CN112424379B

CN112424379B - 改进的多核苷酸序列检测方法

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Publication number: CN112424379B
Application number: CN201980048406.8A
Authority: CN
Inventors: 巴纳比·巴姆福思; 卡梅伦·弗雷林; 安娜·席尔瓦-韦瑟利; 马格达莱纳·斯托拉雷克-雅努什凯维奇
Original assignee: Bio Fidelity Ltd
Current assignee: Bio Fidelity Ltd
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: JP6947464B2; CA3103754C; KR102589502B1; ES2874753T3; EP3682030B1; AU2019307835B2; KR20210033981A; CN112424379A; CA3103754A1; US10961569B2; JP2021524287A; US20200354786A1; CN116334190A; IL280222A; SG11202100163TA; EP3889273A1; AU2019307835A1; EP3682030A1; WO2020016590A1; US20210180122A1

Abstract

一种检测给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，其特征在于以下步骤：a.将分析物退火至单链探针寡核苷酸A₀，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与分析物靶序列形成双链复合物的第一中间产物；b.使用焦磷酸解酶从A₀的3’末端在3’‑5’方向上焦磷酸解第一中间产物，以产生部分消化的链A₁和分析物；c.(i)将A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并在5’‑3’方向上针对B延伸A₁链；或者(ii)通过连接A₁的3’和5’末端使其环化；或者(iii)将A₁的3’末端连接到连接探针寡核苷酸C的5’末端；在每种情况下产生寡核苷酸A₂；d.用至少一种单链引物寡核苷酸引发A₂，并产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝；和e.检测来源于多于一个拷贝的信号，并从其推断分析物中存在或不存在多核苷酸靶序列。

Description

改进的多核苷酸序列检测方法

本发明涉及一种改进的多核苷酸序列检测方法，该方法适用于检测大量诊断标志物，包括用于鉴定癌症、感染性疾病和移植器官排斥的那些标志物的存在。它对于伴随诊断测试(companion diagnostic testing)也有用，在伴随诊断测试中，必须可靠和低成本地鉴定一组标志物。

聚合酶链式反应(PCR)是一种众所周知的强有力的技术，用于将实验室和诊断样品中存在的DNA或RNA扩增到可以被可靠检测和/或定量的程度。然而，当用于研究含有低水平的这种分子的分析物样品时，它受到许多限制。首先，虽然该技术可以检测少至单个靶分子，但由于样品中存在的其他核酸序列的不希望的扩增，它容易产生假阳性结果。这使得选择用于启始反应的寡核苷酸引物成为关键；这继而使得设计具有所需特异性水平的引物变得相对复杂。因此，目前市场上许多基于PCR的测试具有有限的特异性。

第二个缺点是，基于PCR的方法的多路复用在实践中被限制在最多几十个靶序列(通常不超过10个)以避免引物-引物相互作用，导致需要相对狭窄的操作窗口。

另一个问题是，由于PCR反应以指数方式循环，靶的定量很困难；反应效率的微小变化对生成的可检测物质的量有巨大影响。因此即使有适当的控制和适当的校准，定量通常限于3倍左右的精确度。

最后，通过PCR扩增方法进行研究的目标区域中的突变可能具有不必要的副作用。例如，有这样的实例，其中因为目标生物体在测试引物所靶向的遗传区域发生突变，导致大量假阴性，FDA批准的测试不得不撤销。相反，如果特定的单核苷酸多态性(SNP)是扩增的目标，那么当野生型变体存在时，PCR方法通常会产生假阳性。避免这种情况需要非常仔细的引物设计，并进一步限制了多路复用的功效。这在搜索SNP的组时尤其重要，因为这是癌症测试/筛查或伴随诊断的常见要求。

发明概述

我们现在已经开发了一种新的方法，该方法建立在使用我们早期测序专利(例如参见WO 2016012789)中使用的焦磷酸解(pyrophosphorolysis)方法的经验基础上，以克服许多这些限制。为此，它利用了焦磷酸解的双链特异性；即焦磷酸解反应将不能在单链寡核苷酸底物或包含封闭基团或核苷酸错配的双链底物上有效进行。因此，根据本发明，提供了一种检测给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，其特征在于以下步骤：

a.将分析物退火至单链探针寡核苷酸A₀，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与分析物靶序列形成双链复合物的第一中间产物；

b.使用焦磷酸解酶(pyrophosphorolysing enzyme)从A₀的3’末端在3’-5’方向上焦磷酸解第一中间产物，以产生部分消化的链A₁和分析物；

c.(i)将A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并在5’-3’方向上针对B延伸A₁链；或者(ii)通过连接A₁的3’和5’末端使其环化；或者(iii)将A₁的3’末端连接到连接探针寡核苷酸C的5’末端；在每种情况下产生寡核苷酸A₂；

d.用至少一种单链引物寡核苷酸引发A₂，并产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝；和

e.检测来源于多于一个拷贝的信号，并从其推断分析物中存在或不存在多核苷酸靶序列。

可应用本发明的方法的分析物是包括被寻找的靶多核苷酸序列的那些核酸，诸如天然存在的或合成的DNA或RNA分子。在一种实施方案中，分析物通常存在于含有分析物和其他生物材料的水性溶液中，并且在一种实施方案中，分析物将与其他背景核酸分子一起存在，这些背景核酸分子并不是测试目的所关注的。在一些实施方案中，相对于这些其他核酸组分，分析物将以低的量存在。优选地，例如，当分析物来源于含有细胞物质的生物样品时，在执行方法的步骤(a)之前，将使用样品制备技术诸如过滤、离心、色谱或电泳，除去一些或所有这些其他核酸和外来生物物质。合适地，分析物来源于取自哺乳动物受试者(尤其是人类患者)的生物样品，诸如血液、血浆、痰、尿液、皮肤或活组织检查。在一种实施方案中，将对生物样品进行裂解，以便通过破坏任何存在的细胞来释放分析物。在其他实施方案中，分析物可能已经以游离形式存在于样品本身中；例如在血液或血浆中循环的无细胞DNA。

附图简述

图1：实施例1的反应产物的凝胶电泳图像。可以看出，在寡核苷酸2的存在下，寡核苷酸1被降解到其从寡核苷酸2解链的长度，留下长度为约50个核苷酸的缩短的寡核苷酸。相反，在寡核苷酸3的存在下，由于寡核苷酸1的3’末端的单核苷酸错配，没有观察到焦磷酸解。在寡核苷酸4-6的存在下，寡核苷酸1的焦磷酸解进行到单碱基错配的位置，在该位置焦磷酸解停止，留下不被进一步降解的缩短的寡核苷酸。

图2：实施例2的反应产物的凝胶电泳图像。可以看出，缩短的寡核苷酸(寡核苷酸1)通过连接反应被有效地环化，并且在随后的核酸外切酶消化中幸存，而未缩短的寡核苷酸(寡核苷酸2)不被环化并且被有效地消化。

图3：实施例3的反应产物的凝胶电泳图像。可以看出，当缩短的寡核苷酸在实施例2中存在并被环化时，通过这种扩增产生大量产物。相反，当未缩短的寡核苷酸在实施例2中存在并且没有发生环化时，没有可观察到的DNA扩增。

图4：如实施例4中描述的测量的荧光痕迹。可以看出，在焦磷酸(pyrophosphate)或亚氨基二磷酸(imidodiphosphate)的存在下发生焦磷酸解，但在焦磷酸或亚氨基二磷酸的不存在下未发生焦磷酸解。类似地，在不存在聚合酶的对比实验中，没有产生荧光信号。在焦磷酸存在下的焦磷酸解产生游离核苷酸三磷酸，而在亚氨基二磷酸存在下的焦磷酸解产生在β和γ磷酸之间的O被N-H基团代替的修饰的游离核苷酸三磷酸(nucleotidetriphosphates)(2’-脱氧核苷-5’-[(β,γ)-亚氨基]三磷酸)。

图5：实施例5，从滚环扩增产生的扩增产物的解链峰结果，滚环扩增使用针对EGFR基因可能发生的三种不同突变的引物：(i)T790M(外显子20)、(ii)C797S(外显子20)和(iii)L861Q(外显子21)。温度升至95℃，测量以0.5℃间隔进行。在(iv)中，解链峰的位置可用于鉴定存在何种突变，即T790M、C797S或L861Q。

图6：如实施例7所述，在0.1％和0.5％突变等位基因频率(MAF)，表皮生长因子受体(EGFR)外显子19突变的单孔10重检测：相对于野生型(WT)的信号结果。

图7：如实施例7所述，用于在单个孔中以两种颜色同时检测和鉴定0.1％和1％的T790M(i)和C797S(ii)EGFR突变：相对于野生型的信号结果。

图8：(i)如实施例8所述，在来自测定探针和对照探针的L858R EGFR突变的存在下观察到的相对于野生型的信号，和(ii)从每种样品的测定探针的信号减去对照探针信号的结果。

图9：本发明方法的步骤a至b的一种实施方案。在步骤a中，单链探针寡核苷酸A₀退火至靶多核苷酸序列，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与靶多核苷酸序列形成双链复合物的第一中间产物。在本发明的这个简化实施方案中，存在两种A₀分子和一种靶多核苷酸序列，以说明未退火至靶的A₀如何不参与该方法的另外步骤。在步骤a的这个说明性实例中，A₀的3’末端与靶多核苷酸序列退火，而A₀的5’末端不与靶多核苷酸序列退火。A₀的5’末端包括5’化学封闭基团、共同的引发序列和条形码区域。

在步骤b中，部分双链的第一中间产物用焦磷酸解酶(pyrophosphorolysingenzyme)从A₀的3’末端在3’-5’方向焦磷酸解，以产生部分消化的链A₁、分析物和在步骤a中没有退火至靶的未消化的A₀分子。

图10：本发明方法的步骤c(i)和d的一种实施方案。在步骤c(i)中，A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并且A₁链针对B在5’-3’方向延伸以产生寡核苷酸A₂。在这个说明性的实例中，触发寡核苷酸B具有5’化学封闭。来自该方法步骤b的未消化的A₀退火至触发寡核苷酸B，然而它不能针对B在5’-3’方向延伸以产生为步骤d的扩增引物的靶的序列。

在步骤d中，A₂用至少一种单链引物寡核苷酸引发，并产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝。

图11：本发明方法的步骤c(ii)和d的一种实施方案。在步骤c(ii)中，A₁退火至夹板寡核苷酸(splint oligonucleotide)D，并且然后通过连接其3’和5’末端而环化。在步骤d中，用至少一种单链引物寡核苷酸引发现在已环化的A₂，并产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝。在这个说明性的实例中，由于3’-修饰(在这个实例中是化学修饰)或通过D的3’末端和A₂的相应区域之间的核苷酸错配，夹板寡核苷酸D不能针对A₁延伸。

图12：本发明方法的步骤c(iii)和d的一种实施方案。在步骤c(iii)中，夹板寡核苷酸D的3’区域退火至A₁的3’区域，而夹板寡核苷酸D的5’区域退火至连接探针C的5’区域。因此，形成了第二中间产物A₂，第二中间产物A₂包括A₁、C和任选地由A₁在5’-3’方向延伸以与C的5’末端相遇而形成的中间区域。在该说明性实例中，连接探针C具有3’化学封闭基团，使得3’-5’核酸外切酶可用于在扩增步骤d之前消化任何未连接的A₁。

具体实施方式

根据本发明，提供了一种检测给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，其特征在于以下步骤：

b.使用焦磷酸解酶从A₀的3’末端在3’-5’方向上焦磷酸解第一中间产物，以产生部分消化的链A₁和分析物；

在一种实施方案中，分析物中的靶多核苷酸序列将是癌性肿瘤细胞的DNA或RNA中的基因或染色体区域，并且其特征在于存在一个或更多个突变；例如以一种或更多种单核苷酸多态性(SNP)的形式。因此，本发明将可用于监测疾病复发。治疗后被宣布无疾病的患者可能会随着时间的推移受到监测，以检测疾病的复发。这需要非侵入性地进行，并且要求从血液样品灵敏地检测靶序列。同样，对于某些癌症，治疗后患者体内仍有残留的癌细胞。使用本发明监测患者血液中存在的这些细胞(或无细胞DNA)的水平，允许检测疾病的复发或当前治疗的失败和切换到替代方案的需求。

在一种实施方案中，对靶多核苷酸序列的检测将允许在疾病治疗期间重复测试患者样品，以允许对产生的治疗抗性进行早期检测。例如，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，诸如吉非替尼、埃罗替尼，通常用作非小细胞肺癌(NSCLC)的一线治疗。在治疗过程中，肿瘤通常会在EGFR基因中产生突变(例如T790M、C797S)，这产生对治疗的抗性。对这些突变的早期检测允许患者转向替代疗法。

在一种实施方案中，分析物中的靶多核苷酸序列将是胎儿来源的DNA或RNA中的基因或染色体区域，并且其特征在于存在一个或更多个突变；例如以一种或更多种单核苷酸多态性(SNP)的形式。因此，与其他可用的检测技术相比，本发明可用于在妊娠的更早阶段检测非常低等位基因分数的突变。

在另一种实施方案中，靶多核苷酸序列可以是来源于其他方面健康个体的基因或基因组区域，但是获得的遗传信息可以有助于在人类群体中的一个或更多个确定的群体中生成允许得出医学或治疗结论的有价值的伴随诊断信息。

在又另一种实施方案中，靶多核苷酸序列可以是感染性疾病特有的；例如细菌或病毒的基因或染色体区域特有的多核苷酸序列。

在一种实施方案中，靶多核苷酸序列可以是供体DNA特有的。当移植的器官被患者排斥时，来自该器官的DNA脱落进入患者的血流中。这种DNA的早期检测将允许早期检测排斥。这可以使用供体特异性标志物的定制组，或者通过使用已知在群体中常见的变体的组来实现，其中一些将存在于供体中，并且一些存在于接受者中。因此，通过请求保护的方法能够随时间对器官接受者进行常规监测。

在又另一种实施方案中，使用探针和触发寡核苷酸的不同组合的方法的不同版本(见下文)被并行使用，使得可以同时筛选分析物的多于一个靶序列；例如癌症源、癌症指示物或多于一种感染源。在该方法中，通过并行应用该方法在步骤(d)中获得的扩增产物与包括一种或更多种寡核苷酸结合染料或序列特异性分子探针诸如分子信标、发夹探针等的检测组接触。因此，在本发明的另一个方面，提供了下文定义的至少一种探针和任选地一种触发寡核苷酸与一种或更多种对靶多核苷酸序列有选择性的化学和生物探针组合的用途，或者下文定义的至少一种探针和任选地一种触发寡核苷酸与使用测序来鉴定扩增的探针区域组合的用途。

本发明方法的步骤(a)包括使在给定样品中寻求其存在的分析物与单链探针寡核苷酸A₀退火。在一种实施方案中，该寡核苷酸包含引发区域和与待检测的靶多核苷酸序列互补的3’末端。通过这种方式，产生了为至少部分双链的第一中间产物。在一种实施方案中，该步骤在过量A₀的存在下和在含有分析物和任何其他核酸分子的水性介质中进行。

在一种实施方案中，当将在步骤(e)中使用分子探针进行检测时，探针寡核苷酸A₀被配置为在与靶序列互补的区域的5’侧包括寡核苷酸识别区域，并且所使用的分子探针被设计为退火至该识别区域。在一种实施方案中，只有A₀的互补区能够退火至靶；即，任何其他区域缺乏与分析物在进行步骤(b)的温度存在稳定的双链体的充分的互补性。这里和全文中，术语“充分的互补性”是指，就给定区域与分析物上的给定区域具有互补性而言，互补性的区域超过10个核苷酸长。

在一种优选的实施方案中，A₀的5’末端或引发区5’侧的内部位点被赋予对核酸外切酶解的抗性。通过这种方式，并且在步骤(b)之后，可以任选地将具有5’-3’核酸外切活性(exonucleolytic activity)的核酸外切酶添加到反应介质中，以消化存在的任何其他核酸分子，同时使A₀和包含部分消化的链A₁的任何材料完整。合适地，这种对核酸外切酶解的抗性通过在寡核苷酸A₀的所需位点引入一个或更多个封闭基团来实现。在一种实施方案中，这些封闭基团可以选自硫代磷酸酯键(phosphorothioate linkages)和本领域常用的其他骨架修饰、C3间隔基、磷酸基团(phosphate group)、修饰的碱基等。在又另一种实施方案中，A₀相对于触发寡核苷酸的3’和5’末端中的一个或两个具有寡核苷酸瓣错配(flapmismatch)，这将在下面进一步描述。

在一种实施方案中，识别区域将包含条形码编码区(barcoding region)或嵌入在条形码编码区，该条形码编码区具有独特的序列，并适于在步骤(e)中使用应用于扩增的组分A₂的序列特异性分子探针间接鉴定，或通过这些组分的测序来直接鉴定。可以使用的分子探针的实例包括但不限于分子信标、

探针、

探针等。

在该方法的步骤(b)中，第一中间产物的双链区从其A₀链的3’末端在3’-5’方向上被焦磷酸解。因此，A₀链被逐步消化，产生部分消化的链；以下称为A₁。当探针寡核苷酸错误地与非靶序列杂交时，焦磷酸解反应将在任何错配处停止，阻止该方法的后续步骤继续进行。在另一种实施方案中，这种消化继续，直到A₁缺乏与分析物或其中的靶区域形成稳定的双链体的充分的互补性。此时，各个链然后通过解链分离，从而产生单链形式的A₁。在典型的焦磷酸解条件下，当分析物和A₀之间有6至20个互补核苷酸时，发生这种分离。

合适地，焦磷酸解步骤(b)在反应介质中，在20至90℃的温度范围内，在显示焦磷酸解活性的聚合酶和焦磷酸根离子源(source of pyrophosphate ion)的存在下进行。关于应用于多核苷酸消化的焦磷酸解反应的另外信息可以在例如J.Biol.Chem.244(1969)pp.3019-3028或我们早期的专利申请中找到。

在一种实施方案中，焦磷酸解步骤(b)由过量聚焦磷酸(polypyrophosphate)源的存在驱动，合适的源包括含有3个或更多个磷原子的那些化合物。

在一种实施方案中，焦磷酸解步骤(b)由过量的修饰的焦磷酸(modifiedpyrophosphate)源的存在驱动。合适的修饰的焦磷酸包括用其他原子或基团取代桥接氧的那些，或在其他氧上用取代或修饰基团取代的焦磷酸(或聚焦磷酸)。本领域技术人员将会理解，存在许多这样的适用于本发明的修饰的焦磷酸的实例，它们的非限制性选择是：

在一种优选的实施方案中，焦磷酸根离子源是PNP、PCP或三聚磷酸(PPPi)。

此外，但不限于，焦磷酸解步骤(b)中使用的焦磷酸根离子源的实例可以在WO2014/165210和WO00/49180中找到。

在一种实施方案中，过量的修饰的焦磷酸源可以表示为Y-H，其中Y对应于通式(X-O)₂P(＝B)-(Z-P(＝B)(O-X))_n-，其中n是1至4的整数；每个Z-独立地选自-O-、-NH-或-CH₂-；每个B独立地是O或S；X基团独立地选自-H、-Na、-K、烷基、烯基或杂环基团，条件是当Z和B都对应于-O-时，并且当n为1时，至少一个X基团不是H。

在一种实施方案中，Y对应于通式(X-O)₂P(＝B)-(Z-P(＝B)(O-X))_n-，其中n是1、2、3或4。在另一种实施方案中，Y基团对应于通式(X-O)₂P(＝O)-Z-P(＝O)(O-H)-，其中X基团之一是-H。在又另一种优选实施方案中，Y对应于通式(X-O)₂P(＝O)-Z-P(＝O)(O-X)-，其中X基团中的至少一个选自甲基、乙基、烯丙基或二甲基烯丙基。

在替代实施方案中，Y对应于通式(H-O)₂P(＝O)-Z-P(＝O)(O-H)-(其中Z是-NH-或-CH₂-)或(X-O)₂P(＝O)-Z-P(＝O)(O-X)-(其中X基团都是-Na或-K，并且Z是-NH-或-CH₂-)。

在另一种实施方案中，Y对应于通式(H-O)₂P(＝B)-O-P(＝B)(O-H)-，其中每个B基团独立地是O或S，至少一个是S。

Y的优选实施方案的具体实例包括式(X1-O)(HO)P(＝O)-Z-P(＝O)(O-X2)的那些，其中Z是O、NH或CH₂，并且(a)X1是γ,γ-二甲基烯丙基，并且X2是-H；或者(b)X1和X2都是甲基；或者(c)X1和X2都是乙基；或者(d)X1是甲基且X2是乙基，或反之亦然。

在一种实施方案中，步骤(b)在磷酸酶存在下进行，以通过水解由焦磷酸解反应产生的核苷三磷酸来连续除去。在另一种实施方案中，在步骤(b)之后加入焦磷酸酶以水解任何残留的焦磷酸根离子(pyrophosphate ion)，从而确保在后续步骤中不会发生进一步的焦磷酸解。在另一种实施方案中，迭代步骤(a)和(b)，使得从每个靶分子产生多于一个拷贝的A₁。这可在后续步骤执行之前或同时发生。当与步骤(d)中的扩增组合时，这种迭代导致进一步提高该方法的灵敏度和可靠性，并且通过引入初始线性扩增，允许靶多核苷酸的更精确定量。

在一种优选但非必需的实施方案中，在步骤(b)结束时或在步骤(c)之前或之后，引入一个中间步骤，其中加入具有5’-3’方向活性的核酸外切酶，以确保除了包含A₀或A₁链的核酸物质(其中存在5’封闭基团)之外，存在的任何残留核酸物质被破坏。在另一种实施方案中，该核酸外切酶在进行步骤(d)之前被失活。在又另一种实施方案中，在进行该核酸外切酶解之前或同时，使用例如激酶和磷酸供体(phosphate donor)诸如ATP，使所有存在的核酸材料在其5’末端被磷酸化，以产生由某些类型的5’-3’核酸外切酶启动核酸外切酶解所需的磷酸化末端位点。

在步骤(b)之后，或者在相关的上述中间步骤中，在一种实施方案(i)中，A₁退火至单链触发寡核苷酸B，以产生也是部分双链的第二中间产物。在一种实施方案中，B包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域，在其5’末端具有与A₀基本上不互补的侧翼寡核苷酸区域。这里和全文中，术语“基本上不互补”或等效措辞是指，就给定侧翼区域与A₀上的给定区域具有互补性而言，互补性的区域小于10个核苷酸长。此后，在步骤(c)中，该第二中间产物的A₁链在5’-3’方向上延伸以产生第三中间产物，该第三中间产物包含B和延伸的A₁链(以下称为A₂)。

在另一种实施方案中，B包含(i)与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域；(ii)与A₁的5’末端互补的寡核苷酸区域和任选的(iii)这两个区域之间的中间寡核苷酸区域，并且其中B通过一个或更多个核苷酸错配或其3’末端的化学修饰的存在而不能进行针对A₁的延伸。在另一种实施方案中，B在其3’末端和内部都被修饰，以防止其他寡核苷酸针对它延伸。

在这两种实施方案中，B合适地包含寡核苷酸区域，每个寡核苷酸区域独立地多达150个核苷酸长，通常为5至100个核苷酸长，并且最优选地10至75个核苷酸长。在一种实施方案中，B的所有区域独立地具有10至50个核苷酸范围内的长度。在另一种优选的实施方案中，B的5’末端或与其相邻的区域也用上述类型的封闭基团保护，以使其对核酸外切酶解具有抗性。在一些实施方案中，B的5’末端自身折叠形成双链发夹区。在又另一种实施方案中，B的3’和5’末端都与其A₁对应链的末端有一个或更多个核苷酸错配。

在另一种实施方案中，步骤(c)可选地包括(ii)在连接酶的存在下将A₁的两个末端连接在一起，以产生第三中间产物，其中A₁链不延伸而是被环化。这种连接通常通过添加夹板寡核苷酸D来进行，夹板寡核苷酸D具有与A₁的3’和5’末端互补的区域，使得当退火至D时，A₁的3’和5’末端形成可被连接的切口或可在后续连接之前填充的缺口。在该实施方案中，对于后续步骤的目的，环化的A₁实际上变成A₂。在另一种实施方案中，使用缺乏5’-3’核酸外切酶和链置换活性的聚合酶，A₁链仍然在5’-3’方向延伸，并且然后被环化，使得该延伸和环化的产物实际上变成A₂。在另一种实施方案中，A₁或延伸的A₁的3’和5’末端通过桥接基团连接在一起，所述桥接基团不一定包括寡核苷酸区域。

在第三中间产物包含环化的A₂链的情况下，用核酸外切酶或核酸外切酶的组合处理步骤(c)中生成的反应混合物以消化任何未环化的残留核酸组分是有利的。此后，在另一种实施方案中，在步骤(d)发生之前，核酸外切酶被失活。

在另一种实施方案(iii)中，步骤(c)在连接探针C、连接酶、以及任选地缺乏链置换能力和5’-3’方向核酸外切酶活性二者的聚合酶的存在下进行，所述连接探针C具有与夹板寡核苷酸D的至少一部分5’末端区域或与靶寡核苷酸互补的5’区域。通过这种方式，形成第二中间产物，其中A₂链包括A₁、C和任选地由A₁在5’-3’方向延伸以与C的5’末端相遇而形成的中间区域。在这种实施方案中，选择在步骤(d)中使用的引物(见下文)来扩增A₂的至少一个区域，该区域包括已经发生A₁与C的连接的位点。在这种实施方案中，我们发现在C上包含3’封闭基团是有利的，这样3’-5’核酸外切酶可以用于在扩增前消化任何未连接的A₁。可以使用的合适的聚合酶包括但不限于Hemo KlenTaq、Mako和Stoffel片段。

在一种实施方案中，当采用步骤c(ii)或c(iii)时，A₁任选在连接前在5’-3’方向上延伸。在一种实施方案中，这种任选的延伸和连接针对靶寡核苷酸进行，而在另一种实施方案中，它们通过添加另一种夹板寡核苷酸D来进行，A₁在延伸和/或连接之前退火至夹板寡核苷酸D。在一种实施方案中，D包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5’末端或A₁的5’末端互补的区域。在另一种实施方案中，由于3’末端修饰或通过D的3’末端和A₁的相应区域之间的核苷酸错配，D不能针对A₁延伸。

在随后的步骤(d)中，使A₂链或其期望区域经历扩增，从而产生多于一个拷贝，通常是数百万个拷贝。这通过用单链引物寡核苷酸引发A₂的区域和随后由A2衍生的任何扩增子来实现，所述单链引物寡核苷酸例如以正向/反向或有义/反义对的形式提供，其可以退火至A2的区域和随后A2衍生的任何扩增子上的互补区域。然后引发的链成为扩增的起点。扩增方法包括但不限于热循环和等温方法，诸如聚合酶链式反应、重组酶聚合酶扩增和滚环扩增；当A₂被环化时，最后一项适用。通过这些方法中的任何一种，A₂的许多扩增子拷贝和在某些情况下它的序列互补物可以被快速产生。执行这些扩增方法中的任何一种的确切方法对于普通技术人员来说是熟知的，并且所采用的确切条件和温度模式在读者所阅读的一般文献中是容易获得的。具体地，在聚合酶链式反应(PCR)的情况下，该方法通常包括使用聚合酶和多种单核苷三磷酸的源在5’-3’方向上针对A₂链延伸引物寡核苷酸，直到产生互补链；将产生的双链产物去杂交以再生A₂链和互补链；重新引发A₂链及其任何扩增子，并且然后多次重复这些延伸/去杂交/重新引发步骤，以将A₂扩增子的浓度建立到其可以被可靠检测的水平。

最后，在步骤(e)中，检测扩增子，并且获得的信息用于推断多核苷酸靶序列是否存在于原始分析物中和/或与其相关的性质。例如，通过这种方式，可以参照正在寻找的特定SNP来检测癌性肿瘤细胞特有的靶序列。在另一种实施方案中，可以检测病毒或细菌基因组(包括其新突变)特有的靶序列。可以使用许多检测扩增子或识别区的方法，包括例如寡核苷酸结合染料、序列特异性分子探针诸如荧光标记的分子信标或发夹探针。可选地，A₂扩增子的直接测序可以使用本领域采用或报道的直接测序方法之一来进行。当使用寡核苷酸结合染料、荧光标记的信标或探针时，使用包括刺激电磁辐射的源(激光、LED、灯等)和光电检测器的布置来检测扩增子是方便的，所述光电检测器被布置成检测发射的荧光并从其生成包括数据流的信号，所述数据流可以由微处理器或计算机使用专门设计的算法进行分析。

在本发明的一种具体表现形式中，使用多于一种A₀探针，每种探针对不同的靶序列具有选择性，并且每种探针包括识别区。在一种实施方案中，随后在步骤(d)中扩增的区域包括该识别区。在另一种实施方案中，步骤(d)中生成的扩增子然后通过检测识别区来推断。然后，鉴定可以包括使用分子探针或测序方法，例如Sanger测序、

测序或我们先前描述的方法之一。在另一种表现形式中，在步骤(a)之前，分析物被分成多于一个反应体积，每个体积具有不同的探针寡核苷酸A₀或多于一个被设计用于检测不同靶序列的探针寡核苷酸A₀。在另一种优选的实施方案中，不同的探针A₀包含允许一个或一组引物用于扩增步骤(d)的共同的引发位点。

在一些实施方案中，扩增步骤(d)可以通过标准聚合酶链式反应(PCR)或通过等温扩增诸如滚环扩增(RCA)来进行。在一些实施方案中，RCA可以是指数RCA的形式，例如超分支RCA，其可以产生多种不同长度的双链DNA。在一些实施方案中，可以期望提供能够产生具有不同长度的不同产物的不同探针。

在一些实施方案中，步骤(e)还包括以下步骤：

i.使用一种或更多种寡核苷酸荧光结合染料或分子探针标记A₂或A₂的区域的多于一个拷贝；

ii.测量所述多于一个拷贝的荧光信号；

iii.将所述多于一个拷贝暴露于一组变性条件；和

iv.通过监测暴露于变性条件期间所述多于一个拷贝的荧光信号的变化来鉴定分析物中的多核苷酸靶序列。

在一些实施方案中，步骤(e)可以采用使用解链曲线分析的检测和分析的形式。解链曲线分析可以作为加热过程中双链DNA解离特性的评估。样品中50％的DNA变性成两条独立链的温度被称为解链温度(Tm)。随着温度升高，双链开始解离，不同的双链DNA分子基于组成(G-C碱基对具有3个氢键，而A-T之间只有2个——因此G-C需要比A-T更高的温度来分离)、长度(具有更多氢键的更长的双链DNA比更短的链要求更高的温度来完全解离成两条独立的单链)和互补性(具有大量错配的DNA分子由于在匹配的碱基对之间含有更少的氢键而具有更低的Tm)在不同的温度解离。

在一些实施方案中，扩增步骤(d)可以在嵌入荧光剂的存在下进行。因此，当进行解链曲线分析时，监测荧光的变化，其指示反应产物的Tm(以及因此指示同一性)，并从而指示靶多核苷酸序列。可以使用包括刺激电磁辐射的源(激光、LED、灯等)和光电检测器的布置来检测荧光的变化，所述光电检测器被布置成检测发射的荧光并从其生成包括数据流的信号，所述数据流可以由微处理器或计算机使用专门设计的算法进行分析。

嵌入荧光剂可以是对双链DNA有特异性的染料，诸如SYBR绿(SYBR green)、EvaGreen、LG绿(LG Green)、LC绿Plus(LC Green Plus)、ResoLight、Chromofy或SYTO 9。本领域技术人员将理解，存在许多可以用于本发明的嵌入荧光剂，并且上述列表不旨在限制本发明的范围。嵌入荧光剂可以是荧光标记的DNA探针。在本发明的一种实施方案中，并列探针(juxtapositioned probes)(一个探针包含荧光团，另一个探针包含合适的猝灭剂)可用于确定DNA探针与靶扩增序列的互补性。

在本发明的另一方面，提供了一种鉴定给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，其特征在于以下步骤：

a.将核酸分析物退火至单链探针寡核苷酸A₀，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与分析物靶序列形成双链复合物的第一中间产物；

d.用至少一种单链引物寡核苷酸引发A₂，并产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝；

e.使用一种或更多种寡核苷酸荧光结合染料或分子探针标记A₂或A₂的区域的多于一个拷贝；

f.测量多于一个拷贝的荧光信号；

g.将多于一个拷贝暴露于一组变性条件；和

h.通过监测暴露于变性条件期间多于一个拷贝的荧光信号的变化来鉴定靶多核苷酸序列。

在一些实施方案中，变性条件可以通过改变温度来提供，例如将温度升高到双链开始解离的点。另外地或可选地，变性条件也可以通过改变pH以使条件为酸性或碱性来提供，或通过加入添加剂或试剂诸如强酸或强碱、浓缩无机盐或有机溶剂例如醇来提供。

在本发明的另一方面，其可以与第一方面的方法结合使用或独立使用，单链形式的分析物可以通过一系列设计用于扩增分析物并将分析物从背景基因组DNA中分离的初步步骤从上述生物样品制备，背景基因组DNA通常以显著过量存在。该方法通常可适用于单链靶分析物的产生，并且因此方法在除了与本发明第一方面的方法整合或进一步包括该方法的一部分的情况下也是有用的。因此，提供了一种用于制备包含靶多核苷酸区域的核酸的至少一种单链分析物的方法，其特征在于以下步骤：(i)通过对包含分析物的相应双链形式和任选地背景基因组DNA的生物样品进行扩增循环来产生分析物的扩增子。在一种优选的实施方案中，在聚合酶、核苷三磷酸和至少一种相应的引物对的存在下，使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，其中一种引物包括5’-3’核酸外切酶封闭基团，和(ii)任选地用具有5’-3’核酸外切活性的核酸外切酶消化步骤(i)的产物。在一种实施方案中，该方法还可以包括(iii)使步骤(ii)的产物与蛋白酶反应以破坏聚合酶，并且然后(iv)通过将步骤(iii)的产物加热至超过50℃的温度来使蛋白酶失活。

在一种优选实施方案中，步骤(i)至(iv)在本发明第一方面的方法的步骤(1)之前进行，以产生检测来源于生物样品的靶序列的整合方法。在另一种实施方案中，在进行步骤(i)之前，生物样品已经经历了细胞裂解。

在步骤(i)的一种实施方案中，核苷三磷酸是天然存在的DNA特有的四种脱氧核苷三磷酸的混合物。在优选的实施方案中，脱氧核苷三磷酸的混合物包含脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate，dUTP)而不是脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate，dTTP)，并且步骤(i)还在dUTP-DNA糖基化酶(UDG)的存在下进行，以去除来自先前的测定的任何污染的扩增子。在又另一种实施方案中，在步骤(i)中使用高保真聚合酶，例如以商标

或Q5出售的那些聚合酶之一。

在一种实施方案中，步骤(i)使用有限数量的引物和过量的扩增循环进行。通过这种方式，不管分析物的初始量如何，产生固定量的扩增子。因此，避免了在后续步骤之前对分析物进行定量的需要。在步骤(i)的另一种实施方案中，其优点是不需要步骤(ii)，扩增在引物对的存在下进行，其中两个引物中的一个过量于另一个存在，一旦一个引物被充分利用，导致产生单链扩增子。

在步骤(ii)的一种优选实施方案中，5’引物被核酸外切酶封闭基团封闭，核酸外切酶封闭基选自硫代磷酸酯键、反向碱基(inverted base)、DNA间隔基和本领域周知的其他寡核苷酸修饰。在另一种实施方案中，该对引物中的另一个引物在其5’末端具有磷酸基团。

在一种实施方案中，在步骤(iii)中使用的蛋白酶是蛋白酶K，并且步骤(iv)通过加热至80至95℃的温度保持长达30分钟来进行。在另一种实施方案中，在步骤(ii)之后但在步骤(b)之前某时，用三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)或其他磷酸酶处理反应介质，以除去可能存在的任何残余核苷三磷酸。

在本发明的另一方面，提供了一种替代实施方案，其中用使用双链特异性核酸外切酶的核酸外切酶消化步骤代替磷酸解步骤(b)。本领域技术人员将理解，双链特异性核酸外切酶包括那些在3’-5’方向上阅读的核酸外切酶，诸如ExoIII，以及那些在5’-3’方向上阅读的核酸外切酶，诸如Lambda Exo，等等。

在该方面的一种实施方案中，步骤(b)的双链特异性核酸外切酶在3’-5’方向进行。在这样的实施方案中，本发明的方法特征在于以下步骤：

b.用双链特异性核酸外切酶从A₀的3’末端在3’-5’方向上消化第一中间产物，以产生部分消化的链A₁和分析物；

c.(i)将A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并在5’-3’方向上针对B延伸A₁链；或者(ii)通过连接使A₁的3’和5’末端使其环化；或者(iii)将A₁的3’末端连接到连接探针寡核苷酸C的5’末端；在每种情况下产生寡核苷酸A₂；

在该方面的一种实施方案中，步骤(b)的双链特异性核酸外切酶在5’-3’方向进行。在这样的实施方案中，本发明的方法特征在于以下步骤：

a.将分析物退火至单链探针寡核苷酸A₀，以产生为至少部分双链并且其中A₀的5’末端与分析物靶序列形成双链复合物的第一中间产物；

b.使用双链特异性核酸外切酶从A₀的5’末端在5’-3’方向上消化第一中间产物，以产生部分消化的链A₁和分析物；

c.(i)将A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并在5’-3’方向上针对B延伸A₁链；或者(ii)通过连接A₁的3’和5’末端使其环化；或者(iii)将A₁的5’末端连接到连接探针寡核苷酸C的3’末端；在每种情况下产生寡核苷酸A₂；

在本发明的实施方案中，其中步骤(b)利用双链特异性5’-3’核酸外切酶，A₀的5’末端与靶分析物互补，并且共同的引发序列和封闭基团位于与靶互补的区域的3’侧。在另一种实施方案中，当将在步骤(e)中使用分子探针进行检测时，探针寡核苷酸A₀被配置为在与靶序列互补的区域的3’侧包括寡核苷酸识别区域，并且所使用的分子探针被设计为退火至该识别区域。

在本发明的实施方案中，其中步骤(b)利用双链特异性5’-3’核酸外切酶，在步骤b之后，具有3’至5’核酸外切活性的核酸外切酶可以任选地被加入到反应混合物中，以消化存在的任何其他核酸分子，同时使A₀和包含部分消化的链A₁的任何材料保持完整。适当地，这种对核酸外切酶解的抗性如前所述获得。

应当理解，通过使用多于一种不同的A₀和任选地B、C或D组分，本发明的方法可以应用于包含多于一种不同分析物的反应混合物，每种组分与不同的分子探针等相关联。在这种多路复用方法中，使得能够检测特定癌症或多种感染性疾病等特有的多于一个靶区域。在一种实施方案中，优选的是，生成的每个不同的A₂链具有共同的引物位点但具有不同的识别区，使得一种或一组引物能够用于扩增步骤(d)。

在本发明的另一个方面，提供了上述方法来筛查哺乳动物受试者，尤其是人类患者中感染性疾病、癌症的存在或生成伴随诊断信息的用途。

在本发明的另一方面，提供了用于上述方法的对照探针。本发明的实施方案包括那些通过生成荧光信号来阐明一个或更多个特定靶序列的存在的实施方案。

在这样的实施方案中，可能不可避免地存在由样品中存在的非靶DNA生成的信号水平。对于给定的样品，该背景信号比“真实”信号的开始时间晚，但是这样的开始在样品之间可能不同。因此，准确检测低浓度的一种或多于一种靶序列的存在，依赖于在靶序列的不存在下预期什么信号的知识。对于人为样品(contrived sample)，参照物是可用的，但是对于来自患者的真正“盲”样本，情况并非如此。对照探针(E₀)用于确定每种测定探针的预期背景信号特征。对照探针靶向样品中不期望存在的序列，并且然后从该探针生成的信号可用于推断在靶序列的不存在下来自样品的信号生成的预期速率。

因此，提供了一种检测给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，其特征在于以下步骤：

a.将单链探针寡核苷酸A₀添加至样品以与靶分析物退火，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与分析物靶序列形成双链复合物的第一中间产物；

e.检测来源于多于一个拷贝的信号；

f.随后或同时地，使用样品的单独等分试样或者在同一等分试样中并使用第二检测通道，使用第二单链探针寡核苷酸E₀重复步骤(a)至(e)，所述第二单链探针寡核苷酸E₀具有与靶序列至少部分错配的3’末端区域；

g.从(f)的结果推断在样品中任何靶分析物的不存在下预期从A₀生成的背景信号；和

h.通过比较(g)中推断的预期的背景信号和(e)中观察到的实际信号，推断分析物中存在或不存在多核苷酸靶序列。

在一些实施方案中，根据本发明的步骤(e)中的方法通过以下方式发生：

ii.测量步骤(d)中产生的多于一个拷贝的荧光信号；

iii.将多于一个拷贝暴露于一组变性条件；和

iv.与对步骤(f)的产物进行的相同测量相比，通过监测暴露于变性条件期间多于一个拷贝的荧光信号的变化来检测扩增产物的存在和鉴定。

在一种实施方案中，对照探针(E₀)和A₀被添加到样品的不同部分，而在另一种实施方案中，E₀和A₀被添加到样品的相同部分并且不同检测通道(例如，不同的彩色染料)用于测量它们各自的信号。然后可以利用E₀生成的信号来推断和校正在样品中不存在多核苷酸靶序列时预期由A₀生成的背景信号。例如，背景信号的校正可以包括从A₀观察到的信号减去从E₀观察到的信号，或者通过使用A₀和E₀在不同条件下生成的相对信号的校准曲线来校准从A₀观察到的信号。

在一种实施方案中，可以使用一种E₀来校准可能产生的所有测定探针。

在一种实施方案中，可以使用单独的E₀来校准在初始扩增步骤中生成的样品DNA的每个扩增子。每个扩增子可以包含多于一个感兴趣的突变/靶序列，但是单个E₀足以校准针对单个扩增子的所有的测定探针。

在另一种实施方案中，可以对每种靶序列使用单独的E₀。例如，如果C>T突变是被靶向的，那么可以设计一种E₀，其靶向在患者体内是未知存在的同一位点的C>G突变。E₀在多种条件下生成的信号曲线可以在校准反应中进行评估，并且这些数据用于推断当该变体不存在时，来自靶向C>T变体的测定探针的预计的信号。

在图9至图12中可以看到本发明方法的一种实施方案。在图9中，示出了步骤a至b的一种实施方案。在步骤a中，单链探针寡核苷酸A₀退火至靶多核苷酸序列，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与靶多核苷酸序列形成双链复合物的第一中间产物。在本发明的这个简化实施方案中，存在两个A₀分子和一个靶多核苷酸序列，以说明未退火至靶的A₀如何不参与该方法的另外步骤。在步骤a的这个说明性实例中，A₀的3’末端与靶多核苷酸序列退火，而A₀的5’末端不与靶多核苷酸序列退火。A₀的5’末端包括5’化学封闭基团、共同的引发序列和条形码区域。

在步骤b中，部分双链的第一中间产物用焦磷酸解酶从A₀的3’末端在3’-5’方向焦磷酸解，以产生部分消化的链A₁、分析物和在步骤a中没有退火至靶的未消化的A₀分子。

在图10中，示出了步骤c(i)至d的一种实施方案。在步骤c(i)中，A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并且A₁链针对B在5’-3’方向延伸以产生寡核苷酸A₂。在这个说明性的实例中，触发寡核苷酸B具有5’化学封闭。来自该方法步骤b的未消化的A₀退火至触发寡核苷酸B，然而它不能针对B在5’-3’方向延伸以产生为步骤d的扩增引物的靶的序列。

在图11中，示出了步骤c(ii)至d的一种实施方案。在步骤c(ii)中，A₁退火至夹板寡核苷酸D，并且然后通过连接其3’和5’末端而环化。在步骤d中，用至少一种单链引物寡核苷酸引发现在已环化的A₂，并产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝。在这个说明性的实例中，由于3’-修饰(在这个实例中是化学修饰)或通过D的3’末端和A₂的相应区域之间的核苷酸错配，夹板寡核苷酸D不能针对A₁延伸。

在图12中，示出了步骤c(iii)至d的一种实施方案。在步骤c(ii)中，A₁退火至夹板寡核苷酸D，并且然后通过连接其3’和5’末端而环化。在步骤d中，用至少一种单链引物寡核苷酸引发现在已环化的A₂，并产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝。在这个说明性的实例中，由于3’-修饰(在这个实例中是化学修饰)或通过D的3’末端和A₂的相应区域之间的核苷酸错配，夹板寡核苷酸D不能针对A₁延伸。

本发明方法的特异性可以通过封闭至少一部分野生型DNA，促进A₀仅与靶多核苷酸序列退火来改进。封闭寡核苷酸可用于改进聚合酶链式反应(PCR)的特异性。常用的技术是设计一种寡核苷酸，该寡核苷酸在PCR引物之间退火，并且不能被PCR聚合酶代替或消化。寡核苷酸被设计成与非靶(通常是健康的)序列退火，而与靶(突变的)序列错配(通常相差单个碱基)。这种错配导致针对两个序列的解链温度不同，寡核苷酸被设计成在PCR延伸温度保持与非靶序列退火，同时与靶序列解离。

封闭寡核苷酸通常可以具有修饰，以防止其被PCR聚合酶的核酸外切酶活性消化，或者增加靶序列和非靶序列之间的解链温度差异。

在封闭寡核苷酸中掺入锁核酸(LNA)或其他改变解链温度的修饰可以显著增加寡核苷酸针对靶序列和非靶序列的解链温度差异。

因此，提供了本发明的实施方案，其中使用了封闭寡核苷酸。封闭寡核苷酸必须耐受焦磷酸解(PPL)反应，以确保它们不会被消化或代替。这可以通过多种不同的方式实现，例如通过在3’末端的错配或通过修饰诸如硫代磷酸酯键或间隔基。

在使用封闭寡核苷酸的本发明的这样的实施方案或方面中，检测给定核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法的特征在于以下步骤：

a.将单链封闭寡核苷酸退火至非靶多核苷酸序列的至少一个子集；

b.将分析物靶序列退火至单链探针寡核苷酸A₀，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与分析物靶序列形成双链复合物的第一中间产物；

c.使用焦磷酸解酶从A₀的3’末端在3’-5’方向上焦磷酸解第一中间产物，以产生部分消化的链A₁和分析物；

d.(i)将A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并在5’-3’方向上针对B延伸A₁链；或者(ii)通过使A₁的3’和5’末端连接使其环化；或者(iii)将A₁的3’末端连接到连接探针寡核苷酸C的5’末端；在每种情况下产生寡核苷酸A₂；

e.用至少一种单链引物寡核苷酸引发A₂，并产生A₂或A₂的区域的多于一个拷贝；和

f.检测来源于多于一个拷贝的信号，并从其推断分析物中存在或不存在多核苷酸靶序列。

在一种实施方案中，封闭寡核苷酸通过在其3’末端的错配变得耐受焦磷酸解反应。在另一种实施方案中，封闭寡核苷酸通过3’-封闭基团的存在变得耐受。在另一种实施方案中，封闭寡核苷酸通过间隔基或其他内部修饰的存在变得耐受。在另一种实施方案中，封闭寡核苷酸既包括增加解链温度的修饰或修饰的核苷酸碱基，又变得耐受焦磷酸解。

现在参考以下实验数据来说明本发明。

实施例1：针对单核苷酸错配的焦磷酸解特异性

制备单链第一寡核苷酸1(SEQ ID NO 1)，其具有以下核苷酸序列：

其中A、C、G和T代表携带DNA的相关特征核苷碱基的核苷酸。

还制备了一组单链寡核苷酸2-6(SEQ ID NO 2-6)，其在5’至3’方向上具有以下核苷酸序列：

其中寡核苷酸2包括与寡核苷酸1的3’末端的52个碱基互补的52个碱基的区域，并且寡核苷酸3-6包括分别在1、10、20和30位具有单核苷酸错配的相同区域。

然后制备反应混合物，其具有的组成对应于由以下配方得到的组成：

20uL 5x缓冲液pH 8.0

10uL寡核苷酸1，3000nM

10uL寡核苷酸2、3、4、5或6，3000nM

2.5U Mako DNA聚合酶(例如Qiagen Beverly)

10uL无机焦磷酸(inorganic pyrophosphate)，6mM

0.04U三磷酸腺苷双磷酸酶

水至100uL

其中5x缓冲液包含以下混合物：

50uL三羟甲基氨基甲烷醋酸盐,1M,pH 8.0

25uL乙酸镁水溶液,1M

25uL乙酸钾水溶液,5M

50uL Triton X-100表面活性剂(10％)

水至1mL

然后通过在37℃孵育混合物120分钟进行寡核苷酸1的焦磷酸解，并通过凝胶电泳分析所得的反应产物。

该分析的结果显示在图1中，其中可以看出，在寡核苷酸2的存在下，寡核苷酸1被降解到其从寡核苷酸2解链的长度，留下长度为约50个核苷酸的缩短的寡核苷酸。相反，在寡核苷酸3的存在下，由于寡核苷酸1的3’末端的单核苷酸错配，没有观察到焦磷酸解。在寡核苷酸4-6的存在下，寡核苷酸1的焦磷酸解进行到单碱基错配的位置，在该位置焦磷酸解停止，留下没有被进一步降解的缩短的寡核苷酸。

实施例2：降解的探针的环化和未环化的DNA的核酸外切消化

制备单链第一寡核苷酸1(SEQ ID NO 7)和2(SEQ ID NO 8)，其具有以下核苷酸序列：

其中A、C、G和T代表携带DNA的相关特征核苷碱基的核苷酸，并且P代表5’磷酸基团，并且其中寡核苷酸1包含通过寡核苷酸2对合适的靶寡核苷酸进行焦磷酸解获得的缩短的寡核苷酸2。

还制备了第三单链寡核苷酸3(SEQ ID NO 9)，其具有以下核苷酸序列：

其中/3ddC/代表3’双脱氧胞嘧啶核苷酸，并且其中寡核苷酸3具有与寡核苷酸1的3’末端和寡核苷酸2的内部区域互补的5’末端、以及与寡核苷酸1和2的5’末端互补的3’末端。

20uL 5x缓冲液pH 8.0

10uL寡核苷酸1或2，3000nM

10uL寡核苷酸3，3000nM

7U大肠杆菌连接酶

水至100uL

其中5x缓冲液包含以下混合物：

50uL三羟甲基氨基甲烷醋酸盐,1M，pH 8.0

25uL乙酸镁水溶液,1M

25uL乙酸钾水溶液,5M

50uL Triton X-100表面活性剂(10％)

水至1mL

然后通过在37℃孵育混合物30分钟进行寡核苷酸连接。

然后制备第二反应混合物，其具有的组成对应于由以下配方得到的组成：

20uL 5x缓冲液pH 8.0

125U核酸外切酶III或等体积水

水至100uL

其中5x缓冲液包含以下混合物：

50uL三羟甲基氨基甲烷醋酸盐,1M,pH 8.0

25uL乙酸镁水溶液,1M

25uL乙酸钾,水溶液5M

50uL Triton X-100表面活性剂(10％)

水至1mL

然后将第一和第二反应混合物合并，并将所得混合物在37℃孵育30分钟，以允许任何未环化的DNA的核酸外切消化。然后通过凝胶电泳分析所得的溶液。

该分析的结果显示在图2中，其中可以看出，缩短的寡核苷酸(寡核苷酸1)通过连接反应被有效地环化，并且在随后的核酸外切酶消化中留下，而未缩短的寡核苷酸(寡核苷酸2)没有被环化并且被有效地消化。

实施例3：环化的探针的扩增

制备了一对单链寡核苷酸引物1(SEQ ID NO 10)和2(SEQ ID NO 11)，其具有以下核苷酸序列：

其中A、C、G和T代表携带DNA的相关特征核苷碱基的核苷酸。

20uL 5x Phusion Flex HF反应缓冲液

来自实施例2的0.1uL最终反应混合物

水至100uL

还制备第二反应混合物，其具有的组成对应于由以下配方得到的组成：

20uL 5x Phusion Flex HF反应缓冲液

10uL甜菜碱，2.5M

10uL寡核苷酸1，3000nM

10uL寡核苷酸2，3000nM

10uL dNTP，2mM

2U Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶

水至100uL

然后将第二反应混合物与0.1uL的第一反应混合物合并，并将所得混合物在98℃孵育1分钟，然后30个循环(98℃×20秒；55℃x30秒；68℃×30秒)，以允许通过聚合酶链式反应进行指数扩增。

然后通过凝胶电泳分析所得的反应产物，其结果在图3中示出。从该分析可以看出，当实施例2中存在缩短的寡核苷酸并将其环化时，通过该扩增产生大量产物。相反，当实施例2中存在未缩短的寡核苷酸，并且没有发生环化时，不存在可观察到的DNA扩增。

实施例4：使用焦磷酸类似物(pyrophosphate analogues)的焦磷酸解

制备单链第一寡核苷酸1(SEQ ID NO 12)，其具有以下核苷酸序列：

其中A、C、G和T代表携带DNA的相关特征核苷碱基的核苷酸；F代表使用常规胺连接化学用Atto 594染料标记的脱氧胸苷核苷酸(T)，并且Q代表用BHQ-2猝灭剂标记的脱氧胸苷核苷酸。

还制备了另一种单链寡核苷酸2(SEQ ID NO 13)，其具有以下核苷酸序列：

其中X代表反向的3’dT核苷酸，这样当寡核苷酸2与寡核苷酸1退火时，寡核苷酸1的3’端凹陷，使其成为焦磷酸解的靶，而寡核苷酸2的3’末端由于末端反向核苷酸的存在而被保护免于焦磷酸解。

20uL 5x缓冲液pH 8.0

10uL寡核苷酸1，1000nM

10uL寡核苷酸2，1000nM

2.5U Mako DNA聚合酶(例如Qiagen Beverly)

10uL无机焦磷酸、6mM OR亚氨基二磷酸、10mM OR水

水至100uL

其中5x缓冲液包含以下混合物：

50uL三羟甲基氨基甲烷醋酸盐,1M,pH 8.0

25uL乙酸镁水溶液,1M

25uL乙酸钾水溶液,5M

50uL Triton X-100表面活性剂(10％)

水至1mL

然后通过在37℃孵育混合物75分钟来进行寡核苷酸1的焦磷酸解。随着寡核苷酸1逐渐焦磷酸解，荧光染料分子从猝灭剂分离，并且然后能够生成荧光信号。孵育期间这种荧光的增长用CLARIOStar酶标仪(例如BMG Labtech)监测，并用于推断在无机焦磷酸、亚氨基二磷酸或水的存在下寡核苷酸的焦磷酸解速率。

该实验的结果图示地示于图4中。由此可见，焦磷酸解在焦磷酸或亚氨基二磷酸的存在下发生，但在焦磷酸或亚氨基二磷酸的不存在下未发生。类似地，在不存在聚合酶的对比实验中，不生成荧光信号。在焦磷酸存在下的焦磷酸解产生游离核苷酸三磷酸，而在亚氨基二磷酸存在下的焦磷酸解产生在β和γ磷酸之间的O被N-H基团代替的修饰的游离核苷酸三磷酸(2’-脱氧核苷-5’-[(β,γ)-亚氨基]三磷酸)。

实施例5：解链曲线分析

进行本发明的方法以检测人类EGFR基因中可能出现的三种不同突变的存在并鉴定所述突变：T790M(外显子20)、C797S(外显子20)和L861Q(外显子21)。

制备了6种含有野生型基因组DNA的样品。将这些样品中的三种样品用针对三个感兴趣的突变中的每一个的单一合成突变序列加标(spike)，使得这些样品中的最终突变等位基因分数为1％。向每种样品中加入设计用于检测不同的单一突变的探针寡核苷酸A₀：

通过加入无机焦磷酸根离子(inorganic pyrophosphate ion)和Mako DNA聚合酶，并在41℃孵育，对样品进行焦磷酸解。在探针寡核苷酸焦磷酸解后，通过添加大肠杆菌连接酶和具有以下序列的夹板寡核苷酸进行连接：

连接后，通过添加dNTP、BstLF DNA聚合酶、Sybr Green嵌入染料、具有以下序列的突变特异性正向引物和通用反向引物，对样品进行超支化滚环扩增，然后在60℃孵育70分钟。

然后将样品的温度从70℃升高到95℃，并且每0.5℃进行一次荧光测量。将所得的数据曲线进行微分以产生解链峰，其结果如图5所示。可以看出，明显的解链峰的存在因此可以用于推断给定探针所靶向的突变的存在，而该峰的位置可以用于鉴定突变的性质。

实施例6：应用和用途

以下描述的应用提供了可以如何应用本发明的方法的一些实例。

伴随诊断

本发明的方法可用于检测样品中的特定遗传标志物，该标志物可用于帮助指导选择合适的疗法。这些标志物可以是肿瘤特异性突变，或者可以是野生型基因组序列，并且可以使用组织、血液或任何其他患者样品类型来检测。

抗性监测

在疾病治疗过程中对患者样品的重复检测可以允许早期检测对治疗产生的抗性。这种应用的一个实例是非小细胞肺癌(NSCLC)，其中表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂(例如吉非替尼、埃罗替尼)通常用作一线治疗。在治疗过程中，肿瘤通常可能在EGFR基因中产生突变(例如T790M、C797S)，这些突变赋予对药物的抗性。这些突变的早期检测可以允许患者转向替代疗法(如塔格瑞斯(Tagrisso))。

通常，正在被监测抗性发生的患者可能病情过于严重而无法进行重复的组织活检。重复的组织活检也可能是昂贵的、侵入性的、并带有相关的风险。最好从血液检测，但在合理的抽血样品中可能存在非常低拷贝数的感兴趣的突变。因此，监测要求使用本发明的方法从血液样品中进行灵敏的测试，其中该方法实施起来简单且成本有效，从而可以定期进行。

复发监测

在本应用示例中，治疗后被宣布无疾病的患者可能会随着时间的推移受到监测，以检测疾病的复发。这需要非侵入性地进行，并且要求从血液样品灵敏地检测靶序列。通过使用本发明的方法，它提供了一种可以定期进行的简单且低成本的方法。被靶向的序列可以是已知在感兴趣的疾病中常见的通用突变，或者可以是基于缓解前肿瘤组织中变体的检测为特定患者设计的定制靶的组。

微小残留病(MRD)监测

对于某些癌症，残留癌细胞会在治疗后留在患者体内，这是癌症和白血病复发的主要原因。MRD监测和检测有几个重要作用：确定治疗是否已经根除了癌症或是否留下了残留，比较不同治疗的效力，监测患者的缓解状态以及检测白血病的复发，并选择最能满足这些需求的治疗。

筛查

群体筛查以早期检测疾病是一个长期的目标，尤其是在癌症诊断方面。挑战是双重的：鉴定允许可信的疾病检测而没有太多的假阴性的一组标志物，以及开发具有足够灵敏度和足够低成本的方法。与基于PCR的检测相比，本发明的方法可用于处理更大的突变组，但与基于测序的诊断相比，本发明的方法的工作流程更简单且成本更低。

器官移植排斥

当移植的器官被接受者排斥时，来自该器官的DNA脱落进入接受者的血流中。这种DNA的早期检测将允许早期检测排斥。这可以使用供体特异性标志物的定制组，或者通过使用已知在群体中常见的变体(其中一些将存在于供体中，并且一些存在于接受者中)的组来实现。通过本文公开的本发明的低成本和简单的工作流程，可以实现随时间推移对器官接受者的例行监测。

无创产前检测(NIPT)

长期以来已知，胎儿DNA存在于母亲的血液中，并且NIPT市场现在已经被使用测序来鉴定突变并计数特定染色体的拷贝数以使得能够检测胎儿异常的公司饱和。本文公开的本发明的方法具有检测非常低的等位基因分数的突变的能力，潜在地允许更早地检测胎儿DNA。鉴定给定群体中的常见突变将允许开发靶向母体或胎儿DNA中可能存在的突变的测定，或者允许在妊娠更早期检测异常。

实施例7：单孔多路复用技术

在某些情况下，有多组突变或靶序列，应该对其存在进行鉴定而不是对任何一个靶的身份进行鉴定。在其他情况下，需要关于突变或序列的存在和身份的信息。在这两种情况下，将反应进行多重化是有益的，使得可以在单一反应体积中测定多于一个靶。这导致提高的过程效率，增加了一次可处理的样品数量或可测定的靶的组大小(size of thepanel)。当需要靶序列的存在而不是其身份时，多路复用可以简化为将多于一个靶的探针组合到单个反应体积中。本发明方法相对于标准PCR的一个关键优点是，在反应的最后步骤中，可以使用单个组的引物来扩增所有的“活化”探针(A₂)。

利用EGFR基因上外显子19的缺失，发明人已经展示在单个反应中以0.1％突变等位基因频率(MAF)进行10倍多路复用检测。

制备了20种样品，每种样品包含加标有0.1％或0.5％的10个不同的外显子19缺失之一的野生型(WT)DNA。使用仅包含WT DNA的添加样品作为对照。将用于检测所有10种不同外显子19突变的探针添加到每种样品中，并使用标准条件进行反应。结果(参见图6)显示，在0.5％和0.1％两种MAF，每个突变显示清晰的检测。

可使用标准技术进行检测——嵌入染料、标记的探针(Taqman、Scorpion、茎环引物)、分子信标或本领域技术人员已知的任何其他标准技术。

当需要靶的身份时，最有可能使用多色系统来鉴定哪个探针已经被激活(A₂)。这自然需要一种探针设计，其中在探针中存在针对不同的靶的不同的“条形码”序列，其然后用于鉴定。然后可以如前所述进行鉴定。

如同使用1种颜色的10重多重检测，发明人还展示了在本发明方法的线性和滚环扩增实施中的单孔双色检测(前者使用Taqman探针，后者使用茎环引物)。在该实例中，制备以0％、0.1％和0.5％的等位基因分数含有T790M突变或C797S突变的样品。在焦磷酸解和随后的连接之后，使用用不同荧光团标记的对突变靶向探针A₀特异的引物或探针对样品进行滚环或线性PCR扩增。使用标记的茎环引物进行滚环扩增的结果在图7中示出，其中可以看出，在T790M突变的存在下Cy5检测通道中生成信号，而在含有C797S突变的样品中，在TexasRed通道中观察到信号。

实施例8：使用对照探针进行背景信号校准

制备三种样品1-3，每种样品包含100nM最终浓度的合成寡核苷酸1(SEQ ID NO24)，该合成寡核苷酸1包含人类EGFR基因外显子21的L858R突变区的野生型序列：

制备合成的“突变”寡核苷酸2(SEQ ID NO 25)，其具有来源于EGFR基因的相同区域的以下序列，并还包含L858R突变：

将寡核苷酸2分别以100pM和1nM的最终浓度加入样品2和3，使得样品2中0.1％的分子包含L858R突变位点且样品3中1％的分子包含该突变。然后将每种样品分成两个反应体积。向第一反应体积中加入最终浓度为10nM的测定探针寡核苷酸3(SEQ ID NO 26)，其包含与突变的L858R序列区完全匹配的3’末端，同时以相同浓度向第二体积中加入对照探针寡核苷酸4(SEQ ID NO 27)，其包含相同的序列，但L858R突变区中例外，L858R突变区包含与突变和野生型等位基因二者错配的序列：

寡核苷酸3：

寡核苷酸4：

然后通过加入0.6mM焦磷酸根离子和37.5U/mL Mako DNA聚合酶并加热至41℃保持30分钟，将反应体积进行焦磷酸解。在该反应之后，将夹板寡核苷酸5(SEQ ID NO 28)以10nM的最终浓度与50U/mL的热稳定无机焦磷酸酶和100U/mL的大肠杆菌连接酶一起添加到每个反应体积中，并且通过在37℃孵育10分钟来环化任何焦磷酸解的探针。然后通过加热至95℃保持10分钟失活大肠杆菌连接酶。

寡核苷酸5：

随后，通过添加核酸外切酶III和T5核酸外切酶并在30℃孵育5分钟对样品进行核酸外切酶消化，然后通过加热至95℃保持5分钟灭活核酸外切酶。

然后向每种样品中加入最终浓度为200nM的两种引物寡核苷酸6(SEQ ID NO 29)和7(SEQ ID NO 30)、0.4mM dNTP、320U/mL BstLF DNA聚合酶和0.5x最终浓度的SybrGreen嵌入染料。

寡核苷酸6：5’-TCGCAACATCCTATATCTGC-3’

寡核苷酸7：5’-TGAGCTTTGACAATACTTGA-3’

将样品在60℃孵育80分钟，并且每分钟一次测量每种样品中来自Sybr Green染料的荧光。图8(i)显示了孵育的结果，其中可以看出，在测定探针的存在下，荧光信号取决于L858R突变的存在，而从对照探针观察到的信号与该突变的存在无关，并且与不存在突变时从探针观察到的信号非常匹配。图8(ii)显示了三种样品中每一种的测定探针信号减去对照探针信号的结果。因此通过这种技术实现了低至0.1％等位基因分数的L858R突变的定量检测，而不使用参考样品。

鉴于本公开内容，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是明显的。

在本文中使用的“和/或”被认为是两个指定的特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。例如“A和/或B”被认为是(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，如同每一个在本文中单独列出一样。

除非上下文另有指示，否则上文列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。

本领域技术人员将进一步理解，尽管已经参照若干实施方案通过示例的方式描述了本发明，但是本发明不限于所公开的实施方案，并且在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下，可以构造替代实施方案。

序列表

<110> 生物保真有限公司

<120> 改进的多核苷酸序列检测方法

<130> P31404WO2

<150> EP18184575.1

<151> 2018-07-19

<150> PCT/EP2018/083227

<151> 2018-10-30

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例1单链第一寡核苷酸1

<400> 1

cgctcgatgt atacgctcgg accactcgta cctcgaactg tcgttagtat ttttatatgt 60

agtttctgaa gtagatatgg cagcacataa tgac 94

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例1单链寡核苷酸2

<400> 2

agtacaaata tgtcattatg tgctgccata tctacttcag aaactacata taaaaatact 60

aactttaagg 70

<210> 3

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例1单链寡核苷酸3

<400> 3

agtacaaata tctcattatg tgctgccata tctacttcag aaactacata taaaaatact 60

aactttaagg 70

<210> 4

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例1单链寡核苷酸4

<400> 4

agtacaaata tgtcattatg agctgccata tctacttcag aaactacata taaaaatact 60

aactttaagg 70

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例1单链寡核苷酸5

<400> 5

agtacaaata tgtcattatg tgctgccata actacttcag aaactacata taaaaatact 60

aactttaagg 70

<210> 6

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例1单链寡核苷酸6

<400> 6

agtacaaata tgtcattatg tgctgccata tctacttcag taactacata taaaaatact 60

aactttaagg 70

<210> 7

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例2单链寡核苷酸1

<220>

<221> 在位置1处的C具有5'磷酸基团

<222> 1

<400> 7

cgctcgatgt atacgctcgg accactcgta cctcgaactg tcgttagtat ttttatatgt 60

agtttctgaa gtagatatgg cagcacataa tgac 94

<210> 8

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例2单链寡核苷酸2

<220>

<221> 在位置1处的A具有5'磷酸基团

<222> 1

<400> 8

atgttcgatg aggcacgata tagatgtacg ctttgacata cgctttgaca atacttgagc 60

agtcggcaga tataggatgt tgcaagctcc gtgagtccca caaaccaata acctcgtttt 120

ttatatgtag tt 132

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例2单链寡核苷酸3

<220>

<221> 在位置57处的C是3'脱氧胞苷

<222> 57

<400> 9

tatcgtgcct catcgaacat aactacatat aaaaaacgag gttattggtt tgtggcc 57

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例3单链寡核苷酸引物1

<400> 10

tgctcaagta ttgtcaaagc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例3单链寡核苷酸引物2

<400> 11

cggcagatat aggatgttgc 20

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例4单链寡核苷酸1

<220>

<221> 在位置26处的T是用Atto 594染料标记的脱氧胸苷

<222> 26

<220>

<221> 在位置27处的T是用Atto 594染料标记的脱氧胸苷

<222> 27

<220>

<221> 在位置30处的T是用BHQ-2猝灭剂标记的脱氧胸苷

<222> 30

<400> 12

atgacctcgt aagccagtgt cagagtttttttc cagccgt 39

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例4单链寡核苷酸2

<220>

<221> 在位置51处的T是反向3'dT

<222> 51

<400> 13

ttcacacggc tggaaaaaaa ctctgacact ggcttacgag gtcattagatt 51

<210> 14

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5 T790M

<220>

<221> 在位置1处的A具有5'磷酸基团

<222> 1

<400> 14

atgttcgatg agctttgaca atacttgagc acggcagata taggatgttg cgaagggcat 60

gagctgcatg atgagctg 78

<210> 15

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5 C797S

<220>

<221> 在位置1处的A具有5'磷酸基团

<222> 1

<400> 15

atgttcgatg agctttgaca atacttgaag ctcgcagata taggatgttg cgatagtcca 60

ggaggctgc 69

<210> 16

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5 L861Q

<220>

<221> 在位置1处的A具有5'磷酸基团

<222> 1

<400> 16

atgttcgatg agctttgaca atacttgatc gatgcagata taggatgttg cgatccgcac 60

ccagctgttt ggc 73

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5 T790M夹板寡核苷酸

<400> 17

tgtcaaagct catcgaacat gcccttcgca acatct 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5 C797S夹板寡核苷酸

<400> 18

tgtcaaagct catcgaacat tcctggacta tcgcat 36

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5 L861Q夹板寡核苷酸

<400> 19

agctcatcga acatctgggt gcggatcgca acaa 34

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5 T790M引物

<400> 20

acatcctata tctgccgt 18

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5 C797S引物

<400> 21

catcgaacat tcctggacta 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5 L861Q引物

<400> 22

tcatcgaaca tctgggtgcg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例5通用反向引物

<400> 23

atgttcgatg agctttgaca 20

<210> 24

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例8合成的寡核苷酸1

<400> 24

ccgcagcatg tcaagatcac agattttggg ctggccaaac tgctgggtgc ggaagagaaa 60

gaataccatg cagaaggagg 80

<210> 25

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例8合成的'突变'寡核苷酸2

<400> 25

ccgcagcatg tcaagatcac agattttggg cgggccaaac tgctgggtgc ggaagagaaa 60

gaataccatg cagaaggagg 80

<210> 26

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例8测定探针寡核苷酸3

<220>

<221> 在位置1处的A具有5'磷酸基团

<222> 1

<400> 26

atgttcgatg agctttgaca atacttgatc gatgcagata taggatgttg cgacagtttg 60

gcccgcccaa a 71

<210> 27

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例8测定探针寡核苷酸4

<220>

<221> 在位置1处的A具有5'磷酸基团

<222> 1

<400> 27

atgttcgatg agctttgaca atacttgatc gatgcagata taggatgttg cgacagtttg 60

gccggcccaa a 71

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例8夹板寡核苷酸5

<400> 28

tgtcaaagct catcgaacat gccaaactgt cgcaag 36

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例8引物寡核苷酸6

<400> 29

tcgcaacatc ctatatctgc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 实施例8引物寡核苷酸7

<400> 30

tgagctttga caatacttga 20

Claims

1.一种检测核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)将所述分析物退火至单链探针寡核苷酸A₀，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与所述靶多核苷酸序列形成双链复合物的第一中间产物，其中所述单链探针寡核苷酸A₀包含引发区、在3’末端的与所述靶多核苷酸序列互补的区域和在与所述靶多核苷酸序列互补的区域的5’侧的寡核苷酸识别区，其中所述识别区包含条形码编码区，并且其中只有A₀的互补区能够退火至所述靶多核苷酸序列；

(b)在焦磷酸根离子源的存在下，使用焦磷酸解酶从A₀的3’末端在3’-5’方向上焦磷酸解所述第一中间产物，以产生部分消化的链A₁和所述分析物；

(c)(i)将A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并在5’-3’方向上针对B延伸所述A₁链，其中B包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和在其5’末端的侧翼寡核苷酸区域，所述侧翼寡核苷酸区域与A₀或所述靶多核苷酸序列不互补；或者(ii)通过连接A₁的3’和5’末端使其环化；或者(iii)将A₁的3’末端连接到连接探针寡核苷酸C的5’末端；在每种情况下产生寡核苷酸A₂；

(d)用至少一种单链引物寡核苷酸引发A₂，并产生A₂的多于一个拷贝或A₂的区域的多于一个拷贝；和

(e)检测来源于所述多于一个拷贝的信号，并从其推断所述分析物中存在或不存在所述靶多核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中A₀的5’末端包含5’化学封闭基团、共同的引发序列和条形码区域。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用步骤(c)(ii)或步骤(c)(iii)，并且A₁在连接之前首先在5’-3’方向延伸。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)(ii)和步骤(c)(iii)中的所述连接通过添加另外的夹板寡核苷酸D来进行，A₁在连接前退火至所述夹板寡核苷酸D，其中D包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5’末端或与A₁的5’末端互补的区域。

5.根据权利要求4所述的方法，其中由于3’修饰或通过D的3’末端和A₁的相应区域之间的错配，所述寡核苷酸D不能针对A₁延伸。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(c)之后，用核酸外切酶处理从步骤(c)产生的反应混合物以消化任何未连接的核酸材料，并且其中如果使用步骤(c)(iii)，所述寡核苷酸C还包含保护其免受3’-5’核酸外切酶消化的3’或内部修饰。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤(d)之前，所述核酸外切酶被失活。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用步骤(c)(i)，并且其中步骤(d)中使用的引物寡核苷酸之一退火至A₂的延伸区域。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述探针寡核苷酸A₀具有耐核酸外切酶解的5’末端，并且其中在步骤(a)和(b)之后，用5’-3’核酸外切酶处理由此产生的反应介质，以除去任何不耐这种核酸外切酶解的核酸分子。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)在存在磷酸酶的条件下进行。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中迭代步骤(a)和(b)，以从所述分析物产生部分消化的探针A₁的多于一个拷贝。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(b)之后通过添加焦磷酸酶停止焦磷酸解反应。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(e)包括使用一种或更多种寡核苷酸结合染料或分子探针检测来源于所述多于一个拷贝的信号。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(d)和(e)同时进行。

15.根据权利要求14所述的方法，其中由步骤(d)中扩增子的生成导致的信号随时间的增加用于推断所述分析物中靶多核苷酸序列的浓度。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分析物是单链的，并且在步骤(a)之前，通过以下步骤从包含所述分析物的生物样品衍生所述分析物：

(i)通过对所述生物样品进行扩增循环来产生所述分析物的扩增子，和

(ii)用具有5’-3’核酸外切酶活性的核酸外切酶消化步骤(i)的产物，其中步骤(i)中使用的引物之一包括核酸外切酶封闭基团。

17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(i)使用脱氧尿苷三磷酸代替脱氧胸苷三磷酸并在存在UTP-DNA糖基化酶的条件下进行。

18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分析物是单链的，并且在步骤(a)之前，通过以下步骤从包含所述分析物的生物样品衍生所述分析物：(i)通过对所述生物样品进行扩增循环来产生所述分析物的扩增子，其中使用的引物之一过量于其他引物地被引入。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述扩增使用显示3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶，其中在步骤(i)之后，将步骤(i)的产物与蛋白酶反应以破坏所述聚合酶，并且其中所述蛋白酶随后通过加热该反应的产物而被破坏。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述扩增使用显示3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶，其中在步骤(i)之后，将步骤(i)的产物与蛋白酶反应以破坏所述聚合酶，并且其中所述蛋白酶随后通过加热该反应的产物而被破坏。

21.根据权利要求18所述的方法，其中步骤(i)使用脱氧尿苷三磷酸代替脱氧胸苷三磷酸并在存在UTP-DNA糖基化酶的条件下进行。

22.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用了多于一种探针A₀，每种探针A₀对不同的靶多核苷酸序列具有选择性，并且每种探针A₀包括识别区，并且其中步骤(d)中扩增的区域包括该识别区。

23.根据权利要求22所述的方法，其中通过检测所述识别区从步骤(d)中生成的扩增子推断所述分析物中存在的所述靶序列的存在。

24.根据权利要求23所述的方法，其中使用分子探针或通过测序进行所述识别区的检测。

25.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(e)还包括以下步骤：

i.使用一种或更多种寡核苷酸荧光结合染料或分子探针标记A₂的多于一个拷贝或A₂的区域的多于一个拷贝；

ii.测量所述多于一个拷贝的荧光信号；

iii.将所述多于一个拷贝暴露于一组变性条件；和

iv.通过监测暴露于所述变性条件期间所述多于一个拷贝的荧光信号的变化来鉴定所述分析物中的靶多核苷酸序列。

26.根据权利要求22所述的方法，其中不同的探针A₀包含共同的引发位点，允许一个或一组引物用于步骤(d)的扩增。

27.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(a)之前，将所述分析物分成多于一个反应体积，每个体积具有引入的不同探针寡核苷酸A₀，以检测不同的靶多核苷酸序列。