CN108265109A - 一种临床检测低丰度miR-33a/b的B-RCA方法及试剂盒 - Google Patents

一种临床检测低丰度miR-33a/b的B-RCA方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种临床检测低丰度miR‑33a/b的B‑RCA方法及试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明方法包括如下步骤：提取待测样本总RNA；使用特异性闭锁探针(检测miR‑33a/b、内参U6的探针的序列分别如SEQ ID NO.1、2所示)与待测RNA连接成环发生连接反应；用第二引物(序列如SEQ ID NO.3所示)对连接反应产物继续扩增发生B‑RCA反应；检测B‑RCA产物的荧光信号强度，并以内参基因U6进行标化。本发明的试剂盒包含上述探针、引物、阳性对照、阴性对照、DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、荧光染料等。本发明检测灵敏度高、特异性强，检测限低，适用于多种标本的检测。

Description

一种临床检测低丰度miR-33a/b的B-RCA方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于临床定量检测低丰度miR-33a/b的B-RCA方法及试剂盒。
背景技术
microRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类由内源基因编码的长度约为19～23个核苷酸的非编码单链分子。多数成熟的miRNAs具有高度保守性，可通过与AGO蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体，与目标mRNA的3’非编码区完全或不完全互补配对，从而导致mRNA降解(完全配对)或者抑制其翻译(不完全配对)，进而参与调控转录后水平的靶基因表达(Dong H,Lei J,Ding L,et al.MicroRNA:function,detection,and bioanalysis[J].Chem Rev,2013(8):6207-6233.)。研究表明，成熟miRNAs的表达具有时空和组织特异性，不仅参与调控正常的生理过程，而且在人体的代谢性疾病、肿瘤、神经性疾病等多种疾病的发生发展过程中也发挥重要的作用。目前人体已发现至少两千多种miRNAs，约占基因组的1％，并调控约30％的基因表达(Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seedpairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genesare microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.)。近年来，miRNAs在动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)中的作用被广泛关注，研究表明miRNAs可通过各种各样的途径影响和调节ASCVD相关疾病以及相关疾病的风险因素，进而调控ASCVD的发生发展(Laffont B,Rayner K J.MicroRNAs in the Pathobiologyand Therapy of Atherosclerosis.[J].Canadian Journal of Cardiology,2017,33(3):313-324.)
miR-33家族包括miR-33a和miR-33b，miR-33a位于固醇调节元件结合蛋白-2(sterol regulatory element binding protein-2，SREBP-2)基因的第15内含子；miR-33b位于SREBP-1基因的第17内含子，且只存在于人体内(Najafi-Shoushtari S H,Kristo F,Li Y,et al.MicroRNA-33and the SREBP host genes cooperate to controlcholesterol homeostasis[J].Science,2010,328(5985):1566-1569.)。miR-33a和miR-33b有高度同源性，二者只有两个碱基的差异且具有共同的种子序列(Fernández-HernandoC,Suárez Y,Rayner K J,et al.MicroRNAs in lipid metabolism[J].Current opinionin lipidology,2011,22(2):86.)。miR-33家族参与调控多种生物代谢过程的相关基因表达，如胆固醇代谢相关基因(ABCG1和NPC1)、高密度脂蛋白合成相关基因(ABCA1，ABCG1)、脂肪酸氧化相关基因(AMPK，CPT1A，SIRT)、线粒体功能相关基因(PGC1α，NFR1，TFAM)以及胰岛素信号途径相关基因(IRS2)等(A.Sahebkar,G.F.Watts,Developing role of microRNA-33in lipid metabolism and atherosclerosis[J].Curr.Opin.Lipidol.,2016,27(2):197-199.)。
2012年的全国调查结果显示，中国成人血清总胆固醇(total cholesterol，TC)平均为4.50mmol/L，高胆固醇血症的患病率为4.90％；中国成人血脂异常总体患病率高达40.40％，较2002年呈大幅度上升(国家卫生和计划生育委员会疾病预防控制局.中国居民营养与慢性病状况报告.2015,北京:人民卫生出版社.)。人群血清胆固醇水平的升高将导致2010-2030年期间我国心血管病事件增加约920万(Moran A,Gu D,Zhao D,et al.Futurecardiovascular disease in china:markov model and risk factor scenarioprojections from the coronary heart disease policy model-china.CircCardiovasc Qual Outcomes,2010,3:243-252.)。miR-33可靶向作用于胆固醇逆向转运的众多相关基因，而胆固醇的逆向转运是机体周围组织细胞胆固醇转运至肝脏转化、清除的唯一转运机制(Rosenson RS,Brewer HB Jr,Davidson WS,Fayad ZA,Fuster V,GoldsteinJ,Hellerstein M,Jiang XC,Phillips MC,Rader DJ,et al.Cholesterol efflux andatheroprotection:advancing the concept of reverse cholesteroltransport.Circulation.2012；125:1905–1919.)，因此miR-33的表达与脂代谢，尤其是胆固醇代谢密切相关，而以低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)或总胆固醇(total cholesterol，TC)升高为特点的血脂异常是ASCVD的重要危险因素；降低LDL-C水平，可显著减少ASCVD的发病及死亡危险(Baigent C,Keech A,KearneyPM,et al.Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment:prospectivemeta-analysis of data from 90,056participants in 14randomised trials ofstatins.Lancet,2005,366:1267-1278.)。
miR-33在人体外周血中表达水平非常低，准确而灵敏的检测困难重重。尽管miRNAs检测方法很多，如传统的印记杂交技术、微阵列芯片法、Taqman、qPCR等以及最近发展的纳米粒子读数技术、基于酶信号放大的电化学检测、测序法、滚环扩增检测法等，但灵敏度均不足以检测外周血miR-33。印记杂交技术是最早应用于miRNAs的定量检测方法，一直被视为检测和鉴定miRNAs的标准方法，但该方法存在费时费力、样品需求量大(约10～30μg)、灵敏度低(检测限为纳摩尔级别)、效率低等缺点(Cissell K A,Shrestha S,Deo SK.MicroRNA detection:challenges for the analytical chemist[J].2007,4754-4761.)；微阵列芯片法和测序有发现新miRNAs的优势，但检测费用高、灵敏度低、重复性不好；荧光定量PCR(qPCR)和Taqman是目前检测miRNAs的主要方法，荧光定量检测方法指南明确提出，当扩增循环阈值(Ct)大于35，其结果不准确(Bustin S A,Benes V,Garson J A,etal.The MIQE guidelines:minimum information for publication of quantitativereal-time PCR experiments.[J].Clinical Chemistry,2009,55(4):611.)。因此，这两种常用方法检测某些低丰度的miRNAs，如外周血miR-33，仍然存在灵敏度不够的缺陷。
滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)是一种新兴的恒温核酸扩增方法。Jonstrup等首次把RCA技术应用于miRNAs检测(Jonstrup S P,Koch J,Kjems J.AmicroRNA detection system based on padlock probes and rolling circleamplification[J].Rna,2006,12(9):1747-1752.)，后经不断的优化完善，RCA的检测灵敏度及特异度有一定的提升。分支滚环扩增方法(Branched Rolling CircleAmplification，B-RCA)采用的闭锁探针(padlock probe)为miRNAs特异性探针，并在RCA的基础上加入第二引物(Second Primer)，RCA产物在DNA聚合酶的作用下继续扩增，从而进一步提高灵敏度和特异性，可以实现特异性检测低丰度的miRNAs含量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于临床检测低丰度miR-33a/b的B-RCA方法。基于该方法，本发明的目的还在于提供实行该方法的试剂盒(基于B-RCA技术的低丰度miR-33a/b检测试剂盒)。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于临床检测低丰度miR-33a/b的B-RCA方法，包括如下步骤：提取待测样本总RNA；使用特异性闭锁探针与待测RNA连接成环发生连接反应；用第二引物对连接反应产物继续扩增发生B-RCA反应；检测B-RCA产物的荧光信号强度，并以内参基因进行标化。所述的特异性闭锁探针包括用于检测miR-33a/b的闭锁探针A，以及用于检测内参基因的闭锁探针B，所述的内参基因基因优选为U6。
其中，用于检测miR-33a/b的闭锁探针A，与待测标本中的miR-33a/b连接成环，其序列如下：
A:5'-PO4-TACAATGCACTTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTTGCAATGCAAC-3'；
用于检测内参基因U6的闭锁探针B，与待测标本中的U6连接成环，其序列如下：
B:5'-PO4-CTTCACGAATTTTTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTAAAATATGGAACG-3'。
所述的第二引物为引物C，用于扩增连接反应的产物，其序列如下：
C:5'-CATTTCAGTTTACGGTTTAGC-3'。
一种基于B-RCA技术的低丰度miR-33a/b检测试剂盒，包含上述用于检测miR-33a/b的闭锁探针A，用于检测检测内参基因的闭锁探针B，以及第二引物。所述的内参基因优选为U6，闭锁探针B的序列如上所示；所述的第二引物为上述引物C。
所述的试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，阴性对照为不含miR-33a/b的质控品或不含Total RNA的质控品，阳性对照为含有miR-33a/b标准品的质控品或含有Total RNA的质控品。
所述的试剂盒还包含T4DNA连接酶(及缓冲液)、phi29DNA聚合酶(及缓冲液)、dNTPs、荧光染料EvaGreen和DEPC-H2O等。
上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：提取待测样本Total RNA；配制包含待测样本Total RNA、闭锁探针的体系进行连接反应第一步；在连接反应第一步的反应产物中加入T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液进行连接反应第二步；在连接反应第二步的反应产物中加入第二引物、phi29DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶缓冲液、dNTPs和EvaGreen荧光染料形成B-RCA反应体系进行B-RCA反应；检测B-RCA反应产物的荧光强度。
所述的连接反应第一步的体系优选为：Total RNA(～50ng)0.5μL，闭锁探针(20nM)1μL，DEPC-H2O 7μL。
所述的连接反应第一步的反应条件优选为：55℃5min，39℃30min。
所述的连接反应第二步的体系优选为：连接反应第一步产物、T4DNA连接酶(400U/μL)0.5μL、T4DNA连接酶缓冲液(10×)1μL。
所述的连接反应第二步的反应条件优选为：16℃3h，4℃过夜。
所述的B-RCA反应的体系优选为：连接反应第二步产物10μL、第二引物(1μM)2μL、phi29DNA聚合酶(10U/μL)0.5μL、phi29DNA聚合酶缓冲液(10×)2μL、dNTPs(2.5mM)2μL、EvaGreen(20×)1μL、DEPC-H2O 2.5μL。
所述的B-RCA反应的反应条件优选为：30℃3h，65℃10min。
所述的B-RCA反应产物的荧光强度的检测条件优选为：B-RCA反应后产物放置4℃60min再检测荧光强度，激发波长480nm，发射波长530nm；整个过程注意避光。
本发明B-RCA技术检测miR-33a/b的基本原理如图1所示：闭锁探针的5’和3’端碱基序列与miR-33a和-b的种子序列互补配对，在T4DNA连接酶的作用下，闭锁探针特异性的连接到miR-33a和-b上并形成一个环状序列，此过程称为连接反应；之后，在phi29DNA聚合酶的作用下，环状序列中的miR-33a和-b作为引物触发滚环扩增反应，生成多个拷贝的miR-33a和-b；随后，在phi29DNA聚合酶的作用下，和滚环扩增反应产物中每一个串联的一部分序列互补配对的第二引物可触发指数性的分支滚环扩增反应，生成大量的DNA产物，并与EvaGreen染料结合，在多功能酶标仪中530nm波长处可检测到相应的荧光信号强度。
本发明基于B-RCA技术的低丰度miR-33a/b检测试剂盒可以分为检测系统和监控系统两个部分。检测系统包括上述2种探针和1条引物、酶类、dNTPs和荧光染料。监控系统则包括：①阴性对照，为只含有各种试剂成份，不含RNA模板的反应体系；正常情况下阴性对照荧光强度信号极低(≤10000)，若荧光强度高，则表明加样过程中存在污染。②阳性对照，包括2种，第1种为含有miR-33a和miR-33b的HepG2细胞总RNA的质控品；第2种是人工合成的miR-33a和miR-33b标准品；正常反应下阳性质控品应出现极强的荧光信号强度(>50000)。当阴性对照荧光强度信号强度≤10000、阳性对照荧光信号强度>50000，可直接读取待测样本的荧光信号强度值。
本发明提供的试剂盒具有如下优点：①miR-33a/b特异性闭锁探针能在最适温度(39℃)进行特异的连接反应，获取特异性的miR-33a/b滚环；②检测灵敏度高、特异性强，检测限达到10-6ng/μL；③小反应体系(20μL)，标本和试剂用量少；④采用检测样本为RNA，来源丰富，可支持血液、组织、胸水等多种来源的标本；⑤试剂价格低廉。试验表明，本发明提供的B-RCA方法可灵敏检测miR-33a/b，适用于临床患者血液等标本检测。本发明为低丰度miR-33a/b的灵敏检测提供了一种新的检测方法，可用于临床指导动脉粥样硬化性心血管疾病患者及高风险群体的个体化诊疗。
附图说明
图1是本发明B-RCA技术检测miR-33a/b的基本原理图。
图2是实施例3采用qPCR和Taqman方法检测miR-33表达的结果图。图中A为qPCR方法检测HepG2细胞miR-33的结果，B为Taqman方法检测HepG2细胞miR-33的结果，C为qPCR方法检测新鲜外周血miR-33的结果，D为Taqman方法检测新鲜外周血miR-33的结果。
图3是实施例4中Taqman方法检测不同浓度miR-33a标准品的结果图。
图4是实施例4中B-RCA方法检测不同浓度miR-33a标准品的结果图。
图5是实施例5中B-RCA检测miR-33a/b标准品的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明基于B-RCA技术的低丰度miR-33a/b检测试剂盒，包含上述用于检测miR-33a/b的闭锁探针A、用于检测检测内参基因U6的闭锁探针B，以及第二引物C。
所述的试剂盒还包括阳性对照，阳性对照为miR-33a、miR-33b标准品。
所述的试剂盒还包含T4DNA连接酶(及缓冲液)、phi29DNA聚合酶(及缓冲液)、dNTPs、荧光染料EvaGreen和DEPC-H2O。
其中，用于检测miR-33a/b的闭锁探针A的序列如下：
A:5'-PO4-TACAATGCACTTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTTGCAATGCAAC-3'；
用于检测内参基因U6的闭锁探针B的序列如下：
B:5'-PO4-CTTCACGAATTTTTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTAAAATATGGAACG-3'；
所述的第二引物为引物C，序列如下：
C:5'-CATTTCAGTTTACGGTTTAGC-3'。
实施例1 HepG2细胞miR-33a/b的检测
(1)提取HepG2细胞的总RNA
①收集HepG2细胞于无酶EP管(细胞数量约为5～10×106)，加入1mL Trizol试剂，吹打混匀，置于冰上裂解15min；②加入三氯甲烷200μL，大力摇晃混匀50次，置于4℃冰箱预冷15min，4℃、12000g离心15min；③将上层水相小心移入1个新的去酶EP管中，加入与上层水相等体积异丙醇(约500μL)，颠倒混匀50次，于4℃冰箱预冷10min，4℃、12000g离心10min；④弃上清，加入1mL 75％乙醇(由DEPC-H2O配制)，震荡混匀，4℃、12000g离心7min；⑤重复步骤④；⑥弃上清，于超净工作台中干燥，加入15μL DEPC-H2O溶解，得到HepG2总RNA溶液，测量RNA纯度和浓度，调整RNA浓度到100ng/μL。
(2)连接反应
连接反应第一步：8.5μL的反应体系包含RNA 0.5μL(～50ng)，特异性闭锁探针(20nM)1μL，DEPC-H2O 7μL；将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为55℃5min，39℃30min。各管反应体系配制具体如表1。
表1 HepG2细胞miR-33a/b检测连接反应第一步反应体系
连接反应第二步：向连接反应第一步反应产物的各管中加入T4DNA连接酶(400U/μL)0.5μL、T4DNA连接酶缓冲液(10×)1μL；将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为16℃3h，4℃过夜。
(3)分支滚环扩增反应(B-RCA)
向连接反应第二步反应产物各管中加入B-RCA反应液，B-RCA反应液由第二引物(1μM)、phi29DNA聚合酶(10U/μL)、phi29DNA聚合酶缓冲液(10×)、dNTPs(2.5mM)、EvaGreen(20×)和DEPC-H2O组成。
20μL的B-RCA反应体系：连接反应第二步产物10μL、第二引物(1μM)2μL、phi29DNA聚合酶(10U/μL)0.5μL、phi29DNA聚合酶缓冲液(10×)2μL、dNTPs(2.5mM)2μL、EvaGreen(20×)1μL、DEPC-H2O 2.5μL。
加样完成后，将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为30℃3h，65℃10min。
(4)荧光信号强度检测
将B-RCA反应产物避光放置于4℃60min后检测荧光强度，激发波长480nm、发射波长530nm。
(5)结果计算
为保证实验结果的准确性，在实验过程中，阴性对照荧光强度信号强度≤10000、阳性对照荧光信号强度>50000，表明实验成功。待测样本miR-33a/b水平计算公式为：(miR33a/b荧光信号-阴性对照荧光信号)/(U6荧光信号-阴性对照荧光信号)，单位为随意单位(a.u)。HepG2细胞中miR-33a/b的荧光信号值约为51000(表3)。
实施例2临床标本外周血miR-33a/b的检测
(1)提取患者外周血RNA
①取新鲜EDTA-K2抗凝全血500μL至去酶EP管中，充分颠倒混匀，加入2.5mL红细胞裂解液，震荡混匀，冰上冰浴30min，冰浴期间每10分钟震荡混匀1次，冰浴后4℃、12000rpm离心10min；②弃上清，再加入1mL红细胞裂解液，吹打混匀，4℃、12000rpm离心10min；③弃上清，加入1mL Trizol试剂，吹打混匀；④加入三氯甲烷200μL，大力摇晃混匀50次，置于4℃冰箱预冷15分钟，4℃、12000g离心15min；⑤将上层水相小心移入1个新的去酶EP管中，加入与上层水相等体积约500μL异丙醇，颠倒混匀50次，于4℃冰箱预冷10分钟，4℃、12000g离心10min；⑥弃上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC-H2O配制)，震荡混匀，4℃、12000g离心7min；⑦弃上清，于超净工作台中干燥，加入15μL DEPC-H2O溶解，得到血液总RNA溶液，测量RNA纯度和浓度，调整RNA浓度到100ng/μL。
(2)连接反应
连接反应第一步：8.5μL的反应体系包含RNA 0.5μL(～50ng)，特异性闭锁探针(20nM)1μL，DEPC-H2O 7μL；将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为55℃5min，39℃30min。各管反应体系配制具体如表2。
表2外周血miR-33a/b检测连接反应第一步反应体系
连接反应第二步：向连接反应第一步反应产物的各管中加入T4DNA连接酶(400U/μL)0.5μL、T4DNA连接酶缓冲液(10×)1μL；将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为16℃3h，4℃过夜。
(3)分支滚环扩增反应(B-RCA)
向连接反应第二步反应产物各管中加入B-RCA反应液，B-RCA反应液由第二引物(1μM)、phi29DNA聚合酶(10U/μL)、phi29DNA聚合酶缓冲液(10×)、dNTPs(2.5mM)、EvaGreen(20×)和DEPC-H2O组成。
20μL的B-RCA反应体系：连接反应第二步产物10μL、第二引物(1μM)2μL、phi29DNA聚合酶(10U/μL)0.5μL、phi29DNA聚合酶缓冲液(10×)2μL、dNTPs(2.5mM)2μL、EvaGreen(20×)1μL、DEPC-H2O 2.5μL。
加样完成后，将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为30℃3h，65℃10min。
(4)荧光信号强度检测
将B-RCA反应产物避光放置于4℃60min后检测荧光强度，激发波长480nm、发射波长530nm。
(5)结果计算
为保证实验结果的准确性，在实验过程中，阴性对照荧光强度信号强度≤10000、阳性对照荧光信号强度>50000，表明实验成功。待测样本miR-33a/b水平计算公式为：(miR-33a/b荧光信号-阴性对照荧光信号)/(U6荧光信号-阴性对照荧光信号)，单位为随意单位(a.u)。血液miR-33a/b的荧光信号值约为30000～50000(表3)。
表3不同方法检测HepG2细胞和外周血miR-33的结果比较
实施例3 B-RCA方法与传统方法检测细胞系和外周血miR-33a/b的灵敏度比较
按照实施例1采用B-RCA方法对3份HepG2细胞的miR-33a/b和内参基因U6进行检测，按照实施例2采用B-RCA方法对8例新鲜外周血进行miR-33a/b和内参基因U6检测，同时采用传统qPCR和Taqman方法进行miR-33a和内参基因U6检测。qPCR所用miR-33a引物对为：5'-GTGCATTGTAGTTGCATTGCA-3'，5'-GATGCACTGTGGAAACATTGCA-3'；U6引物对为：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。Taqman方法采用AB公司商品化试剂(miR-33a的引物号为4427975、探针号为000424，U6引物号为4427975、探针号为001093)，检测结果如表3所示。传统方法qPCR和Taqman检测HepG2细胞，Ct值分别超过35和32(图2)，但B-RCA方法仍能检测出荧光强度(FI)高达50000以上；而且，B-RCA方法还可定量检测传统方法检测不出来(无扩增或Ct值大于35)的外周血miR-33水平(图2)，并且荧光强度在33000以上。
实施例4 B-RCA方法与传统方法检测miR-33a标准品的灵敏度比较
(1)稀释miR-33a标准品
将由武汉擎科公司合成的miR-33a标准品用DEPC-H2O稀释为7×10-1、7×10-2、7×10-3、7×10-4、7×10-5、7×10-6、7×10-7ng/μL备用。
(2)Taqman方法检测miR-33a标准品的灵敏度验证
采用AB公司Taqman商品化试剂(miR-33a的引物号为4427975、探针号为000424，U6引物号为4427975、探针号为001093)，对上述(1)中的7个梯度浓度的miR-33a标准品进行检测，结果如图3所示。
(3)B-RCA方法检测miR-33a标准品的灵敏度验证
①连接反应
连接反应第一步：8.5μL的反应体系包含0.5μL的上述(1)中7个不同浓度的miR-33a标准品中的一种，特异性闭锁探针(20nM)1μL，DEPC-H2O 7μL；将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为55℃5min，39℃30min。各管反应体系配制具体如表4。
表4 miR-33a标准品检测灵敏度连接反应第一步反应体系
连接反应第二步：向连接反应第一步反应产物的各管中加入T4DNA连接酶(400U/μL)0.5μL、T4DNA连接酶缓冲液(10×)1μL；将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为16℃3h，4℃过夜。
②分支滚环扩增反应(B-RCA)
向连接反应第二步反应产物各管中加入B-RCA反应液，B-RCA反应液由第二引物(1μM)、phi29DNA聚合酶(10U/μL)、phi29DNA聚合酶缓冲液(10×)、dNTPs(2.5mM)、EvaGreen(20×)和DEPC-H2O组成。
20μL的B-RCA反应体系：连接反应第二步产物10μL、第二引物(1μM)2μL、phi29DNA聚合酶(10U/μL)0.5μL、phi29DNA聚合酶缓冲液(10×)2μL、dNTPs(2.5mM)2μL、EvaGreen(20×)1μL、DEPC-H2O 2.5μL。
加样完成后，将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为30℃3h，65℃10min。
③荧光信号强度检测
将B-RCA反应产物避光放置于4℃60min后检测荧光强度，激发波长480nm、发射波长530nm。
④结果
为保证实验结果的准确性，在实验过程中，阴性对照荧光强度信号强度≤10000，miR-33a标准品荧光信号强度≥10000，并且与标准品的浓度有剂量相关性，表明实验成功。具体结果图4所示。
图3和图4结果表明，Taqman方法检测miR-33a标准品的检测限是7×10-4ng/μL，此时Ct>35。而B-RCA方法检测miR-33a标准品的检测限是7×10-6ng/μL，此时荧光强度为15149±443。说明B-RCA的灵敏度是Taqman的100倍。
实施例5 B-RCA方法检测miR-33a/b标准品的特异性比较
(1)稀释miR-33标准品
将由武汉擎科公司合成的miR-33a、miR-33b标准品用DEPC-H2O稀释为200ng/μL备用。
(2)B-RCA方法检测miR-33a/b标准品的特异性验证
①连接反应
连接反应第一步：8.5μL的反应体系包含miR-33标准品0.5μL，特异性闭锁探针(20nM1μL，DEPC-H2O 7μL；将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为55℃5min，39℃30min。各管反应体系配制具体如表5。
表5 miR-33a/b标准品特异性检测连接反应第一步反应体系
连接反应第二步：向连接反应第一步反应产物的各管中加入T4DNA连接酶(400U/μL)0.5μL、T4DNA连接酶缓冲液(10×)1μL；将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为16℃3h，4℃过夜。
②分支滚环扩增反应(B-RCA)
向连接反应第二步反应产物各管中加入B-RCA反应液，B-RCA反应液由第二引物(1μM)、phi29DNA聚合酶(10U/μL)、phi29DNA聚合酶缓冲液(10×)、dNTPs(2.5mM)、EvaGreen(20×)和DEPC-H2O组成。
20μL的B-RCA反应体系：连接反应第二步产物10μL、第二引物(1μM)2μL、phi29DNA聚合酶(10U/μL)0.5μL、phi29DNA聚合酶缓冲液(10×)2μL、dNTPs(2.5mM)2μL、EvaGreen(20×)1μL、DEPC-H2O 2.5μL。
加样完成后，将反应管置于PCR仪中进行反应，条件为30℃3h，65℃10min。
③荧光信号强度检测
将B-RCA反应产物避光放置于4℃60min后检测荧光强度，激发波长480nm、发射波长530nm。
④结果
为保证实验结果的准确性，在实验过程中，阴性对照荧光强度信号强度≤10000，miR-33a、miR-33b、miR-33a+b标准品荧光信号强度≥10000，表明实验成功。具体结果图5所示，表明B-RCA方法可以同时检测血液miR-33a和miR-33b。
(3)miR-33a和miR-33b与人类GenBank序列比对
采用在线NCBI blast软件对miR-33a、miR-33b的序列与人类GenBank进行比对，结果表明人类miR-33a和miR-33b与其它基因的同源性都很低，同源性最高的序列只有66％和75％的同源性；同时miR-33a和-b之间的同源性高达90％(19/21)，证实本试剂盒B-RCA方法可以特异性检测miR-33a/b。
因此，实施例结果表明，相比于传统的qPCR和Taqman方法，本发明建立的B-RCA方法和试剂盒检测miR-33a/b具有良好的特异性和高度的灵敏性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种临床检测低丰度miR-33a/b的B-RCA方法及试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacaatgcac tttgcatttc agtttacggt ttagcatttc gcaatttttg caatgcaac 59
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttcacgaat tttttgcatt tcagtttacg gtttagcatt tcgcaatttt aaaatatgga 60
acg 63
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catttcagtt tacggtttag c 21

Claims (8)

1.一种基于B-RCA技术的miR-33a/b检测试剂盒，其特征在于：包含用于检测miR-33a/b的闭锁探针，用于检测内参基因的闭锁探针，以及第二引物；
所述的用于检测miR-33a/b的闭锁探针的序列如下：
5'-PO4-TACAATGCACTTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTTGCAATGCAAC-3'；
所述的第二引物的序列如下：
5'-CATTTCAGTTTACGGTTTAGC-3'。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的内参基因为U6，用于检测内参基因的闭锁探针的序列如下：
5'-PO4-CTTCACGAATTTTTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTAAAATATGGAACG-3'。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包含阴性对照和阳性对照，阴性对照为不含miR-33a/b的质控品或不含总RNA的质控品，阳性对照为含有miR-33a/b标准品的质控品或含有总RNA的质控品。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、dNTPs、荧光染料EvaGreen和DEPC-H2O。
5.权利要求1-3任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：提取待测样本总RNA；配制包含待测样本总RNA、闭锁探针的体系进行连接反应第一步；在连接反应第一步的反应产物中加入T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液进行连接反应第二步；在连接反应第二步的反应产物中加入第二引物、phi29 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶缓冲液、dNTPs和EvaGreen荧光染料形成B-RCA反应体系进行B-RCA反应；检测B-RCA反应产物的荧光强度。
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：
所述的连接反应第一步的体系为：总RNA 0.5μL，闭锁探针1μL，DEPC-H2O 7μL；
所述的连接反应第二步的体系为：连接反应第一步产物、T4 DNA连接酶0.5μL、T4 DNA连接酶缓冲液1μL；
所述的B-RCA反应的体系为：连接反应第二步产物10μL、第二引物2μL、phi29 DNA聚合酶0.5μL、phi29 DNA聚合酶缓冲液2μL、dNTPs 2μL、EvaGreen 1μL、DEPC-H2O 2.5μL。
7.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：
所述的连接反应第一步的反应条件为：55℃5min，39℃30min；
所述的连接反应第二步的反应条件为：16℃3h，4℃过夜；
所述的B-RCA反应的反应条件为：30℃3h，65℃10min。
8.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述的B-RCA反应产物的荧光强度的检测条件为：B-RCA反应后产物放置4℃60min再检测荧光强度，激发波长480nm，发射波长530nm。
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