-H-F1和crtE-H-R1扩增出crtE的上游同源序列；

以pJK70为模板，使用crtE-F和crtE-R1、crtE-R2扩增得到crtE序列；

然后，通过overlap-PCR的方法，把crtE序列及其上游同源序列融合在一起。

(2)、获得tetA基因序列

以pUCtetA为模板，使用tetA-F1和tetA-R1扩增出tetA基因。

(3)、获得crtB与其下游同源序列的融合序列

以pJK70为模板，使用crtB-F1和crtB-R1扩增出crtB序列；

以E.coli染色体为模板，使用crtB-H-F1和crtB-H-R1扩增出crtB下游同源序列；

然后，通过overlap-PCR的方法，把crtB与其下游同源序列融合在一起。

(4)、进一步融合

使用前述获得的三个PCR产物适当比例混合在一起作为模板，以crtE-H-F1和crtB-H-R1分别作为前向和反向引物，采用touchdown PCR方法，将前面获得的三个PCR产物融合在一起，形成“上游同源序列+crtE+tetA+crtB+下游同源序列”DNA序列片段。

2、第二轮

采用实施例1所列的第二轮的引物，在第一轮经过转化诱导组装筛选之后的基础上进行PCR，采用与前述类似的方法，形成“上游同源序列+tetA+crtI+下游同源序列”，以便进行第二轮的转化诱导组装筛选。

实施例2、转化

根据图3进行，首先将质粒pTKRED转化入E.coli K-12，然后使用IPTG(终浓度1mM)诱导RED重组系统表达。之后，制作电转化感受态，将实施例1第1轮制备的DNA片段电转入，在含有四环素(终浓度10μg/ml)的平板上筛选阳性克隆，测序确定DNA片段是否准确整合到E.coli染色体上设定位点。

对于正确的克隆，过夜培养，同时加入IPTG(终浓度1mM)和阿拉伯糖(终浓度0.2％)诱导RED重组系统和I-sceI酶表达，随后取适量培养基，梯度稀释，在BMA平板上进行负筛，对于长出来的克隆进行测序验证，确定crtE和crtB基因无缝组装成功。

随后，使用测序正确的菌株作为宿主，使用第二轮PCR产生的DNA片段，依照上述类似的方法，进行第二轮的转化诱导筛选测序验证，确定crtI与crtE-crtB无缝组装成功。

由于本发明人使用了优化选择的启动子和tetA基因序列，在BMA培养基上负筛的效率能够达到100％。负筛表型见图4。测序结果见图5。

上述结果说明，本发明的方法进行DNA无缝组装是可行的，而且筛选效率是高的。

实施例3、诱导进一步验证

由于本发明人使用了crtE、crtB和crtI组装作为实例，这三个基因表达可以产生番茄红素，本发明人把组装好的序列克隆到载体pJK58上，转化到大肠杆菌中，使用阿拉伯糖诱导表达。

结果如图6所示，可以看到番茄红素得到了表达。

进一步地，本发明人对菌体进行裂解，并用乙酸乙酯进行抽提，进行LC-MS表征，结果显示产生番茄红素。这说明本发明人的组装方法是正确的，可以推广用的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 体内DNA无缝组装方法

<130> 174587

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> tetA基因启动子

<400> 1

atcgttgacg gctagctcag tcctaggtac agtgctagct actagagaaa gaggagaaat 60

actag 65

<210> 2

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> tetA基因序列

<400> 2

atgaatagtt cgacaaagat cgcattggta attacgttac tcgatgccat ggggattggc 60

cttatcatgc cagtcttgcc aacgttatta cgtgaattta ttgcttcgga agatatcgct 120

aaccactttg gcgtattgct tgcactttat gcgttaatgc aggttatctt tgctccttgg 180

cttggaaaaa tgtctgaccg atttggtcgg cgcccagtgc tgttgttgtc attaataggc 240

gcatcgctgg attacttatt gctggctttt tcaagtgcgc tttggatgct gtatttaggc 300

cgtttgcttt cagggatcac aggagctact ggggctgtcg cggcatcggt cattgccgat 360

accacctcag cttctcaacg cgtgaagtgg ttcggttggt taggggcaag ttttgggctt 420

ggtttaatag cggggcctat tattggtggt tttgcaggag agatttcacc gcatagtccc 480

ttttttatcg ctgcgttgct aaatattgtc actttccttg tggttatgtt ttggttccgt 540

gaaaccaaaa atacacgtga taatacagat accgaagtag gggttgagac gcaatcaaat 600

tcggtgtaca tcactttatt taaaacgatg cccattttgt tgattattta tttttcagcg 660

caattgatag gccaaattcc cgcaacggtg tgggtgctat ttaccgaaaa tcgttttgga 720

tggaatagca tgatggttgg cttttcatta gcgggtcttg gtcttttaca ctcagtattc 780

caagcctttg tggcaggaag aatagccact aaatggggcg aaaaaacggc agtactgctc 840

ggatttattg cagatagtag tgcatttgcc tttttagcgt ttatatctga aggttggtta 900

gttttccctg ttttaatttt attggctggt ggtgggatcg ctttacctgc attacaggga 960

gtgatgtcta tccaaacaaa gagtcatcag caaggtgctt tacagggatt attggtgagc 1020

cttaccaatg caaccggtgt tattggccca ttactgtttg ctgttattta taatcattca 1080

ctaccaattt gggatggctg gatttggatt attggtttag cgttttactg tattattatc 1140

ctgctatcaa tgaccttcat gttgacccct caagctcagg ggagtaaaca ggagacaagt 1200

gcttag 1206

<210> 3

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> crtE基因序列

<400> 3

atgacggtct gcgcaaaaaa acacgttcat ctcactcgcg atgctgcgga gcagttactg 60

gctgatattg atcgacgcct tgatcagtta ttgcccgtgg agggagaacg ggatgttgtg 120

ggtgccgcga tgcgtgaagg tgcgctggca ccgggaaaac gtattcgccc catgttgctg 180

ttgctgaccg cccgcgatct gggttgcgct gtcagccatg acggattact ggatttggcc 240

tgtgcggtgg aaatggtcca cgcggcttcg ctgatccttg acgatatgcc ctgcatggac 300

gatgcgaagc tgcggcgcgg acgccctacc attcattctc attacggaga gcatgtggca 360

atactggcgg cggttgcctt gctgagtaaa gcctttggcg taattgccga tgcagatggc 420

ctcacgccgc tggcaaaaaa tcgggcggtt tctgaactgt caaacgccat cggcatgcaa 480

ggattggttc agggtcagtt caaggatctg tctgaagggg ataagccgcg cagcgctgaa 540

gctattttga tgacgaatca ctttaaaacc agcacgctgt tttgtgcctc catgcagatg 600

gcctcgattg ttgcgaatgc ctccagcgaa gcgcgtgatt gcctgcatcg tttttcactt 660

gatcttggtc aggcatttca actgctggac gatttgaccg atggcatgac cgacaccggt 720

aaggatagca atcaggacgc cggtaaatcg acgctggtca atctgttagg cccgagggcg 780

gttgaagaac gtctgagaca acatcttcag cttgccagtg agcatctctc tgcggcctgc 840

caacacgggc acgccactca acattttatt caggcctggt ttgacaaaaa actcgctgcc 900

gtcagttaa 909

<210> 4

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> crtB基因序列

<400> 4

atgaataatc cgtcgttact caatcatgcg gtcgaaacga tggcagttgg ctcgaaaagt 60

tttgcgacag cctcaaagtt atttgatgca aaaacccggc gcagcgtact gatgctctac 120

gcctggtgcc gccattgtga cgatgttatt gacgatcaga cgctgggctt tcaggcccgg 180

cagcctgcct tacaaacgcc cgaacaacgt ctgatgcaac ttgagatgaa aacgcgccag 240

gcctatgcag gatcgcagat gcacgaaccg gcgtttgcgg cttttcagga agtggctatg 300

gctcatgata tcgccccggc ttacgcgttt gatcatctgg aaggcttcgc catggatgta 360

cgcgaagcgc aatacagcca actggatgat acgctgcgct attgctatca cgttgcaggc 420

gttgtcggct tgatgatggc gcaaatcatg ggcgtgcggg ataacgccac gctggaccgc 480

gcctgtgacc ttgggctggc atttcagttg accaatattg ctcgcgatat tgtggacgat 540

gcgcatgcgg gccgctgtta tctgccggca agctggctgg agcatgaagg tctgaacaaa 600

gagaattatg cggcacctga aaaccgtcag gcgctgagcc gtatcgcccg tcgtttggtg 660

caggaagcag aaccttacta tttgtctgcc acagccggcc tggcagggtt gcccctgcgt 720

tccgcctggg caatcgctac ggcgaagcag gtttaccgga aaataggtgt caaagttgaa 780

caggccggtc agcaagcctg ggatcagcgg cagtcaacga ccacgcccga aaaattaacg 840

ctgctgctgg ccgcctctgg tcaggccctt acttcccgga tgcgggctca tcctccccgc 900

cctgcgcatc tctggcagcg cccgctctag 930

<210> 5

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> crtI基因序列

<400> 5

atgaaaccaa ctacggtaat tggtgcaggc ttcggtggcc tggcactggc aattcgtcta 60

caagctgcgg ggatccccgt cttactgctt gaacaacgtg ataaacccgg cggtcgggct 120

tatgtctacg aggatcaggg gtttaccttt gatgcaggcc cgacggttat caccgatccc 180

agtgccattg aagaactgtt tgcactggca ggaaaacagt taaaagagta tgtcgaactg 240

ctgccggtta cgccgtttta ccgcctgtgt tgggagtcag ggaaggtctt taattacgat 300

aacgatcaaa cccggctcga agcgcagatt cagcagttta atccccgcga tgtcgaaggt 360

tatcgtcagt ttctggacta ttcacgcgcg gtgtttaaag aaggctatct aaagctcggt 420

actgtccctt ttttatcgtt cagagacatg cttcgcgccg cacctcaact ggcgaaactg 480

caagcatgga gaagcgttta cagtaaggtt gccagttaca tcgaagatga acatctgcgc 540

caggcgtttt ctttccactc gctgttggtg ggcggcaatc ccttcgccac ctcatccatt 600

tatacgttga tacacgcgct ggagcgtgag tggggcgtct ggtttccgcg tggcggcacc 660

ggcgcattag ttcaggggat gataaagctg tttcaggatc tgggtggcga agtcgtgtta 720

aacgccagag tcagccatat ggaaacgaca ggaaacaaga ttgaagccgt gcatttagag 780

gacggtcgca ggttcctgac gcaagccgtc gcgtcaaatg cagatgtggt tcatacctat 840

cgcgacctgt taagccagca ccctgccgcg gttaagcagt ccaacaaact gcaaactaag 900

cgcatgagta actctctgtt tgtgctctat tttggtttga atcaccatca tgatcagctc 960

gcgcatcaca cggtttgttt cggcccgcgt taccgcgagc tgattgacga aatttttaat 1020

catgatggcc tcgcagagga cttctcactt tatctgcacg cgccctgtgt cacggattcg 1080

tcactggcgc ctgaaggttg cggcagttac tatgtgttgg cgccggtgcc gcatttaggc 1140

accgcgaacc tcgactggac ggttgagggg ccaaaactac gcgaccgtat ttttgcgtac 1200

cttgagcagc attacatgcc tggcttacgg agtcagctgg tcacgcaccg gatgtttacg 1260

ccgtttgatt ttcgcgacca gcttaatgcc tatcatggct cagccttttc tgtggagccc 1320

gttcttaccc agagcgcctg gtttcggccg cataaccgcg ataaaaccat tactaatctc 1380

tacctggtcg gcgcaggcac gcatcccggc gcaggcattc ctggcgtcat cggctcggca 1440

aaagcgacag caggtttgat gctggaggat ctgatatga 1479

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

tgtcggcgtg tagtagtgaa cctgttc 27

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 7

gcagaccgtc atctagtatt tctcctcttt tcttgccgct cccctgcatt 50

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 8

aatgcagggg agcggcaaga aaagaggaga aatactagat gacggtctgc g 51

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 9

acgacggatt attcatctag tatttctcct ctttttaact gacggcagcg agttttttgt 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 10

gttatcccta accgcatgat tgagtaacga cggattattc atctagtatt tctcctcttt 60

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 11

atgaataatc cgtcgttact caatcatgcg gttagggata acagggtaat atcgttg 57

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 12

attattcatc tagtatttct cctctttatt accctgttat ccctactaag cacttgtctc 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 13

ataacagggt aataaagagg agaaatacta gatgaataat ccgtcgttac tcaatcatgc 60

<210> 14

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 14

cttaaatgtg attcaacatc actggagaaa gtcttctaga gcgggcgctg ccag 54

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 15

tctggcagcg cccgctctag aagactttct ccagtgatgt tgaatcacat tt 52

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 16

caatttcgcc agacaagcag aatcaag 27

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 17

ctatgcagga tcgcagatgc acgaa 25

<210> 18

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 18

accgtagttg gtttcatcta gtatttctcc tctttctaga gcgggcgctg ccagag 56

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 19

gccaccgaag cctgcaccaa ttaccgtagt tggtttcatc tagtatttct cctcttt 57

<210> 20

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 20

gtcaacgata ttaccctgtt atccctagcc accgaagcct gcaccaatt 49

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 21

aattggtgca ggcttcggtg gctagggata acagggtaat atcgttgacg g 51

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 22

attaccctgt tatccctact aagcacttgt ctc 33

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 23

gataacaggg taataaagag gagaaatact agatgaaacc aactacggta attggtgcag 60

<210> 24

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 24

aaacaggaga caagtgctta gtagggataa cagggtaata aagaggagaa atactagatg 60

<210> 25

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 25

gtgattcaac atcactggag aaagtctttc atatcagatc ctccagcatc aaacct 56

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 26

aggtttgatg ctggaggatc tgatatgaaa gactttctcc agtgatgttg aatcacattt 60

<210> 27

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 27

taccttggca aacagctatt atgggtatta tgggtaaaga ggagaaatac tagatgacgg 60

tctgc 65

<210> 28

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 28

taggataccc ataataccca taatagctgt ttgccatcat atcagatcct ccagcatcaa 60

acct 64

Claims

1.一种DNA无缝组装方法，其特征在于，所述方法包括：

(2)扩增获得tetA的序列，在其5’端加上I-sceI识别序列及一段与基因B的5’端相同的序列片段2；在其3’端加上I-sceI识别序列与基因B的5’端相同的序列片段3；

(3)扩增获得基因B的序列，其3’端加上其下游同源序列；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)之后，还包括：

(7)将步骤(6)获得的基因A和基因B发生无缝组装的融合基因与其它1个或多个基因无缝组装的步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的RED重组系统是同时含有能用不同诱导剂诱导表达RED重组系统和I-sceI酶的质粒；较佳地包括：帮助质粒pTKRED。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的I-sceI识别序列为：TAGGGATAACAGGGTAAT或其反向互补序列；或

所述的tetA的序列包括：启动子和tetA基因序列。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的启动子的序列如SEQ ID NO:1。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的tetA基因序列如SEQ ID NO:2所示。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是原核细胞；较佳地，为大肠杆菌细胞或沙门氏菌细胞。

8.一种用于进行DNA无缝组装的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：

tetA基因或含有tetA基因序列的质粒；较佳地，所述的tetA基因包括启动子；更佳地，所述的启动子的序列如SEQ ID NO:1所示。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：同时含有能用不同诱导剂诱导表达RED重组系统和I-sceI酶的质粒。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的质粒包括：帮助质粒pTKRED；较佳地，所述试剂盒中还包括：四环素类抗生素。