CN109763172A - 一种突变体核酸文库构建方法及得到的突变体核酸文库 - Google Patents

Abstract

一种突变体核酸文库构建方法及得到的突变体核酸文库，所述方法包括：将切刻内切酶的切刻位点序列插入环状双链核酸中，形成带有切刻位点的环状双链核酸；使用第一切刻内切酶和核酸外切酶切刻、消化带有切刻位点的环状双链核酸的第一条链；在聚合酶的作用下，以第二条链为模板，在含有突变位点的引物的存在下进行引物延伸反应，然后在连接酶的作用下将合成的突变体链两端连接；使用第二切刻内切酶和核酸外切酶切刻、消化上一步产物中的第二条链，得到单链环状突变体链；和以单链环状突变体链为模板进行滚环扩增，得到突变体核酸文库。本发明的方法具有无偏性、高通量、高效性和简单易行的优势。

Description

一种突变体核酸文库构建方法及得到的突变体核酸文库

技术领域

本发明涉及文库构建技术领域，具体涉及一种突变体核酸文库构建方法及得到的突变体核酸文库。

背景技术

定点突变技术是有目的性的在已知DNA序列中取代、插入或删除一定的核苷酸片段，可以有目或针对性地改变DNA序列中的碱基次序，可以用来表明基因的调控机理，也可以用来研究蛋白质结构和功能的关系，是基因研究中的一种常用手段。定点突变技术通过寡核苷盒式诱变、寡核苷酸引物介导、重叠延伸介导和PCR介导等途径来实现。盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，替代原基因中相应序列，该方法简单易行，但是成本高。引物介导是利用含有突变碱基的引物，在聚合酶的作用下启动对DNA分子的复制，该方法虽然被广泛应用，但是存在突变效率低的问题。重叠延伸和PCR介导的突变法为定点突变技术进行基因修饰、改造提供了另一条更方便的途径，但是该方法后续工作比较复杂，而且易发生其它突变。总之，现有技术中的定点突变存在突变率低、操作复杂、费时、成本高的缺陷需要解决。

切刻内切酶是一种限制性核酸内切酶，它能特异性识别双链DNA中的一段核苷酸序列，只水解双链DNA的中的一条链，对DNA链进行切刻而不是切割，其活性表现为将超螺旋核酸(例如质粒)改变为切口核酸(例如切口质粒)的能力。切刻内切酶有很多种，一般常用的是Nb.Btsl、Nt.Btsl、Nb.BbVCI、Nt.BbVCI等，通常它们是切刻DNA的一对酶，例如Nb.BbVCI、Nt.BbVCI分别切刻双链DNA中的两条链。基于切刻内切酶有很多应用，例如，基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及应用；基于切刻内切酶的核酸信号放大技术用于蛋白及DNA修饰酶的荧光检测。

DNA滚环扩增技术(RCA)是一种利用特定DNA聚合酶，例如phi29DNA聚合酶，在恒温条件下，根据已有的环状DNA模板产生单链DNA分子的DNA扩增技术。反应在常温进行不需要热循环加热器，例如，PCR仪。它还有一个很大的优点是，当以DNA闭合环为模板扩增时，RCA的产物可以直接用来转化大肠杆菌或酵母菌，在转化子内重新环化目的DNA片段。

发明内容

本发明提供一种突变体核酸文库构建方法及得到的突变体核酸文库，具有无偏性、高通量、高效性和简单易行的优势。

根据第一方面，一种实施例中提供一种突变体核酸文库构建方法，该方法包括：

(1)将切刻内切酶的切刻位点序列插入环状双链核酸中，形成带有切刻位点的环状双链核酸；

(2)使用第一切刻内切酶和核酸外切酶切刻、消化上述带有切刻位点的环状双链核酸的第一条链；

(3)在聚合酶的作用下，以第二条链为模板，在含有突变位点的引物的存在下进行引物延伸反应，然后在连接酶的作用下将合成的突变体链两端连接；

(4)使用第二切刻内切酶和核酸外切酶切刻、消化步骤(3)产物中的第二条链，得到单链环状突变体链；和

(5)以上述单链环状突变体链为模板进行滚环扩增，得到突变体核酸文库。

进一步地，上述环状双链核酸是带有表达元件的质粒，优选质粒PET28a-kod。

进一步地，上述切刻内切酶的切刻位点序列插入上述质粒的表达框之外，优选终止密码子之后。

进一步地，上述核酸外切酶是核酸外切酶III和核酸外切酶I。

进一步地，上述聚合酶是T4DNA聚合酶；上述连接酶是T4DNA连接酶。

进一步地，上述步骤(4)还包括：消化掉甲基化和半甲基化的核酸；优选地，使用Dpn1限制性核酸酶消化掉甲基化和半甲基化的核酸。

进一步地，上述滚环扩增利用Phi29DNA聚合酶的滚环扩增作用进行。

进一步地，上述第一切刻内切酶和第二切刻内切酶分别是切刻内切酶Nb.BbVCI和切刻内切酶Nt.BbVCI。

进一步地，上述含有突变位点的引物包括多条引物，上述多条引物彼此之间具有不同的突变位点。

根据第二方面，一种实施例中提供一种根据第一方面的方法构建的突变体核酸文库。

与现有基因突变技术相比，本发明的突变体核酸文库构建方法，通过在核酸序列中插入切刻内切酶的切刻位点，通过切刻内切酶对核酸链进行切刻，水解核酸链中指定单链以得到单链环状核酸；然后通过单链环状核酸与突变引物退火、扩增、连接、消化而获得突变体环状单链核酸；再进行RCA扩增，以增加文库量。

本发明方法的优越性体现在：(1)DNA文库无偏性，即可以恒温扩增进行突变体链的合成，文库建立无偏；(2)高效性，即该方法可以在一天内操作完成，快速建立DNA随机突变体文库，节约时间；(3)突变通量高，即可以一次性随机引入多个突变位点，从而提高突变通量；(4)简单易行，即文库构建无需热循环，只需加热板恒温反应。此外，由于文库量增加，在一些应用中能够提高对蛋白质表达宿主的转化率。

附图说明

图1示出了本发明实施例中PET28a-kod质粒图谱；

图2示出了本发明实施例中第一条质粒模板链消化后的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为原始质粒模板，泳道2为Nb.BbVCI单独作用，泳道3为EXOIII、EXO I和Nb.BbVCI同时作用；

图3示出了本发明实施例中酶标仪检测的突变体的FRET-Cy5信号曲线；

图4示出了本发明实施例中酶标仪检测的突变体的Cy3信号曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序、重要性或技术等含义。

在本发明的一种实施例中，突变体核酸文库构建方法包括：

(1)将切刻内切酶的切刻位点序列插入环状双链核酸中，形成带有切刻位点的环状双链核酸；

(2)使用第一切刻内切酶和核酸外切酶切刻、消化上述带有切刻位点的环状双链核酸的第一条链；

(3)在聚合酶的作用下，以第二条链为模板，在含有突变位点的引物的存在下进行引物延伸反应，然后在连接酶的作用下将合成的突变体链两端连接；

(4)使用第二切刻内切酶和核酸外切酶切刻、消化步骤(3)产物中的第二条链，得到单链环状突变体链。

在一优选例中，上述的核酸文库构建方法还包括步骤(5)：以步骤(4)所得的单链环状突变体链为模板进行滚环扩增，得到突变体核酸文库。

需要理解，本发明对所称的“环状双链核酸”没有特别限定，可以是任何环状形式的核酸双链，该环状双链核酸可以是DNA或RNA，或者DNA和RNA的杂合体，只要能够成功地引入切刻内切酶的切刻位点序列即可。在一些例子中，环状双链核酸可以是带有表达元件的质粒，例如，在本发明的一些实施例中，环状双链核酸是质粒PET28a-kod，其能够表达KOD聚合酶，通过本发明的方法可以在该质粒的任意位点引入突变，以研究这些突变对KOD聚合酶的表达和/或活性的影响。类似地，对于任何能够表达特定蛋白的质粒，本发明的方法都可以在感兴趣的位点引入突变，研究蛋白的表达和/或活性的变化情况。在一些例子中，环状双链核酸可以不带有表达元件的环状双链核酸，这样的环状双链核酸有各种不同的用途，例如，在一些用途中可以是形成DNA纳米球(DNB)以进行上机测序。

在本发明中将切刻内切酶的切刻位点序列插入环状双链核酸中的步骤中，尤其是在环状双链核酸带有表达元件的情况下，需要避免插入的切刻位点序列对目标蛋白表达的影响，因此，最好是使切刻内切酶的切刻位点序列插入环状双链核酸(例如质粒)的表达框之外，例如，在本发明的一些实施例中，切刻内切酶的切刻位点序列插入终止密码子之后。

在步骤(2)中，第一切刻内切酶使环状双链核酸的一条链，即第一条链发生切刻，所称的“第一条链”没有特变限制，可以是正义链，也可以是反义链。第一条链和第二条链仅是相对而言。经过切刻的环状双链核酸，在核酸外切酶的作用下，被切刻的第一条链被消化掉，核酸外切酶比较常用的是核酸外切酶III和核酸外切酶I。

在步骤(3)中，聚合酶可以没有限制，但是比较常用的是T4DNA聚合酶。连接酶也可以没有限制，但是比较常用的是T4DNA连接酶。在步骤(3)中，为了连接反应的顺利进行，需要在引物的末端(5’端)具有磷酸基团。当然，在其他情况下，可以通过专门的磷酸化步骤将该末端转化成磷酸化末端。在步骤(3)中，含有突变位点的引物可以是多条引物，这多条引物彼此之间具有不同的突变位点，这样就能够通过一次聚合和连接反应得到多种不同的突变体，这些不同的突变体具有不同的突变位点，用于研究不同突变位点对蛋白表达和/或活性的影响。

在步骤(4)中，使用第二切刻内切酶和核酸外切酶切刻、消化步骤(3)产物中的第二条链。这里的第二条链是相对于上述第一条链而言。第二切刻内切酶与上述第一切刻内切酶是一对酶，它们分别能够切刻双链中的一条链。例如，在本发明的一些实施例中，第一切刻内切酶和第二切刻内切酶分别是Nb.BbVCI和Nt.BbVCI。该步骤中的核酸外切酶比较常用的也是核酸外切酶III和核酸外切酶I。在一些情况下，还可能存在甲基化和/或半甲基化的核酸，这些核酸不能完全被消化掉，因此，还可以通过专门的步骤来消化掉甲基化和半甲基化的核酸，例如，在本发明的一些实施例中，使用Dpn1限制性核酸酶消化掉甲基化和半甲基化的核酸。

在步骤(5)中，以单链环状突变体链为模板进行滚环扩增，比较常用的是利用Phi29DNA聚合酶的滚环扩增作用进行，这是一种恒温扩增，尤其是可以在常温下进行，因此能够实现无偏性(即无热循环)的文库构建，简单易行。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得的常规产品。

实施例：KOD DNA聚合酶无偏质粒文库构建

1、切刻内切酶BbVCI的切刻位点插入

(1)合成插入带有BbVCI酶的切刻位点(5’GCTGAGG3’)引物，序列如下：

5’GAGATCCGGCTGCTAACAAAGGCTGAGGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGC3’(SEQ ID NO：1)；

5’GCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCCTCAGCCTTTGTTAGCAGCCGGATCTC3’(SEQ ID NO：2)。

切刻内切酶BbVCI的插入位点在PET28a-kod载体(质粒图谱如图1所示)(Novagen货号：69864)的C端His标签后面，引物与His标签后面一段45bp的序列互补配对，具体的实验条件和操作步骤参照文献(QuikChange II Site-Directed MutagenesisKit.Instruction Manual,Agilent Technologies,Inc.2015)。

(2)利用定点突变技术将BbVCI酶的切刻位点(七个碱基)插入模板质粒PET28a-kod，其具体位置应在基因序列的终止密码子后面，切刻内切酶切刻位点为插入的七个碱基并非DNA片段，对基因的表达没有影响。

2、第一条质粒模板链的消化反应

在模板链的消化中，用到切刻内切酶Nb.BbVCI(NEB)，核酸外切酶III(EXO III)(NEB)和核酸外切酶I(EXO I)(NEB)，具体实验按照如下表1的反应体系和用量，利用加热板，在37℃反应1h，80℃反应20min灭活，得到单链环状模板，反应产物无需纯化。

表1模板链消化反应体系和用量

组分	终浓度
		核酸外切酶III	10U
核酸外切酶I	20U
		Nb.BbVCI	10U
10Xcutsmater缓冲液	2μL
		dsDNA	1μg
ddH<sub>2</sub>O	补足至20μL

图2示出了第一条质粒模板链的消化后的质粒琼脂糖凝胶电泳(130V，40min)的结果，原始质粒模板作为对照，第一道胶孔中为原始质粒模板，第二道胶孔为Nb.BbVCI单独作用，可以看到原始质粒模板超螺旋打开，被成功切刻，第三道胶孔为EXOIII、EXO I和Nb.BbVCI同时作用，模板质粒一条链被消化掉。

3、突变体链的合成反应

(1)合成5’端磷酸化的突变引物(加粗位点为突变后的位点，突变前的位点为GC)，序列如下：

5’CGTGACCTGAAAGACTATAAGTTCACCGGTCCGCATG 3’(SEQ ID NO：3)。

(2)利用T4DNA聚合酶的聚合活性，合成突变体链，利用T4DNA连接酶的连接功能，修复合成的突变体DNA链中缺口。在反应体系中先加入单链的DNA模板和磷酸化突变引物，混合均匀后将反应体系在95℃保持3min，然后再53℃保持45s，让引物和模板充分结合；待反应体系冷却到室温，加入dNTP混合物，反应缓冲液，DTT，ATP和双蒸水，最后加入T4DNA聚合酶和T4DNA连接酶，充分混匀，在37℃保持7min来合成突变体链，然后将反应体系至于室温25℃保持10min以将突变链连接成环，最后反应体系在80℃保持20min来进行灭活。实验的具体的反应体系如下表2所示。

表2突变链合成体系

组分	终浓度
		ssDNA	20μL
磷酸化突变引物	0.2μM
		dNTP混合物	0.1mM
10Xcutsmater缓冲液	3μL
		DTT	5mM
ATP	1mM
		T4DNA连接酶	3U
T4DNA聚合酶	300U
		ddH<sub>2</sub>O	补足至50μL

待反应结束后，利用PCR纯化试剂盒将反应产物纯化，加入15μL双蒸水进行洗脱。

(3)第二条单链模板消化反应

在第二条模板链的消化中，用到切刻内切酶Nt.BbVCI，核酸外切酶III(EXO III)和核酸外切酶I(EXO I)，具体实验按照如下表3的反应体系和用量，利用加热板，在37℃反应1h，80℃反应20min灭活，消化掉第二条原始模板链，反应产物无需纯化。

表3第二条模板链消化反应体系和用量

组分	终浓度
		核酸外切酶III	10U
核酸外切酶I	20U
		Nb.BbVCI	10U
10Xcutsmater缓冲液	2μL
		dsDNA	1μg
ddH<sub>2</sub>O	补足至20μL

在上述反应体系中加入40U Dpn1酶来消化掉甲基化和半甲基化的DNA，在37℃反应1h，80℃保持20min，灭活。利用纯化试剂盒MinElute Reaction Cleanup Kit(Qiagen,cat no.28204)对反应产物进行纯化。

(4)突变体链的扩增

突变体链的滚环扩参照文献，Ryota Fujii1,2,Motomitsu Kitaoka1&KiyoshiHayashi1.Error-prone rolling circle amplification:the simplest randommutagenesis protocol.NATURE PROTOCOLS.VOL.1NO.5(2006)。实验中所用的samplebuffer，reaction buffer，Enzyme mix(phi29DNA polymerase and random hexamers)来源于TempliPhi DNA amplification kit(GE Healthcare,cat.no.25-6400-10)。具体的实验方法和步骤如下：

取1μL(约1ng)上述纯化后的产物和9μL sample buffer于95℃保持3min,使目的DNA和sample buffer中的Random hexamer primers进行充分结合，冷却至室温。再加入9μLreaction buffer和0.5μL Enzyme mix在30℃反应1.5h，65℃反应10min，灭活。具体的扩增体系如下表4。

表4 RCA扩增体系

组分	终浓度
		DNA	1μL
sample buffer	1X
		reaction buffer	1X
Enzyme mix	0.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足至30μL

待反应结束后，利用纯化试剂盒MinElute Reaction Cleanup Kit(Qiagen,catno.28204)对反应产物进行纯化。

至此，完成KOD DNA聚合酶无偏质粒文库构建。

4、大肠杆菌转化实验

(1)从80℃冰箱中取出商业感受态细胞DH5α(每支为100μL)置于冰上，放置约5min-10min让它解冻。

(2)分别加入RCA扩增后的产物10μL，负对照组加入10μL无菌水；用枪头轻轻吹打混匀后，冰上放置40-50min。

(3)在42℃水浴中热击90s，后迅速置于冰上冷却3-5min。

(4)加入500μL于室温下预热LB体培养基(不含抗性)，混匀后37℃，200rpm/min，复苏细胞60h。

(5)取适量上述培养后菌液进行涂板，对于实验组菌落，可先于室温，4000rpm/min，离心3min，用枪头吸取500μL上清弃之，再利用剩余培养液重悬菌体，涂板于含Kan(50μg/ml)的LB平板上。对于对照组菌落，可取100μL涂板于含Kan(50μg/ml)的LB平板上。

(6)涂布均匀，待菌液完全被培养基吸收后用封口膜封口，倒置培养皿，37℃培养16-18h。

(7)取出过夜培养的平板，观察菌落的生长情况。正常情况下，实验组可生长几十个单菌落，对照组应无菌落生长。

5、菌落PCR测序实验

(1)合成菌落PCR的引物，及突变位点测序的引物，序列如下：

菌落PCR正向引物:5’GGTTTTTTTATGGGGGGAGTTTAGG 3’(SEQ ID NO：4)；

菌落PCR反向引物:5’CATCTCATCTGTAACATCATTGGCA 3’(SEQ ID NO：5)；

测序引物:5’CCAGGCATCAAATAAAACG 3’(SEQ ID NO：6)。

(2)菌落PCR按照常规实验要求进行即可，具体实验条件参照表5，在实验组平板上随机挑选3个菌落进行菌落PCR。

表5菌落PCR反应条件和体系

组分	用量
		10xPfu缓冲液(具有MgSO<sub>4</sub>)	2.5μL
10mM dNTPs	0.5μL
		10μM正向引物(F)	0.7μL
10μM反向引物(R)	0.7μL
		模板DNA	XμL(75ng)
无菌水	补至终体积为25μL
		Pfu DNA聚合酶	0.5μL

准备上述实验组及对照组反应体系，并用枪头轻轻吹打混匀后，按表6的反应条件进行PCR反应(扩增速度1min/Kb)。

表6菌落PCR反应条件

(3)实验结果：

根据测序结果表明，所挑选的3个转化子均为阳性，表明本发明的方法可用于DNA无偏建库。使用Plasmid Mini Kit将阳性转化子提取质粒备用。

6、KOD聚合酶突变体粗酶活筛选实验

6.1突变体诱导表达

(1)将上述实验中所得突变体质粒进行大肠杆菌BL21转化实验，实验方法同上。

(2)挑取单菌落，于96孔板中，每孔装液量200μL LB(Kan+,50ug/ml)，37℃220rpm，6h；

(3)取2μL(按1:100稀释)上述培养液转接于200μL LB(Kan+,50ug/ml)新孔中，37℃，220rpm，培养2-2.5h至OD600在0.6-0.8的范围内；

(4)加入IPTG终浓度为0.5mM，进行诱导表达，25℃，220rpm，过夜培养；

(5)加入2μL 100mM PMSF，10mg/ml溶菌酶20μL；

(6)37℃反应10min，取混合液进行实验。

6.2酶标仪粗酶酶活测定

混合反应液配制

按表7的实验条件配制反应体系(若用纯酶测试需将纯酶用反应1X缓冲液稀释10倍且加入0.1％BSA蛋白保护，稀释完可在50μL体系中加入10μL稀释后的酶)。

表7反应体系成分

取384孔反应板，做好标记，于冰上预冷，将配制好的各反应体系准确加入标记好预冷的384孔板中。

6.3酶活性检测

利用酶标仪检测Cy3和Cy5荧光信号，反应条件如下：

(1)反应温度40℃，2h，间隔2min收集荧光信号，粗酶液为包含培养基的菌液；

(2)同时检测Cy3(激发光530nm/发射光568nm)和FRET Cy5(激发光530nm/发射光676nm)信号。

突变体粗酶活性测试结果如下图3和图4所示，所筛选出的FRET Cy5(激发光530nm/发射光676nm)信号值上升，Cy3(激发光530nm/发射光568nm)的信号值下降，实验有效。在本次实验中F为阴性对照，D为阳性对照，A，B，C和E为所筛选的突变体，可以看出本次实验中的突变体都是有活性的。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 一种突变体核酸文库构建方法及得到的突变体核酸文库

<130> 17I25193

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagatccggc tgctaacaaa ggctgaggcc cgaaaggaag ctgagttggc 50

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccaactcag cttcctttcg ggcctcagcc tttgttagca gccggatctc 50

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtgacctga aagactataa gttcaccggt ccgcatg 37

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggttttttta tggggggagt ttagg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catctcatct gtaacatcat tggca 25

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaggcatca aataaaacg 19

Claims (10)

1.一种突变体核酸文库构建方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）将切刻内切酶的切刻位点序列插入环状双链核酸中，形成带有切刻位点的环状双链核酸；

（2）使用第一切刻内切酶和核酸外切酶切刻、消化所述带有切刻位点的环状双链核酸的第一条链；

（3）在聚合酶的作用下，以第二条链为模板，在含有突变位点的引物的存在下进行引物延伸反应，然后在连接酶的作用下将合成的突变体链两端连接；

（4）使用第二切刻内切酶和核酸外切酶切刻、消化步骤（3）产物中的所述第二条链，得到单链环状突变体链；

优先地，所述的突变体核酸文库构建方法还包括步骤（5）：以步骤（4）所得的单链环状突变体链为模板进行滚环扩增，得到所述突变体核酸文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环状双链核酸是带有表达元件的质粒，优选质粒PET28a-kod。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述切刻内切酶的切刻位点序列插入所述质粒的表达框之外，优选终止密码子之后。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸外切酶是核酸外切酶III和核酸外切酶I。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是T4 DNA聚合酶；所述连接酶是T4 DNA连接酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）还包括：消化掉甲基化和半甲基化的核酸；

优选地，使用Dpn1限制性核酸酶消化掉甲基化和半甲基化的核酸。

7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滚环扩增利用Phi29 DNA聚合酶的滚环扩增作用进行。

8. 根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述第一切刻内切酶和第二切刻内切酶分别是切刻内切酶Nb. BbVCI和切刻内切酶Nt. BbVCI。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述含有突变位点的引物包括多条引物，所述多条引物彼此之间具有不同的突变位点。

10.一种根据权利要求1-9任一项所述的方法构建的突变体核酸文库。