CN102695795A - 诱变方法 - Google Patents
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Classifications
-
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- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
Abstract
本发明提供了一种诱变方法，其中在引物延伸反应中用至少一种诱变引物诱变核酸分子，并随后通过滚环扩增（RCA）进行扩增。所述方法包括下述步骤：通过链置换DNA聚合酶，仅导致突变链的选择性扩增。在多次引发的RCA中产生突变的质粒的多个拷贝，并转化得到的DNA进行使用。所述方法适用于突变单链和双链DNA。本发明也提供了用于诱变方法中的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及诱变方法和用于所述方法中的试剂盒。
背景技术
大的随机化的基因文库对于现代蛋白工程而言是无价工具。已经为定点诱变开发了几种方法，它们的共同目标是，用尽可能容易且快速的方案获得大的、高质量的突变体文库。影响随机化的基因文库质量的主要因素是：基因多样性的非故意偏倚、翻译区的DNA序列中的移码频率和在终产物中存在的野生型模板分子的量。在定点诱变技术中，通过重新基因装配，或通过使用野生型基因模板，将合成的适当地随机化的寡核苷酸掺入靶基因中。在主要用于研究实验室的后一选项中，通过在适度温度的引物延伸或基于PCR的方法（使用野生型基因作为模板），掺入诱变寡物。
国际专利公开WO 2008/067035公开了一种称作无限制诱变和克隆（URMAC）的技术，其用于诱变大的线性的或环状的核酸。所述技术包含一系列2个PCR和3个连接步骤，并具有额外的任选的富集PCR反应。
早期的引物延伸方法之一使用含有尿嘧啶的单链DNA（ss(U)DNA）模板。不需要表型选择，因为新生合成的突变体链不含有尿嘧啶，并因而在细菌繁殖中受到偏好，产生报道的50% 诱变效率。随后已经如下改进该方法（称作Kunkel诱变），以适用于ds(U)DNA模板：通过碱性变性的模板DNA的额外硝酸纤维素过滤步骤，使用另一种寡物来破坏独特的限制性酶位点（用于模板序列去除），和通过用DpnI消化剩余的未突变的甲基化的ds(U)DNA模板。但是，ds(U)DNA模板策略会危害制备具有更小文库尺寸的模板的容易性，因为使用dsDNA的引物延伸比ssDNA的效率更低。Kunkel诱变甚至已经成功地用于将几种诱变寡物同时掺入ss(U)DNA模板中。该策略要求，将模板DNA序列修饰成在诱变位点处含有终止密码子，以防止野生型蛋白的翻译，因为在终产物中的高比例的野生型模板是该方法的一个主要缺点。
本领域需要有效的、低背景诱变方法，尤其是用于建立大的随机化的基因文库，其中不需要模板修饰，且其导致可转化的DNA的充足供应，避开下述众所周知的问题：即DNA向宿主细胞的转化是基因文库生产线中的最大瓶颈。
发明内容
本发明的一个目的是，提供用于诱变核酸分子的新颖的装置和方法。具体地，本发明的一个目的是，提供用于以低模板背景有效地诱变单链和双链DNA并增加突变的DNA的产率的装置和方法。
本发明提供了一种诱变核酸分子的方法。所述方法包括下述步骤：a）提供模板，所述模板包含在环状DNA载体中的靶核酸分子，b）提供至少一种诱变引物，其含有要导入靶核酸分子中的突变，c）使所述诱变引物与靶核酸分子退火，d）进行引物延伸和连接反应，以形成双链的异源双链体，其中一条链是模板链，另一条链是新合成的突变链，e）使模板链不适于滚环扩增（rolling circle
amplification，RCA），f）通过多次引发的滚环扩增来扩增突变链，和g）将扩增的且重新环化的DNA转化至合适的宿主中。
在有些实施方案中，所述方法包括在步骤f）和g）之间的额外步骤，其中所述扩增的DNA被（i）消化、（ii）消化和连接或（iii）使用重组减小成质粒大小的单位。
在有些实施方案中，步骤a）的模板含有尿嘧啶，且在步骤e）中，通过尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）处理，使所述模板链不适于RCA（the template
strand is rendered unfavourable for the RCA）。在其它实施方案中，所述模板可以从ung-/dut-
大肠杆菌株得到。
在其它实施方案中，步骤a）的模板是甲基化的且尿苷酸化的（uridylated）dsDNA，在步骤e）中通过DpnI限制性酶和UDG处理使其不适于RCA。在其它实施方案中，所述模板可以从dam+/ung-/dut-
大肠杆菌株得到。
在其它实施方案中，步骤a）的模板含有甲基，且在步骤e）中，通过限制性酶处理使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够消化甲基化的DNA，但是不能消化未甲基化的DNA。在这样的实施方案中，所述限制性酶是DpnI，和/或所述模板可以从dam+ 大肠杆菌株得到。
在其它实施方案中，在有甲基化剂存在下进行步骤c）的引物延伸反应，且通过限制性酶处理使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够使未甲基化的链产生切口，并使甲基化的链保持完整，诸如MspI和HaeIII。在这样的实施方案中，所述模板可以从dam- 大肠杆菌株得到。
在其它实施方案中，在步骤e）中，通过用仅在模板链中具有识别位点的产生切口的（nicking）内切核酸酶处理，使所述模板链不适于RCA。这样的实施方案可以另外包括：在内切核酸酶处理以后，用外切核酸酶处理。
本发明也提供了用于根据本发明的方法和所有它的实施方案中的试剂盒。所述试剂盒包括：a）在适当的缓冲液中的第一种酶混合物，其包含用于引物延伸和连接的试剂，包括没有显著的链置换活性的DNA聚合酶、dNTP、DNA连接酶、ATP和DTT；b）选择性的模板灭活酶；和c）在适当的缓冲液中的第二种酶混合物，其包含用于RCA的试剂，包括链置换DNA聚合酶诸如phi29 DNA聚合酶、随机引物和dNTP。
在有些实施方案中，所述试剂盒包括UDG作为所述选择性的模板灭活酶，并另外包括ung-/dut- 大肠杆菌株。在其它实施方案中，所述试剂盒包括DpnI作为所述选择性的模板灭活酶。在其它实施方案中，所述选择性的模板灭活酶是能够使未甲基化的链产生切口，并使甲基化的链保持完整的限制性酶，诸如MspI或HaeIII，所述试剂盒另外包括dam-甲基化缺陷型菌株，诸如dam- 大肠杆菌株。在其它实施方案中，所述选择性的模板灭活酶是能够使甲基化的链产生切口、同时使未甲基化的链保持完整的限制性酶，所述试剂盒另外包括能够dam-甲基化的菌株，诸如dam+ 大肠杆菌株。在其它实施方案中，所述选择性的模板灭活酶是产生切口的内切核酸酶。
任选地，所述试剂盒可以另外包括至少一种选自下述的组分：用于DNA的重新环化的T4
DNA连接酶、用于连接的DNA的DNA纯化柱和用于转化的感受态细胞。
在随后的权利要求书中，阐述了本发明的方法和试剂盒的其它具体实施方案。
从下述的附图、详细描述和实施例中，会明白本发明的其它目的、实施方案、方面、细节和优点。
附图说明
在下面，将参考附图借助于优选的实施方案更详细地描述本发明，在附图中：
图1是本发明的诱变方法的示意图，其中用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）处理在传统的Kunkel诱变反应中产生的DNA异源双链体，通过滚环扩增进行扩增，随后消化并自连接，以形成突变的DNA的多个拷贝。
图2解释了UDG处理对ss(U)DNA诱变反应的影响，所述诱变反应使用由外切抗性的六聚体引发的选择性滚环扩增。饼形图解释了功能上突变的克隆（黑色）相对于非功能上突变的和未突变的克隆（白色）的比例。
图3解释了在用HindIII和SacII消化噬粒（phagemid）DNA样品的不同处理以后诱变的成功。成功的突变会破坏SacII限制位点，产生线性的5.4 kb DNA片段，而未突变的DNA被消化成2个4.5 kb和0.9 kb DNA片段。（A）异源双链体-UDG，（B）异源双链体+ UDG，（C）异源双链体-UDG +RCA，（D）异源双链体+UDG + RCA，使用外切抗性的随机引物，（E）异源双链体+UDG +RCA，使用正常随机引物。（L）1kb Fermentas DNA梯带。
图4显示了通过使用重组、消化/连接或无处理，从10 ng RCA扩增的DNA样品得到的转化体的数目。
图5是抗体亲和力成熟文库的构建示意图。在该情况下，要掺入的DNA是重链可变结构域（VH）基因的PCR产物。使该大引物（megaprimer）与预先制成的尿苷酸化的轻链（VL）随机化的ssDNA文库杂交，用DNA聚合酶延伸，并与共价地闭合的环状异源双链体DNA连接。然后，用UDG处理DNA，并用RCA选择性地扩增掺入的新生链。
图6的图解释了在丝状噬菌体上展示的、并通过微囊藻素-LR（McLR）的2轮淘选而富集的抗体文库。使用铕螯合物标记的抗-噬菌体IgG作为标记，通过噬菌体免疫测定来分析McLR结合噬菌体的富集。结果表明，与原始的UDG处理过的Kunkel文库相比，McLR结合克隆的富集在RCA和RCAMUT文库中更有效。
图7显示了抗-McLR scFv的展示噬菌体文库的解离速率（off-rate）分析。在游离抗原洗脱以后剩余的噬菌体的更高比例（输入的%）指示该群体的更高中间亲和力（median affinity）。首先将富集的第2轮噬菌体储备物捕获在固相结合的McLR上。洗掉未结合的噬菌体，并用1µM
McLR洗脱结合的噬菌体90 min。用铕螯合物标记的抗-噬菌体抗体，检测剩余的噬菌体颗粒。RCA和RCAMUT噬菌体储备物的更慢的解离速率指示，在RCA和RCAMUT文库中存在比在原始的UDG处理过的Kunkel文库中更高的亲和力抗体。
图8是产生切口的内切核酸酶介导的在RCA中的选择性的示意图。在括号中显示了实施例6的细节。
图9显示了Kunkel反应的琼脂糖凝胶分析。泳道L）代表1kb Fermentas梯带：泳道A）代表模板ssDNA；泳道B）代表具有引物的Kunkel反应；泳道C）代表没有引物的Kunkel反应。
图10显示了文库DNA HindIII和NheI消化的琼脂糖凝胶分析。HindIII存在于所有克隆中，但是NheI仅存在于模板克隆中。如果2个位点都存在，会释放出用箭头指示的片段。泳道L）代表1 kb
Fermentas梯带；泳道A）代表Kunkel样品；泳道B）代表选择性的RCA样品；和泳道C）代表模板（所有分子都被NheI切割）。
图11解释了使用多次引发的RCA来制备头孢他啶抗性的TEM-1ß-内酰胺酶变体。
图12解释了93个头孢他啶抗性的克隆的抗性特征。MIC类0.6µg/ml包括3个阴性模板对照，它们不是头孢他啶抗性的。
具体实施方式
本发明是基于开发有效的诱变方法的研究，所述诱变方法具有低模板背景和增加的突变DNA产率。
在一个方面，本发明提供了一种方法，其中在引物延伸反应中用诱变引物诱变核酸分子，并随后通过滚环扩增（RCA）进行扩增，所述RCA在有些情况下也称作多次引发的置换扩增（multiply-primed
displacement amplification，MDA）或多次引发的滚环扩增（Multiply-primed
rolling circle amplification，MPRCA），其有利于扩增新合成的诱变的核酸分子。提供了关于如何实现选择性扩增的几个替代方案。
所述方法可以用于定点诱变，其中将靶向的突变导入模板多核苷酸的一个或多个希望的位置。这可以通过经典的引物延伸诱变来实现，其中使用与模板多核苷酸相比含有一个或多个希望的突变的诱变引物。所述诱变引物可以是合成的寡核苷酸或PCR产物，且它可以包括一个或多个希望的置换、删除、添加或它们的任意希望的组合。在本领域中可容易地得到用于生产这样的引物的装置和方法。用作引物的寡核苷酸或PCR产物必须是5´-磷酸化的以便连接。这可以如下实现：通过酶促磷酸化反应，通过DNA的5´末端的酶消化，或通过在化学反应中的缀合。
或者，所述方法可以用于随机诱变。在这样的情况下，可以在它的合成过程中将突变导入诱变引物中，例如借助于易出错的PCR。随机地诱变的寡核苷酸也可以用作诱变引物。用于获得这样的随机诱变引物的装置和方法是本领域已知的。
与寡核苷酸作为诱变引物相比，PCR产物具有一些优点。含有许多突变的长DNA片段可以在一个反应中掺入模板基因中。例如，可以通过PCR随机地突变目标基因片段，并通过本发明的方法与模板基因连接。也可以通过PCR扩增含有在几个位置处的几个定点突变的基因文库，并与靶多核苷酸相组合。如果使用单链DNA作为模板，为了增强PCR产物掺入，可以生产与模板DNA互补的不对称的PCR产物。作为PCR产物的一个替代方案，从另一个基因文库切下的dsDNA可以用作诱变引物，并通过本发明的方法与靶DNA相连，条件是，在模板和消化的片段的退火（annealing）5´-和3´-末端核苷酸中存在足够的互补性。
提供随机地诱变的核酸的另一个替代方案是，使用易出错的RCA。这可以如下实现：通过在有MnCl2存在下进行RCA，降低DNA聚合酶的保真度，或减少输入DNA的量。
在本文中，术语“靶基因”或“靶多核苷酸”表示，要通过本发明的方法突变的一个或多个基因或其片段。所述靶基因可以编码任意希望的一种或多种蛋白，包括、但不限于、抗体或抗体的结合片段，诸如Fab、F(ab’)2或Fab’片段。在有些实施方案中，要突变的区域是抗体的可变区，优选高变区。具体地，要突变的区域可以是抗体的一个或多个互补性决定区（即CDR）。除了编码区以外，通过方法可以突变非编码区，例如但不限于基因调节的DNA区域和适体。
在诱变之前，通过本领域已知的标准方法，将靶基因克隆至DNA载体中。在本文中，这样的克隆的靶基因称作“模板基因”。同样地，术语“模板DNA”表示含有靶基因的载体，诸如质粒或噬粒。在本文中，术语“模板”和“亲本模板”可以可互换地使用。
本文使用的术语“异源双链体”表示双链的核酸分子，其中一条链（模板链）是未突变的，另一条在体外合成的链含有希望的突变（突变的异源双链体链）。
当使用本发明的方法来突变单链DNA（ssDNA）时，将靶基因克隆至噬粒中。在本文中，术语“噬粒”表示基于质粒的克隆载体，其携带噬菌体基因组的一部分。在与辅助噬菌体一起共感染宿主以后，所述噬粒作为ssDNA被包装进噬菌体（例如M13）颗粒中。当使用本发明来突变双链的DNA（dsDNA）时，可以将靶基因克隆至含有至少一个独特限制性酶切割位点的任意希望的质粒中。在本文中术语“质粒”表示可独立地复制的染色体外的DNA。通常，质粒是双链的和环状的。
在有些实施方案中，使用本领域技术人员已知的产生切口的内切核酸酶，可以从dsDNA生产ssDNA模板。
当使用dsDNA作为模板时，必须在诱变之前打开双链结构。这可以通过本领域已知的标准方法来实现，包括但不限于碱性或热变性。
存在使亲本模板链不适于滚环扩增的不同方法。一种替代方法是，使用含有尿嘧啶的模板DNA。这可以如下实现：例如，通过在有尿苷存在下，在ung-/dut- 大肠杆菌株（诸如BW313和CJ236，它们是酶dUTP焦磷酸酶缺陷型（dut-））中复制模板DNA，导致增加的尿嘧啶掺入来替代DNA中的胸腺嘧啶。掺入的尿嘧啶不会从这些菌株的DNA中去除，这是由于尿嘧啶-DNA糖基化酶的灭活点突变（ung-）。当使用噬粒作为克隆载体时，可以随后从丝状噬菌体诸如M13（即在ung-/dut-
大肠杆菌细胞株中生产的颗粒）中提取模板DNA作为ss(U)DNA。当使用双链质粒作为克隆载体时，使用本领域已知的任意合适的方法，可以提取模板DNA作为ds(U)DNA。
具有基因型dut-的大肠杆菌株具有酶脱氧尿苷三磷酸酶（dUTPase）缺陷，这会导致增加的dUTP细胞内蓄积。具有基因型ung- 的大肠杆菌株具有尿嘧啶糖基化酶活性缺陷，这会消除去除掺入的尿嘧啶的能力。因而，具有ung-/dut- 基因型的大肠杆菌株被定义为具有两种酶活性缺陷的菌株，这会导致增加的尿嘧啶向DNA中的稳定掺入。具有基因型dam- 的大肠杆菌株具有Dam甲基酶活性缺陷，这会在具有5´-GATC-3´序列的位点处产生未甲基化的DNA。相应地，dam+ 大肠杆菌株具有Dam甲基化活性，这会导致在5´-GATC-3´序列中的腺嘌呤的甲基化。因此，菌株dam+/ung-/dut-
被定义为在5´-GATC-3´序列处甲基化DNA且在DNA中具有尿嘧啶的菌株。
例如与dNTP和dUTP一起使用T7 DNA聚合酶，也可以酶促地制备ss(U)DNA或ds(U)DNA形式的尿苷酸化的模板DNA。
当使用ds(U)DNA作为模板时，必须在诱变之前打开双链结构。这可以通过本领域已知的标准方法来实现，包括但不限于碱性或热变性。
在本发明的方法的该实施方案中，使用诱变引物来引发尿苷酸化的模板DNA的互补链合成。诱变引物与尿苷酸化的模板DNA的退火要求诱变引物在它的5’和3’末端与模板分子具有足够的互补性。通常，相对于靶DNA，在引物的5’末端存在约15至约30个互补核苷酸，在引物的3’末端存在约15至约30个互补核苷酸。但是，也可以使用更短的互补区段，特别当靶向一个或几个连续核苷酸来诱变时。在有DNA聚合酶（诸如T7或T4聚合酶）存在下的引物延伸和使用DNA连接酶（诸如T4连接酶）的连接会产生连接的异源双链体，即共价地闭合的环状DNA（cccDNA），其中一条链（模板链）含有尿嘧啶且是未突变的，另一条在体外合成的链含有希望的突变，但不含有尿嘧啶。
在经典的Kunkel诱变中，然后将得到的异源双链体转化至ung+/dut+
大肠杆菌株，该菌株不支持尿嘧啶的存在。因为含有尿嘧啶的DNA在这样的宿主中被生物学上灭活，当在大肠杆菌细胞中繁殖异源双链体DNA时，突变的未尿苷酸化的链会具有胜过尿苷酸化的模板的强选择性优点。但是，结合本发明，经证实，80%的认为突变的克隆仍然含有未突变的模板DNA。相比而言，仅0-5%的通过本发明的方法突变的克隆含有未突变的模板DNA（实施例1，表1）。
在本发明的方法的该实施方案中，替代直接转化，用尿嘧啶-N-糖基化酶（UDG）处理连接的异源双链体，以水解异源双链体中的尿嘧啶。这会使含有尿嘧啶的异源双链体链不能被DNA聚合酶拷贝。UDG会建立无碱基位点，据报道这些位点会造成DNA聚合酶的停顿。UDG的同系物是本领域可得到的，且可以同样地用于本发明的方法中。
使亲本尿苷酸化的dsDNA模板不适于滚环扩增的另一种方法是，除了UDG以外，使用甲基化的DNA消化酶（诸如DpnI）来增强背景去除。通过该方法适用于下述情况：从dam+/ung-/dut- 大肠杆菌株中提取dsDNA模板，或者用Dam甲基酶甲基化尿苷酸化的DNA，所述Dam甲基酶会将甲基从S-腺苷基甲硫氨酸转移至序列5´-GATC-3´的腺嘌呤。
可以如关于尿苷酸化的模板更详细地描述地，通过引物延伸反应和随后的连接，进行一个或多个突变向靶基因中的导入。接着，通过限制性酶诸如DpnI消化来去除亲本模板DNA，所述限制性酶诸如DpnI会消化甲基化的DNA，但是不消化在体外新合成的未甲基化的DNA。DpnI是可商业得到的，且本领域技术人员会容易地明白合适的消化条件。在有些实施方案中，DpnI消化可以与UDG联合使用，以进一步提高效率。
使亲本模板DNA不适于滚环扩增的还另一种方法是使用从dam+ 大肠杆菌株提取的DNA作为模板。这样的模板被甲基化，且可以提取为ssDNA或dsDNA，这取决于使用的克隆载体。在引物延伸和连接以后，通过限制性酶消化，去除亲本模板DNA，所述限制性酶会消化甲基化的DNA，但是不消化在体外新合成的未甲基化的DNA，诸如DpnI。
使亲本模板DNA不适于滚环扩增的还另一种方法是使用从dam- 大肠杆菌株分离出的模板DNA，所述菌株是本领域可得到的，诸如JM110、SCS110、ER2925或GM2929菌株。另外，模板DNA可以提取为ssDNA或dsDNA，这取决于通过本领域已知的合适方法使用的克隆载体。
在该替代方案中，在有甲基化剂（诸如5-甲基-dCTP）存在下进行引物延伸反应，以便将甲基加入新合成的诱变的DNA中。随后，用限制性酶（诸如MspI或HaeIII）去除未甲基化的亲本模板DNA，所述限制性酶能够消化未甲基化的链，并使甲基化的链保持完整。为了增强该效应，可以使用外切核酸酶（包括5’-外切核酸酶诸如λ外切核酸酶、T7外切核酸酶和3’-外切核酸酶诸如外切核酸酶III），从用MspI或HaeIII产生的切口去除亲本链。合适的限制性酶和外切核酸酶是可商业得到的，本领域技术人员会容易地理解合适的消化条件。
通过产生切口的内切核酸酶（其仅切割一条链）特异性的适当序列，也可以使亲本模板DNA不适于滚环扩增。对于该方案，使用这样的产生切口的内切核酸酶：其具有使得模板链被切口的朝向的识别位点。被切口的模板链比突变链不适于滚环扩增。通过3’-外切核酸酶（诸如外切核酸酶III）处理，可以进一步抑制被切口的模板链的扩增。存在几种可商业得到的、适用于该方案的产生切口的内切核酸酶。这样的酶的实例包括，但不限于：Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI和Nt.CviPII。
在本发明的方法的下一步中，在滚环扩增反应中使用高度持续的链置换聚合酶选择性地扩增突变的异源双链体链。合适的DNA聚合酶包括、但不限于：phi29 DNA聚合酶、Bst
DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶。Phi29
DNA聚合酶是一种优选的聚合酶。可以使用多次引发的滚环扩增（MPRCA）来提高扩增效率。这通过在扩增反应中使用多种随机DNA引物、外切抗性的随机DNA引物或随机RNA引物来实现。优选地，所述引物是六聚体或七聚体。也可以使用多种特异性的引物。由于UDG处理和多次引发，DNA聚合酶会扩增完整的突变链，从而选择性地生成载体的多个拷贝。然后用限制性酶（其具有仅1个切割位点/载体）消化如此形成的多联体，并用T4
DNA连接酶自连接，以重新环化产物。合适的限制性酶取决于使用的载体，且包括，但不限于：AatII、AdeI、ApaI、BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、KpnI、NdeI、NotI、PaeI、PstI、SacI、XbaI和XhoI。然后将所述载体转化至合适的宿主，诸如大肠杆菌或酵母。
在有些实施方案中，可以使用重组诸如Cre-Lox技术替代DNA多联体的消化和连接。为此，将LoxP1序列插入要通过RCA扩增的载体中。cre重组酶的添加会启动线性的DNA多联体的环化和向单体单元的减小。LoxP会使重新环化比消化和连接更快和更容易，但是模板载体中对loxP序列的需要会限制该方法的通用适用性。
通常，phi29 DNA聚合酶是具有低突变率的高保真度酶。但是，通过使用与要扩增的DNA的量相比过度高浓度的随机DNA引物（诸如随机六聚体），可以增加MPRCA中的突变率。因而，本发明的方法的该实施方案会提供用于随机诱变的其它工具。
通过本发明的方法得到的转化体中的野生型（即未突变的）模板DNA的背景水平非常低。如在实施例中所证实的，可以实现甚至90%或100%遗传诱变效率。其它优选的遗传诱变效率包括95%、96%、97%、98%和99%。
通过本发明的方法，可能实现与传统的Kunkel方法相比显著的功能性诱变效率提高。在ss(U)DNA的情况下，实现了接近78%的最大理论效率的功能性诱变效率。与Kunkel方法的对应效率相比，通过本发明的方法实现了ds(U)的功能性诱变效率的超过10倍提高。
此外，通过本发明的方法可得到的突变的克隆的产率非常高。例如，通过含有2.2±1.3 x 105突变的克隆（通过遗传分析测得）的经典Kunkel反应，10 ng模板DNA产生3.6±1.3 x 105 cfu。通过本发明的方法，相同量的模板DNA产生8.1±1.7 x 107 cfu，其中的所有克隆都被突变（基于遗传分析），这比用经典的Kunkel反应得到的突变的克隆多超过300倍（参见表1）。
本发明的方法可以用于建立分子（诸如抗体）的文库。在这样的实施方案中，可以同时使用多种诱变引物来诱变靶核酸。替换地或额外地，可以在单个诱变反应中同时诱变多种靶核酸分子。因而，建立的文库可以含有广泛的多样性。
通过本发明的方法可得到的基因文库可以大于通过传统的基于PCR的方法所建立的那些。此外，可以以比已知方法可以实现的效率更高的诱变效率建立大基因文库。在本发明的方法中，在诱变的基因模板中不需要常用的特殊选择特征（终止密码子、限制位点等），用于减少诱变产物中的模板污染。本发明的诱变方法不包括双分子克隆步骤（插入片段+ 载体），其中用适合的限制性酶切割插入DNA和克隆载体，随后进行连接。由于该原因，本发明的诱变方法能够将（随机）突变直接导入DNA区段中，其位置和长度可以自由地选择。例如，可以将随机诱变靶向进入多结构域酶内的特定结构域中。
本发明的方法的其它优点包括：它节省时间，且不是劳动密集的，因为不需要任何双分子克隆步骤。此外，本发明的方法不需要大量模板DNA，而后者通常是用于建立大抗体文库的诱变方法的情况。
本发明另外提供了用于根据本发明的方法中的试剂盒。所述试剂盒包括第一种和第二种酶混合物和灭活模板的选择性酶。所述第一种混合物包括用于引物延伸和连接的试剂，包括在适当的反应/贮存缓冲液中的没有显著的链置换活性的DNA聚合酶（例如T7或T4 DNA聚合酶）、dNTP、DNA连接酶（例如T4连接酶）、ATP和DTT。所述第二种混合物包括用于RCA的试剂，包括在适当的反应/贮存缓冲液中的链置换DNA聚合酶（例如phi29 DNA聚合酶）、随机引物和dNTP。任选地，所述试剂盒可以另外包括：用于重新环化片段DNA的额外的DNA连接酶（例如T4连接酶）、用于连接的DNA的DNA纯化柱和/或用于转化的感受态细胞。
在其中模板DNA被尿苷酸化的实施方案中，提供UDG作为选择性的模板灭活酶，所述试剂盒另外包括ung-/dut- 大肠杆菌株。
在其中使用甲基化的模板的实施方案中，所述试剂盒包括相同的组分，例外是，替代UDG，所述选择性的模板灭活酶是DpnI或能够消化甲基化的DNA、但是不能消化未甲基化的DNA的另一种酶。另外，不需要提供菌株，因为甲基化的DNA可以在大多数常用的大肠杆菌株中生产。
在其中使用甲基化的模板的实施方案中，所述试剂盒包括相同的组分，例外是，所述选择性的模板灭活酶是能够切割异源双链体的未甲基化的链的限制性酶，诸如MspI或HaeIII，并在所述试剂盒中提供dam-甲基化缺陷型菌株，诸如JM110、SCS110、ER2925或GM2929。
在其中使用产生切口的内切核酸酶的实施方案中，所述试剂盒包括相同的组分，例外是，所述选择性的模板灭活酶是产生切口的内切核酸酶。另外，不需要提供菌株，因为用常用的大肠杆菌株生产的任意DNA适合作为模板。
本领域技术人员显而易见，随着技术的进步，本发明的概念可以以不同的方式来执行。本发明和它的实施方案不限于上述的实施例，但是可以在权利要求书的范围内变化。
实施例1. 单链Fv抗体基因中的CDR-H3环区域的诱变
诱变靶标是单链Fv抗体基因的CDR-H3环区域，所述基因与称作pAKBLA3-scFv的噬粒载体上的TEM-1ß-内酰胺酶基因融合。
对模板DNA进行不同的处理，以便评估本发明的诱变方法的效力。
引物延伸诱变
模板序列在诱变位点处含有3个终止密码子。将诱变寡核苷酸设计成恢复开放读码框。在该实验中使用的寡核苷酸混合物EB120含有在5’末端处的28个杂交碱基对（bp）、在3’末端处的25个杂交碱基对和在它们之间的7个随机NNN密码子（5’-CTAGTGTACCCTGACCCCAGTCCATAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACGAGCACAGTAGTAGACAGCCGTG-3’; SEQ ID NO:1）。理论上，78%的突变的克隆会具有开放读码框，并从而产生氨苄西林抗性的克隆。
诱变寡物（oligo）EB120购自（TAG Copenhagen,
Copenhagen, Denmark）。在含有5µM寡物EB120、1mM ATP、5mM DTT、70 mM Tris-HCl（pH
7.6）、10mM MgCl2和20 U T4多核苷酸激酶（New England
Biolabs）的20µl反应物中，在37 ℃磷酸化寡物1 h。使用标准方法，例外是，CJ236生长培养基补充了6µg/ml尿苷，从大肠杆菌CJ236菌株制备pAKBLA3-scFv噬粒的噬菌体储备物。根据生产商的说明书，用Qiaspin
M13试剂盒（Qiagen）提取ss(U)DNA。在1x T4 DNA连接酶缓冲液（New England
Biolabs）中，使5 pmol磷酸化的引物与1µg单链的pAKBLA3-scFv噬粒退火。使用下述程序，在PCR仪中进行退火：90 ℃2 min、70 ℃2 min、50 ℃5 min、20 ℃5 min、4 ℃5 min，最后在冰上放置10 min。
在保持在冰上的同时，将下述组分加入15µl退火反应物中：1µl
25 mM MgCl2、2.5µl 10 mM ATP、2µl 100 mM DTT、1µl
25 mM dNTP、3.5 U T7 DNA聚合酶（New England Biolabs）和3
Weiss单位的T4 DNA连接酶（New
England Biolabs）。将反应物在室温温育3 h。
将得到的异源双链体直接转化进大肠杆菌XL-1 Blue宿主（表示为–UDG的样品），或进行UDG处理（表示为+UDG的样品）。
通过UDG处理去除尿嘧啶
在含有20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1mM EDTA、1mM DTT和10 U UDG（New England Biolabs）的1x
UDG反应缓冲液（New England Biolabs）中，在25µl反应物中，用UDG在37 ℃处理1µg Kunkel异源双链体1 h。在与UDG处理的样品相同的条件下，例外是，用H2O替代UDG，温育没有UDG处理的对照样品。用Qiagen PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化反应物，并洗脱进50µl 10 mM Tris-HCl（pH 8.5）中。用Nanodrop（Nanodrop Technologies, Wilmington，美国）测定DNA浓度。
滚环扩增
在含有10 mM dNTP（Finnzymes）、50µM外切抗性的或正常随机六聚体（Fermentas）、1x phi29 DNA聚合酶缓冲液（Fermentas）（其含有50 mM Tris-HCl（pH
7.5）、10 mM MgCl2、10 mM (NH4)SO4、4 mM DTT; 0.05 U酵母焦磷酸酶（Fermentas）和10 U Phi29 DNA聚合酶）的20µl反应物中，扩增UDG处理过的（表示为+UDG +RCA的样品）和未处理的（表示为-UDG +RCA的样品）反应物的10 ng
DNA样品。将反应物在30 ℃温育过夜，并在70 ℃灭活10 min。
DNA多联体的消化和重新环化
在补充了1x反应缓冲液（Fermentas）（其含有10 mM Tris-HCl（pH
8.5）、10 mM MgCl2、100 mM KCl和0.1
mg/ml BSA）的50µl反应物中，用20 U
HindIII（Fermentas）在37 ℃消化扩增的DNA样品2 h。用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化反应物，并洗脱进50µl
10 mM Tris-HCl（pH 8.5）中。用Nanodrop（Thermo Scientific）测定DNA浓度。
在200µl反应体积的含有1x T4 DNA连接酶缓冲液（Fermentas）（其含有40 mM Tris-HCl（pH 7.8）、10 mM MgCl2、10 mM DTT和0.5 mM ATP）中，重新环化1µg纯化的HindIII消化的DNA样品。给反应物补充25 U
T4 DNA连接酶（Fermentas），并在16 ℃温育过夜。用Qiagen PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化连接物，在50µl Tris-HCl（pH
8.5）中洗脱，并用Nanodrop（Thermo
Scientific）测定DNA浓度。
转化和铺板
用GenePulser（BioRad），将10 ng DNA样品（-UDG、+UDG -RCA、+UDG +RCA）电穿孔进XL1 Blue电感受态细胞（Stratagene）中，并在1ml SOC（LB: 10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl /l、pH 7.0，含有10 mM MgCl2和0.4% W/V葡萄糖）中恢复1 h。制备稀释液，并将100µl涂布在含有25µg/ml氯霉素和100µM IPTG（异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷）的LA（Luria-Bertani肉汤琼脂）平板上和除了氯霉素和IPTG以外还含有100µg/ml氨苄西林的其它LA平板上。在37 ℃温育平板过夜，并计数菌落。在DNA文库池分析的情况下，在恢复时间以后，将4 ml
SB（超级肉汤（Super broth）：30 g胰蛋白胨, 20 g酵母提取物, 10 g MOPS /l pH 7.0）加到1 ml
SOC上，并补充25µg/ml氯霉素。在37 ℃300 rpm培养培养物过夜，并根据生产商的说明书，用Qiagen小量制备试剂盒（Qiagen）提取DNA。
功能分析
基于功能性诱变试验，通过直接转化经典的Kunkel异源双链体（-UDG）所得到的诱变效率（氨苄西林抗性的克隆与氯霉素/氨苄西林抗性的克隆之比）是51.3±7.6%（表1）。在UDG处理以后，诱变效率轻微提高（+UDG -RCA），在选择性的RCA（+UDG +RCA）以后，实现了65.1±4.7%和73.6±11.2%的功能性诱变效率，这取决于在扩增反应中是否使用外切抗性的或未修饰的随机六聚体。令人感兴趣地，如果在UDG处理之前用RCA扩增异源双链体，并转化，得到的诱变效率降低至0.1±0.01%。因而，突变的序列的选择性依赖于UDG处理（图2）。
表1. 选择性的RCA对使用ss(U)DNA模板的引物延伸诱变的影响
a最大理论功能性诱变效率是78%
b通过对20个氯霉素抗性的克隆的PCR产物进行限制性作图测得
c基于20个氯霉素/氨苄西林抗性的克隆的菌落PCR。
除了增加群体中的突变的克隆的量以外，从转化得到的转化体的总数也有增加（图2）。转化10 ng异源双链体直接地产生3.6±1.3 x 105 cfu，但是通过选择性RCA来扩增10 ng样品，并转化所有扩增的和连接的DNA，得到8.1±1.7 x 107
cfu的诱变文库。
遗传分析
用菌落PCR筛选转化体，以验证诱变效率。掺入的突变会破坏位于模板CDR
H3环区域中的SacII限制性酶位点，因而，如果诱变已经成功，扩增的940
bp PCR产物会耐受SacII切割。在从氯霉素平板挑选用于分析的经典的Kunkel异源双链体转化体中，存在8/20个切割的扩增子、8/20个切割抗性的扩增子和4/20个部分消化的扩增子。将所述4个样品分类为部分消化的，因为在相同的条件下，SacII会完全消化野生型模板对照扩增子。部分消化指示，突变的和未突变的噬粒已经在那些克隆中繁殖。
相比而言，源自用未修饰的随机六聚体引发的、UDG处理过的并选择性地扩增的文库的20/20个分析的转化体可耐受SacII消化，这指示100% 诱变效率。PCR产物的大小是均匀的，这指示，选择性的RCA没有造成DNA重排。另外，使用选择性地扩增的转化体，没有观察到双模板问题。在外切抗性的六聚体的情况下，2/20克隆是未突变的，18/20是突变的。
由于发现双模板存在于在氯霉素平板上的经典的Kunkel诱变反应的4/20个转化体中，我们决定测试也来自氯霉素/氨苄西林-平板的菌落中模板DNA的存在。在该筛选中，没有重叠的氯霉素和氨苄西林抗性的菌落误导结论的可能性。作为消化扩增子的替代，使用引物对，其中正向引物仅与未突变的模板DNA杂交，且反向引物是在突变区以外。以此方式，也可以检测更小量的模板DNA。在未扩增的异源双链体的情况下，16/20个克隆产生PCR产物，这指示，未突变的模板DNA仍然存在于80%的认为突变的克隆中。在选择性地扩增的转化体中，观察到1/20
PCR产物（如果在扩增中使用外切抗性的引物）和0/20 PCR产物（如果应用正常的六聚体引物）。
通过消化小量制备DNA（提取自过夜培养的、用样品文库转化的细胞），证实了单克隆筛选结果（图3）。HindIII位点是在靶基因以外，因此存在于所有噬粒中，而在野生型基因中存在的SacII位点在成功的诱变过程中会被破坏。未突变的噬粒被切割成4506 bp和868
bp大小的片段，且突变的噬粒是线性的5374 bp片段。不幸的是，不太强烈地染色的868 bp片段在图中几乎难以看出，但是更大的4.5
kb和5.4 kb片段明显可见。如图3所示，在有和没有UDG处理（A、B）下，在用Kunkel异源双链体转化的样品中存在突变的和未突变的噬粒。在没有UDG处理下扩增的噬粒池不具有可见量的突变的噬粒（C），而在UDG处理的并扩增的样品中，仅突变的噬粒是可见的。
实施例2. scFv抗体基因中的CDR-H1环区域的诱变
使用ss(U)DNA作为模板，通过诱变scFv抗体基因的CDR H1环，进一步测试本发明的诱变方法。
引物EB104具有在5´末端中的23个杂交碱基、在3´末端中的19个杂交碱基和被TAC密码子隔开的在中央的2个随机化的密码子位置X12和X13（5'-CA GCC TCC
GGA TTT ACG TTC TCC X12 TAC X13 ATG CAC TGG GTC CGT CAG G-3'; SEQ ID NO:2）。通过将DNA三核苷酸插入寡物中，合成引物，以实现定制的密码子多样性。
结果与上述的更详细的实施例1类似，通过20个噬粒克隆的限制酶切消化分析选择性扩增，诱变效率从15%提高至100%。
制备源自Kunkel异源双链体转化的8个突变的克隆和源自选择性地扩增的DNA转化的10个突变的克隆的小量制备品，并测序（表2）。6/8个转化的Kunkel异源双链体克隆被正确地突变，其中2个克隆具有相同的序列。同样地，7/10个选择性的RCA样品克隆被正确地突变，其中2个克隆具有相同的序列。两种样品中的2个克隆含有在随机化的位置中的三核苷酸删除，这可能是由于不完全引物合成，且选择性的RCA子集的一个克隆产生不可读出的序列。作为结论，基于该组序列，原始的样品和选择性地扩增的样品产生相同的序列变异性分布。
表2. CDR H1诱变研究的正确突变的克隆的序列细节
在密码子位置X12中的设计的多样性：16.7%的TCT、AAC、GAC、CGT、ACT和GGT。在密码子位置X13中的设计的多样性：20%的TAC、GGT、GCT、TGG和TCT。
实施例3. 通过Cre-Lox技术重新环化DNA多联体
如果在诱变之前将34 bp loxP重组位点或其修饰添加至质粒/噬粒DNA中，通过cre重组酶可以重新环化突变的RCA扩增的DNA。Cre-loxP技术会简化重新环化方案，因为所述重组步骤会产生与DNA消化、DNA纯化和连接相同的结果。图4显示了使用重组、消化/连接或无处理，从10 ng RCA扩增的DNA样品得到的转化体的数目。
使用3种平行的10µl RCA反应物，每种反应物含有10 ng质粒pIXpAK100r_LoxP1r、1x Phi29 DNA pol缓冲液（MBI
Fermentas, Vilna, 立陶宛）、0.5 mM dNTP（Finnzymes, Espoo, 芬兰）、50µM外切抗性的随机六聚体（MBI Fermentas, Vilna, 立陶宛）和5 U
Phi 29 DNA聚合酶（MBI Fermentas, Vilna, 立陶宛），测试了cre重组酶的环化通过RCA生成的多联体产物的效力。将反应物在30 ℃温育过夜，并在70 ℃热灭活10 min。
在50µl反应体积中，用10 U HindIII（MBI Fermentas, Vilna, 立陶宛）在37 ℃消化反应物之一2 h。根据生产商的说明书，用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化该反应物，并在50µl含有0.1 U/µl T4 DNA连接酶（MBI Fermentas, Vilna, 立陶宛）的反应物中进行连接。将反应物在16 ℃温育过夜，并在70 ℃热灭活10 min。
将另外10µl多联体（concatemer）样品加入含有1x cre重组缓冲液（New England
Biolabs、Ipswitch、MA）和0.02 U/µl cre重组酶（New
England Biolabs、Ipswitch、MA）的50µl重组反应物中。将反应物在37 ℃温育2 h，并在70 ℃热灭活10 min。
第三份10µl多联体样品没有经过处理。根据生产商的说明书，用Pellet
Paint共沉淀剂（Novagen）对50µl反应物进行乙醇沉淀，并重新悬浮于10µl Tris-HCl（pH 8.5）中。用DpnI处理反应物，以消化未扩增的模板DNA。将含有2 U DpnI（MBI Fermentas, Vilna, 立陶宛）的10µl反应物在37 ℃温育2 h，并在80 ℃热灭活20 min。将1µl样品电穿孔进感受态的SS320大肠杆菌细胞中。在37 ℃恢复1 h以后，稀释100µl样品，并铺板在LA（25µg/ml氯霉素、10µg/ml四环素、0.5% 葡萄糖）上。在37 ℃温育平板过夜，并计数菌落。结果显示在图4中。所述重组是比消化和连接更简单的方案，但是它仍然从10 ng样品产生相同量的菌落（1x 108 cfu），这是没有处理的68倍。
实施例4. ds(U)DNA模板的诱变
用源自pAKBLA3-scFv噬粒的ds(U)DNA模板，证实了本发明的方法对双链模板的效率。
首先用200 mM NaOH使ds(U)DNA碱性变性，然后与ssDNA样品一样进行引物延伸反应。使用EB120引物或包括scFv基因的pAKBLA3-scFvNONSTOP的PCR产物进行引物延伸，并随后如在实施例1所述进行UDG处理和RCA。UDG处理和选择性的RCA的效果列在表3中。在寡物和PCR产物引发的反应中，在Kunkel异源双链体样品和在UDG处理以后选择性地扩增的样品之间观察到突变的克隆的频率的10倍差异。尽管最终的诱变频率（分别是10.3±3.0%和9.2±2.1%）是相对适度的，诱变效率显著提高。
表3. 选择性的RCA对使用dsDNA的引物延伸诱变的影响
a最大理论功能性诱变效率是78%。
实施例5. 使用PCR产物的VH结构域诱变和大抗体文库的构建
通过将14个抗-McLR
IgG重链可变结构域（VH-结构域）基因掺入由5x 108个轻链变体组成的模板DNA池中，构建用于微囊藻素-LR（McLR）结合抗体的亲和力成熟的抗体文库。将本发明的方法与Kunkel氏诱变相对比。除了常规的RCA以外，还在有1.5 mM MnCl2存在下进行扩增，以产生随机突变。亲和力成熟文库构建方案显示在图5中。
材料和方法
首先在含有250µM dNTP、50 ng模板DNA、0.2µM引物EB106和EB105和2.5 U Pfu DNA聚合酶（Fermentas,
Vilna, 立陶宛）的50µl反应物中，在1x
Pfu缓冲液（含有MgSO4）中，通过PCR从源质粒扩增14个VH基因，它们用作Kunkel氏反应中的大引物（megaprimer）。在95 ℃初步变性2 min以后，最后加入聚合酶。使用下述步骤，使PCR反应循环25次：在95 ℃变性20 s，在61 ℃退火20s，并在72 ℃延伸15 s。最后的延伸是在72 ℃3 min。用PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hamburg, 德国）纯化产物，并使用合并的PCR产物作为模板，建立不对称的PCR。将相同的条件应用于不对称的PCR反应，例外是，仅包括EB106引物，并使循环增加至30个。用PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hamburg,
德国）纯化反应物。通过琼脂糖凝胶分析，验证VH基因的正确大小和不对称的PCR反应。
在100µl T4 PNK缓冲液A中磷酸化1251 ng VH-大引物，所述T4
PNK缓冲液A中含有20 U
T4 PNK（Fermentas, Vilna, 立陶宛）以及1 mM ATP和10 mM DTT。将反应物在37 ℃温育30 min，并用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化亲和力。在有40 mM
Tris-HCl（pH 7.8）、10 mM
MgCl2、10 mM DTT和0.5 mM ATP存在下，在共35.5µl反应体积中，使磷酸化的大引物与5µg尿苷酸化的单链的轻链随机化的文库DNA退火。通过下述程序，在热循环仪中进行退火：1）在98 ℃2 min，2）在90 ℃2 min，3）在70 ℃2min，4）在50 ℃5min，5）在20 ℃5min，6）在4 ℃5min，随后在冰上放置10 min。
在200µl Kunkel氏诱变反应物中延伸和连接退火的VH-大引物，所述Kunkel氏诱变反应物含有8µl 25 mM MgCl2、20µl 10 mM ATP、20µl 100
mM DTT、20µl 10 mM dNTP、18 U T7 DNA聚合酶（NEB,
Ipswich，英国）和15 Weiss单位的T4
DNA连接酶（Fermentas, Vilna, 立陶宛）。混合所述组分，在冰上温育10 min，并转换至室温3 h。将Kunkel氏反应物在70 ℃热灭活20 min。
用10 U UDG（NEB, Ipswich，英国）在37 ℃处理诱变反应物1 h，并用PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hamburg,
德国）纯化至50µl 10 mM Tris-HCl（pH 8.5）中。用Qiagen试剂盒纯化10µl UDG处理过的Kunkel反应物，取出2µl（240 ng，即4x 1010分子）用于RCA，取出0.5µl（60 ng，即1x 1010）用于易出错的RCA（RCAMUT）。除了UDG处理过的DNA以外，RCA反应物含有在200µl phi29 DNA聚合酶反应缓冲液中的1 mM
dNTP、50µM随机引物（Fermentas,
Vilna, 立陶宛）、4 mM DTT、0.25
U无机焦磷酸酶（Fermentas, Vilna, 立陶宛）和100 U Phi29 DNA聚合酶（Fermentas,
Vilna, 立陶宛）。类似地，在有1.5 mM MnCl2存在下，进行易出错的RCA（RCAMUT）。将反应物在30 ℃温育过夜，并在70 ℃热灭活10 min。
在1 ml反应体积中，用200 U HindIII在37 ℃消化在RCA和RCAMUT中生成的DNA多联体过夜。以下述方式，用小量制备试剂盒柱（Qiagen, Hamburg, 德国）纯化反应物。将1 ml消化物与5 ml结合缓冲液混合，应用于10 ml TERUMO-注射器中，所述TERUMO-注射器牢固地固定在小量制备柱中。每个柱压入3 ml消化物，并且在装载以后，根据生产商的说明书继续纯化。总洗脱体积是100µl，在10 mM Tris-HCl（pH
8.5）中。以5 ng DNA /µl，用0.05 U/µl T4 DNA连接酶（Fermentas,
Vilna, 立陶宛）在16 ℃进行自连接过夜。如上所述进行连接物的浓缩和纯化，至50µl体积。将UDG处理过的和选择性地扩增的RCA文库的样品转化至XL-1细胞中。从单个菌落提取DNA，并对每个文库的10个样品测序（Sequencing
Service, Center of Biotechnology, Turku, 芬兰）。
用Bio-Rad Genepulser（Bio-Rad,
Hercules，美国）（具有设置200Ω、1.25
kV、25µF），将240
ng亲和力纯化的UDG处理过的DNA（6次转化，40 ng DNA和70µl细胞/ 比色皿）和6µg重新环化的RCA和RCAMUT DNA（25次转化，240 ng和70µl细胞/ 比色皿）转化至新鲜的SS320电感受态大肠杆菌细胞中。在24（UDG处理过的）和100 ml SOC（RCA和RCAMUT）中在37 ℃、100 rpm恢复1 h以后，稀释样品，并铺板在LA（25µg/ml氯霉素、10µg/ml四环素和0.5% 葡萄糖）上，用于计算转化效率。将剩余部分以20 ml细胞/板铺在24 cm x 24 cm Bioassay皿（Nunc, Roskilde, Denmark）上。在37 ℃温育小平板、在30 ℃温育大平板过夜。
在稀释平板的次日，计数菌落，并将15 ml SB应用于大平板，用L-涂布器刮它们至放置在冰上的falcon管中。测量文库细胞储备物的OD600
nm，并加入甘油至16% 终浓度，将细胞在-70 ℃保藏备用。
结果
将240 ng UDG处理过的Kunkel反应物直接转化进SS320细胞中，产生了3x 107个成员的文库。使用RCA对相同量的UDG处理过的Kunkel进行选择性扩增，产生12µg亲和力纯化的重新环化的DNA。通过转化12µg的一半，得到1x 1010 cfu，这是没有选择性RCA的超过300倍。MnCl2（用于在RCA中同时掺入随机突变）将亲和力纯化的DNA的总量减少至6µg。所有物质的转化产生8x 108
cfu。使用更低量的UDG处理过的Kunkel（60 ng）来进行RCAMUT实验，因为每个模板分子的拷贝数越高，突变频率越高。考虑到更低的输入量，通过在易出错的条件下扩增DNA，得到多100倍的菌落，尽管MnCl2对催化具有妨碍作用。
对UDG处理过的Kunkel和选择性RCA反应物的10个单个克隆的测序表明，不同的掺入的VH基因变体的分布或多或少地类似。在2个样品组中发现了6个不同的变体（表4）。仅9/10个UDG处理过的Kunkel克隆序列是可读出的，其中1/9个是未突变的模板克隆。相比而言，在RCA样品组中没有观察到模板克隆。鉴定的VH基因池部分地重叠，并覆盖8/14个掺入的VH基因。
通过噬菌体展示和生物淘选（biopanning），使用标准方案从文库中富集抗-McLR
scFv抗体。来自第二轮的富集的噬菌体储备物的噬菌体免疫测定表明，与原始的UDG处理过的Kunkel文库相比，在RCA和RCAMUT文库中的McLR结合克隆的富集更有效（图6）。RCA和RCAMUT衍生出的第2轮噬菌体储备物的更慢的解离速率也指示，与原始的UDG处理过的Kunkel文库相比，在RCA和RCAMUT文库中存在更高亲和力的抗体（图7）。
总之，该实施例证实：i）PCR产物可以在本发明的方法中用作诱变引物，ii）通过本发明的方法，可以从非常小量的起始DNA生成大抗体文库，和iii）本发明的方法可以与易出错的RCA成功地组合。
实施例6. 使用产生切口的内切核酸酶的选择性的RCA诱变
没有尿苷酸化的模板DNA，也可以实现在DNA异源双链体中的突变的DNA链的选择性扩增。在目前，存在至少13种可商业得到的产生切口的内切核酸酶，它们识别多种序列元件。产生切口的内切核酸酶仅切割在双链DNA分子上的一条DNA链。产生切口的内切核酸酶识别位点的存在，可以用于在模板链中产生切口。在由被切口的模板链和完整的新生合成链（其含有希望的突变）组成的底物上的滚环扩增，会导致完整突变链的优良扩增。终产物可以直接地转化进细胞中，或重新环化成单体单元以实现更高的转化效率。终产物几乎排它地由突变的DNA组成。
使用大肠杆菌的难以普通实验室菌株，可以制备模板DNA。如下将模板DNA转化成ssDNA形式：用丝状噬菌体直接地转化，或通过用合适的产生切口的内切核酸酶处理破坏dsDNA模板的其它链，随后进行外切核酸酶处理。成功实验的唯一要求是，在DNA序列中发现产生切口的内切核酸酶位点，产生切口的内切核酸酶对它的切割会在模板链中产生一个或几个链断裂。值得注意的是，根据可得到的产生切口的内切核酸酶，也存在切割相同的dsDNA识别序列的任一条链的选项（Nt.BbvCI相对于Nb.BbvCI）。
在该实验中，将高度可变的寡核苷酸（称作EB205）掺入ssDNA模板中，并通过切口的模板方法选择性地扩增突变的克隆。示意图如图8所示。所述模板实际上由具有在CDR-L1、-L3、-H1和-H2环中的预先制备的多样性的基因池组成，由EB205掺入实现的CDR-H3多样化对其进行补充。
材料和方法
如在实验1中所述，例外是，使用大肠杆菌株XL-1
Blue（Stratagene，美国）作为丝状噬菌体感染的宿主，且在培养基中没有补充尿嘧啶，制备ssDNA模板pHB32x-scFv[NheI]。如在实验1中关于1µg模板DNA所述，进行引物EB205（购自芬兰库奥皮奥大学（University of
Kuopio）药物化学系）的磷酸化、退火和延伸。也在没有引物下进行对照Kunkel反应。
在Kunkel氏反应以后，在50µl体积中用10 U Nb. BsmI（NEB,
Ipswich，英国）在65 ℃直接切割异源双链体1 h。将反应物在80 ℃热灭活20 min，并用PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hamburg,
德国）纯化。通过加入由生产商提供的200 U外切核酸酶III（Fermentas,
Vilna, 立陶宛）和反应缓冲液，用外切核酸酶III处理进一步破坏切口的链。在30 ℃温育反应物30
min，在70 ℃灭活20
min，并用PCR纯化试剂盒（Qiagen,
Hamburg, 德国）纯化。如在实施例1所述，进行选择性的RCA。通过将20µl反应物稀释至50µl（其补充了1 U Cre重组酶（NEB, Ipswich，英国）和生产商提供的反应缓冲液），将DNA多联体减小成质粒大小的单元。在37 ℃温育重组2 h，并用PCR纯化试剂盒（Qiagen, Hamburg, 德国）纯化。
将Kunkel和选择性RCA反应物的1µl样品转化进XL-1 Blue细胞（Stratagene，美国）中。恢复1 h以后，稀释转化体的样品，铺板在LA（25µg/ml氯霉素、10µg/ml四环素、0.5% 葡萄糖）上，并在37 ℃培养过夜。在5 ml液体培养SB（25µg/ml氯霉素、10µg/ml四环素、1% 葡萄糖）中培养剩余的细胞过夜，并制备小量制备DNA（小量制备试剂盒,
Qiagen, Hamburg, 德国）。
在20µl体积，在37 ℃用10 U HindIII和10 U
NheI双重消化400 ng文库小量制备DNA过夜，并在70 ℃热灭活20 min。将5µl样品上1% 琼脂糖凝胶进行分析。使用引物EB106和pAKrev以及下述循环程序，根据生产商的说明书，用Phire DNA聚合酶（Finnzymes,
Espoo, 芬兰）进行菌落PCR：（1）在98 ℃初步变性60 s，（2）在98 ℃变性5 s，（3）在66 ℃退火5 s，（4）在72 ℃延伸20s，最后在72 ℃延伸60 s。将步骤2 - 4重复30个循环。用1 U NheI在37 ℃消化1/20个PCR产物2 h，在80 ℃热灭活10 min，并上1% 琼脂糖凝胶进行分析。
结果
用基于切口模板的选择性RCA，进行scFv抗体文库的最后阶段，即CDR-H3随机化。首先，使随机化寡物通过它的5´和3´区域与在单链模板DNA上的互补VH-基因区域杂交。然后，酶促地延伸所述寡物，并与共价地闭合的环状DNA连接。在琼脂糖凝胶上分析Kunkel氏诱变的样品。在补充了EB205的Kunkel反应物中，单链模板带已经消失，且对应的dsDNA带出现。在没有所述引物的对照反应中，ssDNA保持没有改变（图9）。
用产生切口的内切核酸酶Nb. BsmI处理Kunkel反应物的一部分，并在多次引发的RCA反应中扩增。用cre重组酶将得到的DNA多联体减小成环状单体，用在模板中存在的loxP识别元件增强，并与Kunkel反应物平行地转化进细胞中。由转化的文库成员组成的DNA制品的消化证实，在Kunkel样品中，模板克隆也保留在最终的群体中，而在选择性的RCA样品中没有观察到模板材料（图10）。
为了更接近地量化该差异，通过菌落PCR来扩增跨scFv基因的CDR-H3位点的区域。成功的诱变会改变在模板序列中存在的独特的NheI位点。因此，使用扩增子的NheI消化来分析诱变频率。在17个Kunkel样品克隆（它们在菌落PCR中产生产物）中，4/17个可耐受NheI消化，等同于26% 诱变效率。在14个选择性的RCA样品中，所有（14/14）各自均可耐受NheI，等同于100%效率。因而，根据所述结果，选择性的RCA使切口的和UDG处理过的模板方法的效率提高至类似的程度。
实施例7. 在RCA中产生随机突变
用小量模板随机引发的RCA会以实用于蛋白工程目的的频率造成随机突变。根据用途，产生定点突变和随机突变二者有时是有用的。与皮克量的模板DNA的扩增相组合的选择性的RCA会组合这2个特征。为了验证结果，进行了一项实验，其中用多次引发的RCA扩增25 pg
pAK400ampRloxP质粒过夜。所述质粒含有TEM-1ß-内酰胺酶基因。该基因中的某些突变会转化对头孢他啶抗性的ß-内酰胺酶。因此，为了更详细地研究随机诱变，将扩增的DNA转化进大肠杆菌细胞中，并将所述克隆铺板在含有头孢他啶（仅突变体生长）和氨苄西林（都生长）的琼脂上。另外，测定所述克隆的最低抑制浓度（MIC），以证实不同突变的多样性。
将pAK400ampRloxP在95 ℃热变性3 min。在20µl反应体积中，在含有1.5 mM MnCl2、1 mM
dNTP、50µM随机六聚体或外切抗性的随机引物（Fermentas,
St. Leon-Rot, 德国）、0.05 U无机焦磷酸酶（Fermentas,
St. Leon-Rot, 德国）和10 U phi29 DNA聚合酶的1x phi29 DNA聚合酶缓冲液中，在30 ℃扩增25 pg质粒过夜。将RCA反应物在70 ℃热灭活10 min，并象以前一样重组和浓缩10µl反应物。将样品转化进XL-1 Blue细胞（Stratagene，美国）中，用于铺板在含有200µg/ml氨苄西林（amp）或1µg/ml头孢他啶（ctz）的LB琼脂上，在37 ℃温育过夜后计数菌落。
通过铺板，测定TEM-1变体的MIC值。挑选菌落，并在96-孔微孔滴定板上在200µl LB（1µg/ml头孢他啶和1% 葡萄糖）中在37 ℃培养过夜。用96针复制器，将培养物转移到一系列具有递增头孢他啶浓度的15 cm直径LA平板上：0.6µg/ml；1.2µg/ml；2.4µg/ml；4.8µg/ml；9.6µg/ml；19.2µg/ml；38.4µg/ml和38.4µg/ml。将所述平板在37 ℃温育过夜，并分析细菌生长。
结果
在使用随机引发的RCA的实验中，产生了头孢他啶抗性的ß-内酰胺酶变体。使用正常六聚体的随机引发产生了407个头孢他啶抗性的（ctzR）菌落/RCA，使用外切抗性的引物的引发，产生了550个。ctzR/ampR菌落之比（指示诱变频率）在前者中是0.13%
±0.09%，在后者中是0.40%
±0.04%。因而，外切抗性的引物在相同条件下会诱导更高的诱变频率。令人感兴趣地，使用正常引物（415
667 cfu/ RCA）时的总ampR集落数高于使用外切抗性的引物（145
000 cfu/ RCA）时。ctzR菌落在模板pAK400ampRloxP
ampR转化体中的天然频率是0.000042% ±0.000038%。因此得出结论，在所述条件下使用正常六聚体的多次引发的RCA会使随机突变频率比天然发生高3000倍，使用外切抗性的引物时会高9000倍（图11）。
通过MIC-铺板ctzR菌落，进一步验证了这些结果。93个样品（和3个携带模板pAK400ampRloxP的细胞对照）的可变的抗性特征证实，在实验中产生了不同的突变和它们的组合（图12）。通常，测序揭示每个TEM-1ß-内酰胺酶基因的1–3个突变。根据公开的文献，所述突变与抗性表型适当地关联，这证实了所述发现的相关性。也对样品组的LacI抑制基因区域进行了测序，以计算真实突变频率，因为该基因在该实验中没有在选择下。基于用正常的和外切抗性的引物扩增的10个测序的克隆，分别发现了每836 bp和669
bp DNA的1个突变。该突变频率与在温和条件下的易出错的PCR性能相对应（典型频率：1–16个突变/kb）。
序列表
<110> University of Turku
<120> 诱变方法
<130> 2091046PC
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 诱变寡物
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(49)
<223> n是a、c、g或t
<400> 1
ctagtgtacc ctgaccccag tccatagcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna cgagcacagt 60
agtagacagc cgtg
74
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 诱变寡物
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(26)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(32)
<223> n是a、c、g或t
<400> 2
cagcctccgg atttacgttc tccnnntacn nnatgcactg ggtccgtcag g 51
Claims (27)
1. 一种诱变核酸分子的方法，所述方法包括下述步骤：
a）提供模板，所述模板包含在环状DNA载体中的靶核酸分子，
b）提供至少一种诱变引物，其含有要导入靶核酸分子中的突变，
c）使所述诱变引物与靶核酸分子退火，
d）进行引物延伸和连接反应，以形成双链的异源双链体，其中一条链是模板链，另一条链是新合成的突变链，
e）使模板链不适于滚环扩增（RCA），
f）通过多次引发的滚环扩增来扩增所述突变链，和
g）将扩增的DNA转化至合适的宿主中。
2. 根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在步骤f）和g）之间的额外步骤，其中所述扩增的DNA通过下述方法转化成质粒大小的单位：（i）用限制性酶消化，（ii）用限制性酶消化和用DNA连接酶连接，或（iii）通过重组。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤a）的模板含有尿嘧啶，且在步骤e）中，通过尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）处理，使所述模板链不适于RCA。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述模板是从ung-/dut- 大肠杆菌株得到。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤a）的模板是甲基化的且尿苷酸化的dsDNA，在步骤e）中通过UDG和DpnI限制性酶处理使模板dsDNA不适于RCA。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述模板是从dam+/ung-/dut- 大肠杆菌株得到。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤a）的模板含有甲基，且在步骤e）中，通过限制性酶处理使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够消化甲基化的DNA，但是不能消化未甲基化的DNA。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述限制性酶是DpnI。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述模板是从dam+ 大肠杆菌株得到。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中在有甲基化剂存在下进行步骤d）的引物延伸反应，且在步骤e）中通过限制性酶处理使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够使未甲基化的链产生切口，并使甲基化的链保持完整。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述限制性酶选自MspI和HaeIII。
12. 根据权利要求10所述的方法，其中所述模板是从dam- 大肠杆菌株得到。
13. 根据权利要求10-12中任一项所述的方法，所述方法另外包括：在用限制性酶进行所述处理以后，用外切核酸酶处理。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤e）中，通过用仅在模板链中具有识别位点的产生切口的内切核酸酶处理，使所述模板链不适于RCA。
15. 根据权利要求14所述的方法，所述方法另外包括：在产生切口的内切核酸酶处理以后，用外切核酸酶处理。
16. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述诱变引物含有至少一个定点突变。
17. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述诱变引物含有至少一个随机突变。
18. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中用phi29 DNA聚合酶进行所述滚环扩增。
19. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中在产生随机突变的条件下进行所述滚环扩增。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述条件选自：减少模板量、给滚环扩增补充MnCl2和给滚环扩增补充三磷酸核苷酸类似物。
21. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中要诱变的核酸分子是双链DNA的形式，且所述方法包括：在步骤c）之前，打开所述双链结构。
22. 用于根据权利要求1所述的方法中的试剂盒，所述试剂盒包括：
a）在适当的缓冲液中的第一种酶混合物，其包含用于引物延伸和连接的试剂，包括没有显著的链置换活性的DNA聚合酶、dNTP、DNA连接酶、ATP和DTT；
b）选择性的模板灭活酶；和
c）在适当的缓冲液中的第二种酶混合物，其包含用于RCA的试剂，包括链置换DNA聚合酶诸如phi29 DNA聚合酶、随机引物和dNTP。
23. 根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述选择性的模板灭活酶是UDG，且所述试剂盒另外包括ung-/dut- 大肠杆菌株。
24. 根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述选择性的模板灭活酶是能够使未甲基化的链产生切口、同时使甲基化的链保持完整的限制性酶，所述试剂盒另外包括dam-甲基化缺陷型菌株。
25. 根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述选择性的模板灭活酶是能够使甲基化的链产生切口、同时使未甲基化的链保持完整的限制性酶，所述试剂盒另外包括能够dam-甲基化的菌株。
26. 根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述选择性的模板灭活酶是产生切口的内切核酸酶。
27. 根据权利要求22-26中任一项所述的试剂盒，其另外包括至少一种选自下述的组分：用于DNA的重新环化的T4 DNA连接酶、用于连接的DNA的DNA纯化柱和用于转化的感受态细胞。
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