CN104404029A - 一种基于甲基化环状dna分子的突变方法 - Google Patents
一种基于甲基化环状dna分子的突变方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法：a）PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA：以甲基化环状DNA为模板，使用带突变位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增；b）将步骤a）的PCR产物使用限制性内切酶DpnI消化，去除甲基化模板；c）将步骤b）中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。本发明的方法可实现一步多点突变，且操作简单，突变率高，单点突变阳性率95%以上，相距1kb以上两点、三点突变阳性率在60%以上。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法。
背景技术
体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，是探索启动子调节位点的有效手段，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，进而改变蛋白质的功能。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等方面。目前定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变、盒式突变。
寡核苷酸引物介导的定点突变，首先要把含有待突变的DNA片段克隆到M13噬菌体载体中。M13噬菌体的正链可以去感染具有性纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而留存在噬菌体内的则是双链状态的复制性M13，受M13感染的细菌生长减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。将目的DNA插入到复制型M13的多克隆位点上，去转染细菌，提取单链DNA作为突变的模板。根据需要合成带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使之与带有目的DNA的单链M13模板杂交，然后加入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸，使杂交上的突变引物得以延伸，并用DNA连接酶使新合成的DNA成环，再去转染细菌。可用DNA序列分析方法从得到的噬菌体中筛选出带有突变DNA相应的片段，从而得到完整的DNA突变体。
PCR介导的定点突变是利用四种引物，进行三轮的PCR反应，其中头两轮分别扩增出彼此重叠的DNA片段，第三轮PCR使这两条片段融合起来。它在前两轮的PCR中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，两者在其重叠区段具有相同的突变。由于具有重叠的序列，所以在去除了未参入的多余引物后，这两条双链DNA片段经变性和退火处理，便可能形成两种不同形式的异源双链分子。其中一种具5，凹陷末端的双链分子，不能作为TaqDNA聚合酶的底物；另一种具有3，凹陷末端的双链分子，可通过TaqDNA聚合酶的延伸作用，产生出具两重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三轮PCR扩增，偏可产生出一种突变位点远离片段末端的突变体DNA。
盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。
三种方法各有优点，寡核苷酸介导的方法保真度高；PCR介导的方法操作简单，突变成功率高；盒式方法简单易行，突变效率高。但它们也各自存在着很大的缺点，寡核苷酸介导的方法操作复杂，周期长；PCR介导的方法后续工作复杂，TaqDNA聚合酶保真性低；盒式方法需合成多条引物成本高，受到酶切位点的限制。
综上所述，亟需一种操作简单、保真性好，且能实现一步多点突变的方法，但是目前关于这种方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法，包括以下步骤：
a）PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA：以甲基化环状DNA为模板，使用带突变位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA 连接酶进行扩增；
b）将步骤a）的PCR产物使用限制性内切酶Dpn I消化，去除甲基化模板；
c）将步骤b）中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。
步骤a）中，所述的高保真的耐热DNA聚合酶为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。
所述的高保真的耐热DNA聚合酶与高温 DNA 连接酶的添加比例为：酶活力单位比1：60。
所述的高温DNA连接酶为Taq DNA Ligase 连接酶或9°N DNA 连接酶。
所述的突变引物是以甲基化环状DNA为模板设计的单条引物，在突变位点前后各保留16~20个与模板配对的碱基。
步骤b）中，使用限制性内切酶Dpn I消化的时间为5分钟至过夜。
步骤c）中，所述的消化产物是直接转入感受态细胞中。
PCR反应的体系中还包含反应缓冲液、GC反应缓冲液、dNTP、ATP、NAD+。
需要说明的是，本发明中，PCR反应的模板一定要甲基化，若非甲基化的DNA模板，可先转化dam＋的大肠杆菌菌株再抽提获得；尽量采用高纯度、浓度大约为50～100 ng/μl的质粒；若模板大于15 kb，需将所需突变序列亚克隆到较小的载体中实施。所述的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase其保真性能和扩增效率俱佳。
本发明优点在于：本发明的方法不但具有普通定点突变的功能，而且当遇到多个位点突变的需求时，也可以实现一步多点突变，解决了普通单点突变只能对目标位点逐一引入突变，耗时费力的问题，且操作简单，突变率高，单点突变阳性率95%以上，相距1kb以上两点、三点突变阳性率在60%以上。
附图说明
附图1是本发明的原理与操作简示图。
附图2是实施例1中氨基酸突变后的3个单菌落测序比对结果图。
附图3是实施例1中氨基酸突变3菌落测序原始峰图。
附图4是引物设计举例。
附图5是引物设计前原始模板序列及设计后突变引物序列比对图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明技术方案的总体思路为：制备甲基化模板，针对每一个目标突变只合成一条突变引物，再利用保真性能和扩增效率俱佳的耐热DNA聚合酶，快速合成与模板互补的带有特定突变的环状单链DNA (30 sec/1 kb)，最大限度地保持扩增质粒的保真性，大大缩短反应时间。经过多个PCR循环反应后，带有特定突变的环状单链DNA数目成倍增长。PCR反应结束后，采用限制性内切酶Dpn I消化甲基化的模板，而带有突变的环状单链DNA则通过转化大肠杆菌体，在其体内修复为环状双链DNA，最终得到带有突变组的DNA质粒。
一、试剂准备
1、突变混合酶的配制：2 U/μl Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB M0530)与40U/μl Taq DNA Ligase 连接酶 (NEB M0208)或者40U/μl 9°N DNA 连接酶 (NEB M0238)按照体积比1:3配制，如果配制10次的突变酶用2.5μl的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase加上7.5μl的Taq DNA Ligase 连接酶或者9°N DNA连接酶。
2、突变dNTP配制：10mM dNTP Mix（EXCELL MB021-0014）2.5μl，50 μM β-Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)(NEB B9007)5μl，灭菌双蒸水2.5μl；或者10mM dNTP Mix（EXCELL MB021-0014）2.5μl，10 μM ATP(NEB P0756)5μl，灭菌双蒸水2.5μl。
3、突变buffer用Phusion酶自带的5×Buffer。
4、模板消化用酶用FastDigest Dpn I(MBI FD1704)。
二、模板准备
1）请使用15 kb以下的质粒作为模板；如果模板质粒过大，可将所需突变的序列亚克隆到较小的载体中，完成突变后再克隆到目的载体中；或者在将近对称位置设计一条与模板完全互补的引物完成突变。
2）对于非甲基化的质粒(例如从大肠杆菌JM110或SCS110菌株中提取的质粒)，可通过转化dam＋的大肠杆菌菌株(如DH5α、TOP10、JM109、XL1?Blue等)，再抽提获得甲基化的质粒作为PCR反应模板。
3）尽量采用高纯度的模板质粒，浓度调整为50~100 ng/μl。
三、引物设计原则
1）在所突变的碱基前后需要各保留16~20个与模板互补的碱基；
2）多个突变引物的设计必须以质粒的同一条链为模板，向同一个方向延伸；
3）如果两个或两个以上的引物在同一个反应中的时候，它们突变位点之间的距离需在60 bp以上。如果两个引物之间距离在60 bp之内，就需要进行两个反应进行PCR。在其中一个引物的PCR完成以后，把PCR产物抽提以后作为模板加入另一个引物进行下一个PCR反应。如果有5个以上的突变位点，应当进行两个PCR反应；
4）引物的3'端应包含至少一个G或C碱基，尽量避免三个以上的重复碱基，以免错配；
5）尽量将引物的GC含量控制在40~60％；
6）请使用经过PAGE或HPLC纯化的引物，否则会降低突变阳性率。
引物设计举例见图4。
四、定点突变反应
1）PCR反应体系：向PCR薄壁管中依次加入下列试剂：
实验组：
对GC含量偏高的质粒模板，可使用GC Reaction Buffer。
2）混匀后加入 1 μl突变混合酶，混匀，短暂离心后放入PCR仪中。
3）PCR循环参数的设置：
…退火温度取决于多个引物中最低的Tm值；
……例如：5 kb质粒延伸的时间为2.5 min；
………15 cycles：单个碱基突变；
18 cycles：单个氨基酸 (三个连续碱基) 的突变；
≥18 cycles：多个位点突变。
五、待反应冷却至室温以下后，加入1 μl Dpn I酶，混匀后短暂离心，37℃温育5分钟(也可反应过夜)。Dpn I酶消化完毕后可以直接用于转化，或于℃保存备用。
六、转化、培养
1）解冻感受态细胞，解冻条件为水浴25℃，35秒，或在烧杯内(室温水)或自来水冲洗管身，观察冰晶解冻超过1/2或将近全溶即可，但解冻后到操作完涂平板前，尽量插在冰上避免失温造成效率变差；
2）加入1.5 μl消化后的DNA；
3）1000～1200 rpm 漩涡混匀 1～2秒；
4）冰浴：将已加入DNA的感受态细胞整管插在冰内静置5 min；
5）热激：将感受态细胞在冰浴后放入水浴槽以42℃水浴45秒做热激；
6）将转染混合物涂布于含有适量抗生素的LB琼脂平板上(如果颜色筛查需要的话可含有IPTG 和X?gal )；
7）将平板于37℃培养过夜。若要进行蓝白斑筛查，则在37℃至少培养17小时，以便色斑的形成。
七、鉴定：根据突变的复杂程度，取数个单个菌落进行测序，以确认得到的克隆是否含有预期的突变序列。对于插入限制性内切酶位点的突变菌落，可直接挑选10个左右单克隆菌落培养，提取质粒进行酶切鉴定。
实施例1
一、试剂准备
1、突变混合酶的配制：配制10次的突变酶用2.5μl的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase加上7.5μl的Taq DNA Ligase 连接酶混匀。
2、突变dNTP配制：10mM dNTP Mix（EXCELL MB021-0014）2.5μl，50 μM β-Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) (NEB B9007)5μl，灭菌双蒸水2.5μl。
3、突变buffer用Phusion酶自带的5×Buffer。
4、模板消化用酶用FastDigest Dpn I(MBI FD1704)。
二、模板准备
1）以ORIGENE公司货号为 Cat. RG215266的质粒（长度约为8.5kb）为模板做突变。
2）以DH5α为Cat. RG215266质粒的宿主菌，并按常规培养方式培养该细菌抽提甲基化质粒模板。
3）采用捷瑞生物质粒抽提试剂盒（GK2001）抽提质粒。
三、引物设计
将上述ORIGENE公司货号为 Cat. RG215266的质粒原始序列中表达的KV4.2基因第529位半胱氨酸突变为丙氨酸，引物设计如下：
Primer529：aggagtcaccagcaccGCctgttcacgacgacac
设计前原始模板序列及设计后突变引物序列比对见图5。
四、定点突变反应
1）本实施例第529位半胱氨酸突变为丙氨酸反应体系如下：
Template Plasmid 1μl（100ng）
5×Reaction Buffer 5μl
Primer529（10μM） 1μl
突变dNTP 1μl
ddH2O 16μl
2）混匀后加入 1 μl突变混合酶，混匀，短暂离心后放入PCR仪中。
3）PCR循环参数的设置：
五、待反应冷却至室温以下后，加入1 μl Dpn I酶，混匀后短暂离心，37℃温育5分钟。Dpn I酶消化完毕后可以直接用于转化，或于℃保存备用。
六、转化、培养
1）解冻感受态细胞XL10-Gold（ExCell MB000-5321），解冻条件为水浴25℃，35秒；
2）加入1.5 μl消化后的DNA；
3）1000 rpm 漩涡混匀 2秒；
4）冰浴：将已加入DNA的感受态细胞整管插在冰内静置5 min；
5）热激：将感受态细胞在冰浴后放入水浴槽以42℃水浴45秒做热激；
6）将转染混合物涂布于含有终浓度为50ug/ml的氨苄抗生素LB琼脂平板上；
7）将平板于37℃培养过夜。
七、鉴定：
本实施例氨基酸突变后取30个单菌落测序，测序结果显示阳性率为100%，其中3个菌落测序比对结果见附图2。其中3个菌落测序原始峰图结果见附图3。将该实验重复10次，阳性率均为100%。
本专利申请受到以下两项基因支持：上海市自然科学基金项目（10ZR1439900），太仓科技创新创业领军人才项目（TCRC1306）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 依科赛生物科技（太仓）有限公司
<120> 一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法
<130> /
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctagacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcacg 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctagacgcgc cctgtaacga cgcattaagc gcacg 35
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
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<212> DNA
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caaggagtca ccagcacctg ctgttcacga cgacacaaaa aaacttt 47
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gtgtcgtcgt gaacaggcgg tgctggtgac tcct 34
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agtttttttg tgtcgtcgtg aacagcaggt gctggtgact ccttgttgtg aaga 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agtttttttg tgtcgtcgtg aacaggcggt gctggtgact ccttgttgtg aaga 54
Claims (8)
1.一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA：以甲基化环状DNA为模板，使用带突变位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增；
b）将步骤a）的PCR产物使用限制性内切酶Dpn I消化，去除甲基化模板；
c）将步骤b）中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。
2. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤a）中，所述的高保真的耐热DNA聚合酶为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。
3. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤a）中，所述的高温DNA连接酶为Taq DNA Ligase 连接酶或9°N DNA 连接酶。
4. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，所述的高保真的耐热DNA聚合酶与高温 DNA 连接酶的添加比例为：酶活力单位比1：60。
5. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，所述的突变引物是以甲基化环状DNA为模板设计的单条引物，在突变位点前后各保留16~20个与模板配对的碱基。
6. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤b）中，使用限制性内切酶Dpn I消化的时间为5分钟至过夜。
7. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤c）中，所述的消化产物是直接转入感受态细胞中。
8. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，PCR反应的体系中还包含反应缓冲液、GC反应缓冲液、dNTP、ATP、NAD+。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN109763172A (zh) * | 2017-11-09 | 2019-05-17 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种突变体核酸文库构建方法及得到的突变体核酸文库 |
| CN110305861A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-10-08 | 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 | 构建多点突变核酸序列的方法 |
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2014
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