CN105705655A - 用于对nras和braf核酸进行多重分析的组合物及方法 - Google Patents

用于对nras和braf核酸进行多重分析的组合物及方法 Download PDF

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Abstract

本文描述了涉及对NRAS和/或BRAF的改变(例如拷贝数和表达水平的变异和/或突变(包括点突变)的存在)进行检测的方法和测定法。现有方法由于例如有限的灵敏度、实验室间不一致或不能提供必要的多重性能，在临床适用性方面受到限制。本文提供的方法和测定法允许对患者实施更快更经济的测试和筛查的多模态、多重测定法，使得健康护理得到改进。

Description

用于对NRAS和BRAF核酸进行多重分析的组合物及方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年8月14日提交的美国临时申请号61/865,754的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并在此以引用的方式将其整体并入。所述ASCII副本创建于2014年7月29日，命名为046264-078891-PCT_SL.txt，大小为28,830字节。
技术领域
本文所述的技术涉及使得能够对突变(包括点突变)的存在和/或不存在进行检测的测定法和方法。
背景技术
个性化医疗的发展使得鉴别了当被突变和改变时可引起疾病的基因。例如，在与野生型或健康受试者相比时，在患有给定疾病或具有发展为给定疾病风险的受试者中，编码基因的序列可能突变。
例如，NRAS和BRAF与癌症相关，任何给定的癌细胞均可展示出NRAS和BRAF二者或之一的突变。这些突变与例如疾病的严重程度和/或对特定治疗选项的应答相关。用于检测此类突变的传统方法提供的多重性(multiplex)能力低于综合临床诊断所需的水平。多重测定法的开发可允许更快更经济地对患者进行测试和筛查，使得健康护理得到改进。
发明内容
本文所述的技术涉及用于对NRAS和/或BRAF的突变(例如序列的改变)进行检测的方法和测定法。发明人开发了测定法并发现了方法，以在单个多重测定法中对NRAS和/或BRAF的突变的存在或不存在进行可靠测定。
一方面，本文描述了用于对NRAS和/或BRAF的突变进行检测的测定法，所述测定法包括：将核酸样本的部分与引物组相接触，其中，所述引物组包含引物对亚组，其中，各引物对扩增包含序列变异的NRAS或BRAF序列；对包含所述样本的所述部分和一个或多个所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方案(regimen)，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子存在或不存在，其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异，以及其中，所述引物中的一个或多个选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：39所组成的组。
在一些实施方式中，所述引物对选自于由如下引物对所组成的组：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。在一些实施方式中，一个或多个序列变异为点突变。在一些实施方式中，NRAS点突变选自于由如下点突变所组成的组：G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2。在一些实施方式中，BRAF点突变选自于由如下点突变所组成的组：V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA。在一些实施方式中，对存在或不存在G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2进行检测。在一些实施方式中，对存在或不存在V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA进行检测。
在一些实施方式中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。在一些实施方式中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。
在一些实施方式中，一种或多种引物为双结构域引物。在一些实施方式中，来自引物组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。在一些实施方式中，借助有区别的大小(distinctsizes)，将来自引物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。在一些实施方式中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自引物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。在一些实施方式中，所述引物以约为实施例1的浓度存在于反应混合物中。
一方面，本文描述了包含一个或多个引物对的组合物，所述引物对选自于由具有如下序列的分子所组成的组：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。在一些实施方式中，所述组合物可包含由具有如下序列的分子所组成的引物对：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；以及SEQIDNO：17和SEQIDNO：18。在一些实施方式中，所述组合物可包含由具有如下序列的分子所组成的引物对：SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。在一些实施方式中，所述引物对特异性地杂交至靶多核苷酸。在一些实施方式中，各引物对的至少一个成员为荧光标记的。
一方面，本文描述了包含荧光标记的扩增产物的组合物，所述荧光标记的扩增产物由利用一个或多个引物对对靶多核苷酸进行扩增而获得，所述一个或多个引物对选自于由具有如下序列的分子所组成的组：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
在一些实施方式中，所述组合物可进一步包含选自于由如下组分所组成的组中的反应混合物组分：缓冲液、dNTP以及DNA聚合酶。在一些实施方式中，所述组合物可进一步包含由FFPE肿瘤样本制备的核酸样本。在一些实施方式中，所述组合物可进一步包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。在一些实施方式中，所述引物以约为实施例1的浓度存在。
附图说明
图1描绘了根据实施例1所述的实施方式在ICEPlex系统上对NRAS/BRAF靶标进行多重检测的结果。上方子图展示了在TYE通道检测到4种BRAF靶标。下方子图展示了在FAM通道检测到12种NRAS靶标。
图2描绘了如实施例1所述对参照基因对照进行多重检测的结果。
具体实施方式
本文所述技术的实施方式涉及用于对NRAS和/或BRAF的变异(例如序列(突变)、表达水平和/或基因拷贝数的变异)进行检测的方法和测定法，特别是用于对NRAS和/或BRAF的变异进行检测的多重和多模态(multimodal)测定法和方法。引物组和/或引物对亚组间的干扰是多重PCR测定法中遇到的问题。本文所述的方法和组合物至少在允许在单个反应中对多种不同的NRAS和/或BRAF突变(例如SNP)进行高灵敏度的多重检测且引物对之间无显著交叉反应方面相对现有技术做出了改进。
已知大量不同的NRAS和/或BRAF变异，由于变异的间隔较近，甚至在一些情况下重叠，利用现有的单反应技术对一个样本中的此类变异组的存在和/或不存在进行区分是存在问题的。必须将背景信号最小化，否则对于识别特定的突变而言测定法将不能可靠地工作。
本文使用的术语“NRAS”或“神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物”指的是1号染色体上编码的小GTPaseRas家族蛋白。大量物种的NRAS序列为本领域所熟知，例如人NRAS(NCBI基因ID：4893；SEQIDNO：40(NCBIRefSeq：NM_002524；mRNA)；SEQIDNO：41(NCBIRefSeq：NP_002515；多肽))。
本文使用的术语“BRAF”或“v-Raf鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B”指的是与AKT1相互作用的Raf激酶家族丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶；CRaf、HRAS和YWHAB。大量物种的BRAF序列为本领域所熟知，例如人BRAF(NCBI基因ID：673；SEQIDNO：42(NCBIRefSeq：NM_004333；mRNA)；SEQIDNO：43(NCBIRefSeq：NP_004324；多肽))。
一方面，本文描述了用于对NRAS和/或BRAF的突变进行检测的测定法，所述测定法包括：将核酸样本的部分与引物组相接触，其中，所述引物组包含引物对亚组，其中，各引物对扩增包含序列变异的NRAS或BRAF序列；对包含所述样本的所述部分和一个或多个所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子存在或不存在，其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异。
在一些实施方式中，所述引物中的一个或多个选自于由具有序列SEQIDNO：1-SEQIDNO：39的分子所组成的组。在一些实施方式中，所述引物中的一个或多个选自于由具有序列SEQIDNO：1-SEQIDNO：18的分子所组成的组。在一些实施方式中，所述引物中的一个或多个选自于由具有序列SEQIDNO：19-SEQIDNO：39的分子所组成的组。在一些实施方式中，所述引物由具有序列SEQIDNO：1-SEQIDNO：18的分子所组成。在一些实施方式中，所述引物由具有序列SEQIDNO：19-SEQIDNO：39的分子所组成。
NRAS和/或BRAF的变异可被用于诊断、预后和/或治疗选择中。在一些实施方式中，在相同的反应混合物中(例如在相同的管、孔或器皿中)对NRAS和/或BRAF的多个突变进行检测。在一些实施方式中，本文所述的测定法在单管中实施，例如多个引物对亚组存在于单个反应混合物和/或器皿或容器中。因此，在所述实施方式中，单个扩增方案将提供关于多个突变存在和/或不存在的数据。
一方面，本文所述的方法和测定法涉及对NRAS和/或BRAF中序列变异的存在进行检测。本文使用的“序列变异”可以指替换、插入、缺失、重复或重排。在一些实施方式中，一个或多个序列变异为点突变。
序列变异(包括例如点突变、例如单核苷酸多态性(SNP))可以是表型上中性的，或者可具有将其与该基因座处的优势(predominant)序列所表现的表型相区别的相关变异表型。本文使用的“中性多态性”指的是序列变异不改变基因功能的多态性，“突变”或“功能多态性”指的是改变基因功能并因此具有相关表型的序列变异。群体中发生的基因座的序列变异被称为等位基因。当在群体内特定的基因座处出现两个以上等位基因的情况下提及个体的基因型时，“优势等位基因”为在所考虑的群体中出现频率最高的等位基因(即，当存在两个等位基因时，在超过50％的群体中出现的等位基因为优势等位基因；当存在多于两个等位基因时，“优势等位基因”为在目标群体中出现频率最高的等位基因(例如相对于该位点处的其它等位基因而言频率高至少5％))。术语“变体等位基因(variantallele)”用于指在该群体中出现频率低于优势等位基因的一个或多个等位基因(例如，当存在两个等位基因时，变体等位基因为在少于50％的目标群体中出现的等位基因；当存在多于两个等位基因时，变体等位基因为出现频率较低的全部等位基因(例如与优势等位基因相比频率低至少5％))。序列变异可存在于基因的gDNA和/或mRNA中(并因此可在基因的gDNA和/或mRNA中检测到)。
在一些实施方式中，序列变体可为点突变。本文使用的“点突变”指的是存在于基因组基因座的突变拷贝中的突变位点(包括插入和缺失)处的核苷酸种类，即，点突变指的是相比野生型序列而言核苷酸序列在单个碱基位置处的改变。SNP(单核苷酸多态性)是一类发生于群体中不同个体之间的相同基因组基因座处的点突变。点突变可为体细胞性的(somatic)(点突变发生于相同个体的不同细胞间)。
在一些实施方式中，序列变异可为单核苷酸多态性(SNP)。本文使用的“单核苷酸多态性”或“SNP”指的是在单个核苷酸残基处的核酸序列变异，包括单个核苷酸缺失、插入或碱基变化或替换。SNP可为等位的(allelic)。一些SNP具有确定的表型(例如疾病表型)，而其它SNP不具有已知的相关表型。本文所述的SNP检测方法可用于预测表型特征(例如预测对药物的响应性或药敏性)。在这一方面，本文所述的和本领域已知的SNP基因分型对于疾病或疾病易感性而言并不必然是诊断性的。
如所指出的，在一些实施方式中，改变包含SNP。虽然靶点处仅在两种核苷酸间变化的SNP并非不常见，SNP基因座处可为至少四种等位基因。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及能够对SNP基因座的一种等位基因进行检测的引物对亚组。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及能够对SNP基因座的两种等位基因进行检测的引物组(即，所述方法和组合物可涉及允许对两种SNP等位基因进行肯定性检测(affirmativedetection)或对该SNP进行“双相(biphasic)”基因分型的测定法)。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及能够对SNP基因座的三种等位基因进行检测的引物组(即，所述方法和组合物可涉及允许对三种SNP等位基因进行肯定性检测或对该SNP进行“三相(triphasic)”基因分型的测定法)。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及允许对SNP基因座的四种等位基因进行肯定性检测的测定法(即，所述方法和组合物可涉及四种SNP等位基因的多重检测或对该SNP进行“四相(quaduphasic)”基因分型)。在一些实施方式中，对SNP的优势等位基因和/或野生型等位基因进行检测。在一些实施方式中，不对SNP的优势等位基因和/或野生型等位基因进行检测。“肯定性检测”意味着该测定法允许对该特定等位基因进行扩增。例如当已知在该SNP位点仅存在两种可能时，可使用肯定性检测的替代法。在这种情况下，可对所述测定法进行设计，从而对两个变体中的一个进行扩增，而不对另一个进行扩增；所述测定法可肯定性地检测被扩增的变体并被动地检测另一个(即，缺少产物意味着存在另一等位基因或变体)。
在一些实施方式中，NRAS和/或BRAF序列变异可为点突变。在一些实施方式中，NRAS点突变可为导致如下氨基酸残基变化中的一种的点突变：G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2。在一些实施方式中，BRAF点突变可为导致如下氨基酸残基变化中的一种的点突变：V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA。
在多个实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及利用至少一组寡核苷酸引物实施PCR扩增方案。本文使用的“引物”指的是能够序列特异性地与多核苷酸模板退火，并提供3'端作为模板依赖型聚合酶的底物，以生成与多核苷酸模板互补的延伸产物的DNA或RNA多核苷酸分子或它们的类似物。起始和延伸的条件通常包括在合适的缓冲液(在该上下文中，“缓冲液”包括溶剂(通常为水性)并添加必要的辅因子和影响pH、离子强度等的试剂)中存在至少一种但更优选全部四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂(例如DNA聚合酶或逆转录酶)并处于合适的温度。本文所述的方法中有用的引物一般为单链，且引物及其互补链可退火形成双链多核苷酸。根据本文所述的方法和组合物的引物的长度可为小于或等于300个核苷酸，例如长度小于或等于300个、或250个、或200个、或150个、或100个、或90个、或80个、或70个、或60个、或50个、或40个核苷酸，并优选长度为30个以下、或20个以下、或15个以下的核苷酸，但长度至少为10个核苷酸。
本文使用的术语“组(set)”意味着核酸样本、引物或其它实体的集合。组将包含已知数目的至少两个此类实体。引物组包含特异性针对靶序列的至少一个正向引物和至少一个反向引物。引物组将包含至少一个引物对亚组，例如一个引物对亚组、两个引物对亚组、三个引物对亚组、四个引物对亚组、五个引物对亚组、六个引物对亚组或更多引物对亚组。在一些实施方式中，引物组可包含对NRAS、BRAF或者NRAS和BRAF两者的突变进行检测的引物对亚组。
因此，本文使用的“引物对亚组”指的是至少两个引物的集合，所述至少两个引物包括正向引物和反向引物，其中一个与靶核酸序列的第一链退火，另一个与第一链的互补链退火。在一些实施方式中，引物对亚组的第一引物可退火至靶核酸序列的第一链，引物对亚组的第二引物(例如反向引物)可退火至该链的互补链。当退火至靶标和/或其互补链时，引物的取向可为使得从引物对亚组的一个引物的引物延伸开始进行的核酸合成将生成与引物对亚组的第二引物的至少一个区域互补的核酸序列。核酸靶标和/或序列的“第一链”可为包含靶核苷酸和/或靶点基因座序列的双链核酸的任一链，但一旦选定，便定义其互补链为第二链。因此，本文使用的“正向引物”为退火至核酸靶标第一链的引物，而同组的“反向引物”为退火至该核酸靶标第一链的互补链的引物。
在特异性针对靶核酸的引物的上下文中使用时，本文使用的“特异性”指的是引物和靶标间的互补性水平，这样的互补性水平使得存在这样的退火温度：在该退火温度下，引物将退火至靶核酸并介导靶核酸的扩增，而并不退火至样本中存在的非靶标序列或介导非靶标序列的扩增。在对序列变异进行扩增的引物对亚组的上下文中，亚组中引物的至少一个对该序列变异具有特异性，例如该引物对亚组将不扩增不包含该序列变异的野生型序列。
制备引物的方法为本领域所熟知，多种商用资源提供适于提供根据本文所述方法和组合物的引物的寡核苷酸合成服务，例如INVITROGENTM的定制DNA寡核苷酸(LifeTechnologies；GrandIsland，NY)或来自IDT，Coralville，IA的定制DNA寡核苷酸。
在一些实施方式中，一种或多种引物可为双结构域引物。双结构域引物在2013年2月22日提交的PCT/US13/27383(以WO2013/126743公开)中具体描述；以引用的方式将其内容整体并入本文。双结构域引物可使得能够通过例如减少多种来源的背景来提高灵敏度。
本文描述了引物的示例性实施方式。在一些实施方式中，一种或多种引物可选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：39所组成的组。示例性的引物对亚组在表1和表4中描绘。在一些实施方式中，引物可以约为实施例1中所述的浓度存在于反应混合物中。
在一些实施方式中，所述引物对可选自于由如下引物对所组成的组：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
在一些实施方式中，所述引物对可选自于由如下引物对所组成的组：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；以及SEQIDNO：17和SEQIDNO：18。在一些实施方式中，所述引物对包含由如下引物对所组成的组：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；以及SEQIDNO：17和SEQIDNO：18。在一些实施方式中，所述引物对由如下引物对组成：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；以及SEQIDNO：17和SEQIDNO：18。
在一些实施方式中，所述引物对可选自于由如下引物对所组成的组：SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。在一些实施方式中，所述引物对可选自于由如下引物对所组成的组：SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；以及SEQIDNO：31和SEQIDNO：32。在一些实施方式中，所述引物对包含由如下引物对所组成的组：SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；以及SEQIDNO：31和SEQIDNO：32。在一些实施方式中，所述引物对由如下引物对组成：SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；以及SEQIDNO：31和SEQIDNO：32。
本文所述的方法和组合物涉及实施聚合酶链式反应(PCR)扩增方案。本文使用的术语“扩增方案”指的是特异性扩增感兴趣的核酸序列(即，使得感兴趣的核酸序列的丰度升高)的过程，更具体地，指的是当之前的聚合酶延伸产物作为后续轮延伸的模板时发生的指数扩增。根据本发明的PCR扩增方案包含至少2个、并优选至少5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个以上的重复循环(iterativecycles)，其中，各循环包括如下步骤：1)链分离(例如热变性)；2)寡核苷酸引物退火至模板分子；以及3)退火引物的核酸聚合酶延伸。这些步骤各自所需的条件和时间可由本领域技术人员设计。根据本文所述方法的扩增方案优选在热循环仪中进行，许多热循环仪为商购可得的。
在一些实施方式中，例如当待如本文所述对mRNA的改变进行测定时，可在本文所述的PCR扩增方案之前对核酸样本进行逆转录。逆转录方案和试剂为本领域所熟知，并为商购可得的。逆转录方案的示例性实施方式如下：将5μL包含RNA和gDNA二者(例如25ngRNA和2.5nggDNA)的核酸样本加入至反应混合物，所述反应混合物包含RT缓冲液、0.5mMdNTP、5nMRT引物以及20单位SuperScriptIIITM逆转录酶(RNA依赖型DNA聚合酶)。随后将反应在50℃孵育30分钟、在90℃孵育5分钟并在4℃孵育5分钟。
PCR需要使用核酸聚合酶。本文使用的短语“核酸聚合酶”指的是催化核苷三磷酸的模板依赖型聚合，以形成与模板核酸序列互补的引物延伸产物的酶。核酸聚合酶在退火引物的3'端起始合成，并在朝向模板5'端的方向继续。多种核酸聚合酶为本领域所知晓并为商购可得的。一组优选的核酸聚合酶为热稳定的，即，其在被置于足以使得退火的互补核酸链变性的温度下(例如94℃或有时更高)维持功能。在一些实施方式中，聚合酶可为delta-exo-AptaTaq聚合酶。
如本领域所理解的，PCR需要包含链分离步骤(通常涉及对反应混合物进行加热)在内的循环。本文使用的术语“链分离”或“使链分离”意味着对核酸样本进行处理，使得互补的双链分子分离为两个单链，从而能够用于退火至寡核苷酸引物。更具体地，根据本文所述方法的链分离通过将核酸样本加热至高于其Tm来实现。一般而言，对于处于适于核酸聚合酶的缓冲液中的含有核酸分子的样本而言，加热到94℃足以实现链分离。示例性的缓冲液含有50mMKC1、10mMTric-HCl(25℃时pH为8.8)、0.5mM至3mMMgCl2和0.1％BSA。
同样如本领域所理解的，PCR需要将引物退火至模板核酸。本文使用的“退火”指的是允许两条互补或实质上互补的核酸链杂交，更具体地，当在PCR的上下文中使用时，杂交使得形成模板依赖型聚合酶的引物延伸底物。引物-靶核酸的退火条件根据引物的序列和长度而改变，并以所计算的引物的Tm为基础。一般而言，扩增方案中的退火步骤涉及在链分离步骤后将温度降低至以所计算的引物序列的Tm为基础的温度，保持足以允许此类退火的时间。
本领域技术人员可利用多种广泛可得的算法中的任何算法容易地预测Tm，所述算法例如OLIGOTM(MolecularBiologyInsightsInc.，Colorado)引物设计软件和VENTRONTITM(InvitrogenInc.，California)引物设计软件以及可在互联网上获得的程序(包括Primer3和OligoCalculator)。例如，可用NetPrimer软件(PremierBiosoft；PaloAlto，CA；并在万维网http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html上免费可得)对Tm进行计算。还可使用如下公式对引物的Tm进行计算(该公式为NetPrimer软件所使用，并在Frieir等，PNAS198683：9373-9377中更详细地描述，以引用的方式将其整体并入本文)。
Tm＝ΔH/(ΔS+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15
其中，ΔH为螺旋形成的焓；ΔS为螺旋形成的熵；R为摩尔气体常数(1997cal/℃*mol)；C为核酸浓度；[K+]为盐浓度。对于大部分扩增方案而言，将退火温度选择为比预测的Tm低约5℃，然而，可使用接近和高于Tm(例如比预测的Tm低1℃-5℃，或者比预测的Tm高1℃-5℃)的温度，也可使用例如比预测的Tm低超过5℃(例如比预测的Tm低6℃、低8℃、低10℃或更低)的温度。一般而言，退火温度越接近Tm，退火的特异性越高。在PCR扩增方案中允许引物退火的时间很大程度上依赖于反应的体积(更大的体积需要更长的时间)，也依赖于引物和模板的浓度(与较低的相对浓度相比，引物相对于模板的相对浓度越高所需的时间越少)。依赖于体积和引物/模板的相对浓度，扩增方案中的引物退火步骤可为约1秒至5分钟，然而通常为10秒至2分钟、优选约30秒至2分钟。
本文使用的“实质上退火”指的是在PCR扩增方案过程中足以生成可检测水平的特异性扩增产物的退火程度。
PCR还依赖于各循环时退火引物的聚合酶延伸。本文使用的术语“聚合酶延伸”意味着借助核酸聚合酶，以模板依赖型方式将至少一个互补核苷酸掺入至退火引物的3'端。聚合酶延伸优选添加超过一个核苷酸、优选上至并包括对应于模板全长的核苷酸。聚合酶延伸的条件随聚合酶的种类而改变。聚合酶延伸所使用的温度通常以酶的已知活性性质为基础。虽然退火温度需要例如处于低于酶的最佳温度，使用较低的延伸温度通常是可接受的。一般而言，虽然在低于酶的最佳延伸温度的温度下该酶保留有至少部分的活性，最常用的热稳定性聚合酶(例如Taq聚合酶和其变体)参与的聚合酶延伸在65℃-75℃、优选在约68℃-72℃进行。
引物延伸在允许退火的寡核苷酸引物延伸的条件下进行。本文使用的术语“允许退火的寡核苷酸延伸从而生成延伸产物的条件”指的是包括例如温度、盐与辅因子浓度、pH和酶浓度在内的条件组，在此类条件组之下核酸聚合酶催化引物延伸。此类条件将随所用核酸聚合酶的种类而改变，然而用于大量有用聚合酶的条件为本领域技术人员所熟知。一个示例性的条件组为50mMKCl、10mMTric-HCl(25℃时pH为8.8)、0.5mM-3mMMgCl2、200μM每种dNTP和0.1％BSA，72℃，在该条件下Taq聚合酶催化引物延伸。
在一些实施方式中，热循环条件可与实施例1中所描述的方案一致。
在一些实施方式中，本文所述的方法和测定法所使用的缓冲液可包含Tris缓冲液、海藻糖、乙酸钾、甘油、甜菜碱、氯化镁、氯化钾、硫酸铵、DMSO、DTT、BSA、dNTP、吐温-20和聚合酶。在一些实施方式中，本文所述的方法和测定法所使用的缓冲液可包含10mM-400mMTris缓冲液(pH7.5至9.5)、2％-20％海藻糖、10mM-300mM乙酸钾、1％-7.5％甘油、100mM-2M甜菜碱、2.5mM-12.5mM氯化镁、1mM-10mM氯化钾、1mM-10mM硫酸铵、0.1％-2％DMSO、1mM-10mMDTT、10μg/mL-1,000μg/mLBSA、50mM-400mMdNTP、0-1％吐温-20和1个酶单位-10个酶单位的聚合酶。
本文使用的“扩增产物”或“扩增子”指的是由PCR反应产生的多核苷酸，该多核苷酸是特定靶核酸序列和/或其互补序列的部分的拷贝，其核苷酸序列对应于模板核酸序列和/或其互补序列。虽然可提及双链DNA的各条链，本文所述的扩增产物将一般为双链DNA。
本文所述的方法利用PCR对基因突变进行定量或评估。对于本文所述的任何方法，可通过在多个循环处从PCR反应中取出样本，分离所取出的样本中的扩增子并检测扩增子的量来实现。以这一方式测量的各扩增子的扩增谱允许对初始模板进行定量。参见例如美国专利号8,321,140和美国专利申请号2013/0053274；以引用的方式将它们整体并入本文。
在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及多重PCR。本文使用的“多重PCR”指的是能够通过使用引物组中的多于一对引物(例如至少多于一种正向引物和/或多于一种反向引物)，实现在一个反应器皿中对多于一种靶核酸序列进行同时扩增，并随后或同时对多个产物进行检测的PCR变型。多重扩增不仅对于检测多个靶标的存在是有用的，对于缺失、突变以及多态性和/或表达水平的分析、检测和/或基因分型和/或定量测定法而言也是有用的。多重可以指在单个反应中检测2-1,000种不同的靶序列和/或靶核酸序列的改变。本文使用的多重指的是在单个反应中检测2-1,000间的任意范围(例如5-500、25-1000或10-100)种的不同靶序列等。以非限制性实例的方式，作为本文所述方法的一部分的多重PCR反应能够在单个反应中对至少两个不同的等位靶点基因座处的至少两个SNP的两种以上可能的等位基因的存在进行肯定性检测。当用于PCR时，术语“多重”隐含了在同一PCR反应中存在特异性针对至少两种不同的靶序列的引物。因此，即便在给定样本中实际检测到的仅是所述至少两种靶序列中的一种(或甚至没有)，认为其中存在特异性针对两种不同的靶序列的引物组的反应为多重扩增。因此，在一些实施方式中，多重PCR也可以指包含多对引物的反应，其中，当反应中存在一种或多种靶标时，所述反应可产生一种或多种特异性扩增产物。
例如，可通过在扩增反应期间或之后的任何时间进行重复采样，随后对扩增产物进行分离和检测，从而促进定量这个方面。采样例如可包括移出反应的等分试样(aliquot)。采样可在例如每个循环结束或者在每数个循环(例如每两个循环、每三个循环、每四个循环等)结束时发生。虽然均匀采样间隔是最常期望的，并不要求采样以均匀间隔实施。仅作为一个实例，采样程序可涉及在最初的五个循环的每个循环后采样，随后在每隔一个循环后采样，反之亦然。
可利用数种不同通用模式中的任意模式实施从扩增反应中对等分试样的采样或配分(dispensing)。采样或移出方法可依赖于多种因素中的任意因素，包括但不限于可用的设备、待分析的样本数以及检测相对于样本收集的时机(例如同时vs.连续)。移出或挤出样本的确切方法并不必然对本文所述的方法构成限制。特别是在高通量应用中，优选利用自动化设备进行采样。还可通过从PCR反应直接电动注射或流体动力学注射至毛细管电泳设备中来进行采样。本发明方法中使用的采样方法优选适合于尽可能减少循环反应中的污染，例如通过使用在取出单个等分试样后弃去的移液管头或针，或者通过使用相同的头或针来配分来自同一PCR反应器皿的样本。同时采样和检测的方法为本领域技术人员所知晓(参见例如美国专利申请公开2004/0166513，以引用的方式并入本文)。
采样步骤所配分的核酸的量和/或等分试样的体积可根据例如扩增反应的总体积、产物检测的灵敏度以及所使用的采样和/或分离类型而改变。扩增体积可在数微升至数百微升间变化(例如5μl、10μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl、150μl、或200μl以上)，优选在10μl-150μl范围内、更优选在10μl-100μl范围内变化。扩增反应的确切体积并不限制本发明。等分试样的体积可在反应混合物的0.01％-30％间变化。电动注射至毛细管电泳通常将核酸加样至毛细管，但不明显降低被采样反应的体积。可在多个独立的核酸扩增混合物中实施扩增方案，任选地在多孔容器中进行。在其中进行扩增反应的容器并不必然限制本文所述的方法。
在多个实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及对各个靶核酸序列(例如对各个靶改变)的扩增产物(例如扩增子)进行检测。在一些实施方式中，对各个靶核酸序列的扩增产物的检测肯定性地表明样本中该靶核酸序列的存在。在一些实施方式中，对各个靶核酸序列的扩增产物的定量检测表明样本中该靶核酸序列的水平。
在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及两个以上引物对亚组的扩增产物，所述扩增产物彼此间应是可区分的。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及PCR扩增方案，其中，可借助有区别的大小将两个以上引物对亚组的扩增产物区分开。如本文所使用的，如果能够从具有不同大小(differentsize)的核酸中将其分辨出，则该核酸具有“有区别的大小”。“不同大小”指的是长度至少存在一个核苷酸的差异的核酸分子。一般而言，对于本文所述方法有用的具有有区别的大小的扩增产物的核苷酸数量差异高于或等于给定分离或检测方法中使用的分离过程的分辨极限。例如，当分离的分辨极限是一个碱基时，具有有区别的大小的扩增产物的长度具有至少一个碱基的不同，但也可以具有2个碱基、5个碱基、10个碱基、20个碱基、50个碱基、100个碱基或更多碱基的不同。当分辨极限是例如10个碱基时，具有有区别的大小的扩增产物将具有至少10个碱基的不同，然而也可以具有11个碱基、15个碱基、20个碱基、30个碱基、50个碱基、100个碱基或更多碱基的不同。
在一些实施方式中，引物或其任意部分的长度及与其退火的靶核酸序列的片段的长度均可改变。所扩增的靶序列长度的变化(例如通过将正向引物和反向引物的位置选择为彼此更远离或更接近)是保证使来自不同靶标的产物之间易于区分的直接方法。引物长度的变化(特别是双结构域引物的5'尾区长度的变化)对于例如在测定法中将给定靶基因座的特定等位基因的产物区分开而言是特别有效的。
在一些实施方式中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将扩增产物区分开。在一些实施方式中，将标记物掺入至引物。在一些实施方式中，将标记物缀合至引物。
在一些实施方式中，在PCR扩增方案完成后，标记物结合至引物。在一些实施方式中，标记物缀合至与引物特异性结合的抗体或其部分或寡核苷酸、或者缀合至附着至引物的部分(moiety)。
如果来自一种标记物的信号能够与来自另一种标记物的信号相区别，认为两种可检测标记物不同。可检测标记物可包括例如吸光染料、荧光染料或放射性标记物。荧光染料是优选的。一般而言，如果荧光信号与另一荧光信号的峰值发射波长分开有至少20nm，则该荧光信号与另一荧光信号是可区分的。与窄峰或更陡峭的峰相反，特别是当给定反应中荧光团的发射峰较宽时，更大的峰间隔是优选的。
可检测标记物、对所述可检测标记物进行检测的方法以及将所述可检测标记物掺入或偶联和/或结合至扩增产物的方法为本领域所熟知。以非限制性实例的方式提供以下内容。
在一些实施方式中，可检测标记物可包括能够通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学或化学手段(如荧光、化学荧光或化学发光)或任何其它适当的手段检测的标记物。
本文所述方法中使用的可检测标记物可为一级(primary)标记物(其中，该标记物包含可直接检测的部分或产生可直接检测部分的部分)或二级(secondary)标记物(其中，该可检测标记物结合至产生可检测信号的另一部分，例如，如在免疫标记中常见的使用二抗和三抗)。
可借助共价或非共价手段将可检测标记物连接至核酸。或者，可通过例如对经由配体-受体结合对设置实现与另一核酸的结合的分子或其它此类特异性识别分子进行直接标记而将可检测标记物连接。可检测标记物可包括但不限于放射性同位素、生物发光化合物、发色团、抗体、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
在一些实施方式中，可检测标记物可为荧光染料分子或荧光团，包括但不限于荧光素、藻红蛋白、Cy3TM、Cy5TM、别藻蓝蛋白、德克萨斯红(Texasred)、多甲藻素叶绿素(peridininchlorophyll)、青色素(cyanine)、串联缀合物(例如藻红蛋白-Cy5TM)、绿色荧光蛋白、罗丹明、异硫氰酸荧光素(FITC)和OregonGreenTM、罗丹明及衍生物(例如德克萨斯红和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC))、生物素、藻红蛋白、AMCA、CyDyesTM、6-carboxythiorescein(一般以缩写FAM和F表示)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4'5'-二氯-2'7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)以及罗丹明110；青色素染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮(umbelliferone)；苯甲酰亚胺染料，例如Hoechst33258；菲啶(phenanthridine)染料，例如德克萨斯红；乙锭(ethidium)染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；多甲川(polymethine)染料，例如青色素染料(如Cy3、Cy5等)；BODIPY染料和喹啉染料。
在一些实施方式中，可检测标记物可为放射性标记物，包括但不限于3H、125I、35S、14C、32P和33P。
在一些实施方式中，可检测标记物可为酶，包括但不限于辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。酶标记物可以产生例如化学发光信号、有色信号或荧光信号。
在一些实施方式中，可检测标记物为化学发光标记物，包括但不限于鲁米诺、萤光素或光泽精(lucigenin)。
在一些实施方式中，可检测标记物可为光谱比色标记物(spectralcolorimetriclabel)，包括但不限于胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯和胶乳(latex))珠。
在一些实施方式中，本文所述的组合物和方法涉及PCR扩增方案，其中，可通过测序将两个以上引物对亚组的扩增产物区分开。核酸测序方法为本领域所熟知，商业测序服务广泛可得(例如Genscript；Piscataway，NJ)。
在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及PCR扩增方案，其中，可借助熔解曲线分析(melting-curveanalysis)将两个以上引物对亚组的扩增产物区分开。熔解曲线分析的方法为本领域所熟知(例如Ririe等，AnalyticalBiochemistry1997245：154-160；Wittwer等，ClinicalChemistry200349：853-860；以及Liew等，ClinicalChemistry200750：1156-1164；以引用的方式将它们整体并入本文)。
优选对通过大小分离的扩增产物进行直接检测。然而，在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及PCR扩增方案，其中，可借助寡核苷酸杂交将两个以上引物对亚组的扩增产物区分开。具有本领域普通技术的人员能够利用靶核酸序列的序列信息，设计与单个靶标完全互补而不与其它靶核酸序列互补的探针。可对杂交条件进行常规优化，将不完全互补杂交的背景信号最小化。可将杂交探针设计为与引物序列杂交，或与扩增产物中不含引物的部分杂交，只要是探针所杂交的序列将该扩增产物与反应中存在的至少一种其它扩增产物区分开即可。
在一些实施方式中，本文所述的PCR扩增方案为多重方案。在一些实施方式中，能够通过至少两种方式将一个引物对亚组的扩增产物与其它引物对亚组的扩增产物区分开，例如，各引物对亚组可产生具有独特的可检测荧光标记物和可检测的大小差异的扩增子。在一些实施方式中，能够通过至少两种方式将一个引物对亚组的扩增产物与其它引物对亚组的扩增产物区分开，例如：1)特异性针对NRAS突变的各引物对亚组可产生带有第一可检测荧光标记物的扩增子，而特异性针对BRAF突变的各引物对亚组可产生带有第二可检测荧光标记物的扩增子；以及2)各引物对亚组可产生具有可检测的大小差异的扩增子。在一些实施方式中，能够通过至少两种方式将一个引物对亚组的扩增产物与其它引物对亚组的扩增产物区分开，例如：1)特异性针对NRAS突变的各引物对亚组可产生带有第一可检测荧光标记物的扩增子，而特异性针对BRAF突变的各引物对亚组可产生带有第二可检测荧光标记物的扩增子；以及2)带有相同的可检测荧光标记物的各引物对亚组可产生具有可检测的大小差异的扩增子(例如，由BRAF靶序列产生的全部扩增子可具有相同的荧光标记物，彼此通过大小区分开；并通过带有不同的荧光标记物与由NRAS靶序列产生的扩增子区分开)。
在一些实施方式中，本文所述的引物组例如在PCR扩增条件下可具有小于约30％的交叉杂交率(cross-hybridizationrate)。在一些实施方式中，本文所述的引物组例如在PCR扩增条件下可具有小于约20％的交叉杂交率。在一些实施方式中，本文所述的引物组例如在PCR扩增条件下可具有小于约10％的交叉杂交率。
本文所述的方法和组合物涉及对样本中靶核酸序列的存在和/或水平(例如基因改变的存在和/或水平)进行检测。靶核酸可为RNA或DNA。靶核酸可为双链(ds)核酸或单链(ss)核酸，例如dsRNA、ssRNA、dsDNA或ssDNA。靶核酸的非限制性实例包括核酸序列、包含突变的核酸序列、包含缺失的核酸序列、包含插入的核酸序列、序列变体、等位基因、多态性、点突变、SNP、microRNA、编码蛋白的RNA、非编码蛋白的RNA、mRNA、来自病原体(例如细菌、病毒或寄生虫)的核酸、与疾病相关或与患有或发展为疾病的可能性相关的核酸(例如与疾病相关或与患有或发展为疾病的可能性相关的多态性、标志物基因，或者其表达与疾病相关或与患有或发展为疾病的可能性相关的RNA)。
本文有用的样本包含核酸。在一些实施方式中，样本可进一步包含蛋白、细胞、流体、生物流体、保护剂和/或其它物质。在一些实施方式中，样本可获取自受试者。在一些实施方式中，样本可为获取自受试者的生物样本。在一些实施方式中，样本可为获取自受试者的诊断样本。以非限制性实例的方式，样本可为面颊拭子(cheekswab)、血液、血清、血浆、痰液、脑脊液、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、心包液、囊液(cystfluid)、肿瘤组织、组织、活组织切片(biopsy)、唾液、抽出物，或上述物质的组合。在一些实施方式中，样本可通过切除术或活组织切片获得。
在一些实施方式中，样本是澄清流体样本，例如经离心而来的澄清流体样本。在一些实施方式中，通过低速离心(例如3,000×g以下)并收集含有澄清流体样本的上清液来使样本澄清。
在一些实施方式中，样本可为新鲜收集的。在一些实施方式中，可在将样本用于本文所述的方法和组合物中之前，将所述样本储存。在一些实施方式中，样本为未经处理的样本。本文使用的“未经处理的样本”指的是除了稀释于溶液中和/或悬浮于溶液中外，未曾进行任何事先的样本预处理的生物样本。
在一些实施方式中，样本可获取自受试者，并在用于本文所述的方法和组合物之前对其进行保存或加工。以非限制性实例的方式，可将样本包埋于石蜡中、冷藏或冷冻。可在根据本文所述的方法和组合物测定核酸的存在之前，将冷冻的样本解冻。在一些实施方式中，样本可为加工过的或处理过的样本。用于对样本进行处理或加工的示例性方法包括但不限于离心、过滤、超声、均质化、加热、冷冻和解冻、与保护剂(例如抗凝血剂或核酸酶抑制剂)接触，以及上述方法的任意组合。在一些实施方式中，可利用化学试剂和/或生物试剂对样本进行处理。可采用化学试剂和/或生物试剂在加工和/或存储期间保护和/或保持样本或样本中所含核酸的稳定性。可替代地或额外地，可采用化学试剂和/或生物试剂使核酸从样本的其它组分中释放出。以非限制性实例的方式，在用于本文所述的方法和组合物之前，可用抗凝血剂处理血液样本。本领域技术人员熟知用于核酸分析的样本加工、保存或处理方法和过程。
在一些实施方式中，核酸样本可由FFPE肿瘤样本制备。在一些实施方式中，样本可包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者患有或诊断患有如下疾病：胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和/或甲状腺癌。参见例如Sattler等，TherAdvMedOncol20113：171-184；以引用的方式将其整体并入本文。可将“扩展(expander)”多核苷酸纳入和/或添加至本文所述的组合物和方法，从而改进使用例如FFPE样本时的性能。扩展多核苷酸和使用所述扩展多核苷酸的方法在国际专利公开WO2013/010074中描述。
在一些实施方式中，在用于本文所述的方法和组合物之前，对样本中存在的核酸进行分离、富集或纯化。从样本中分离、富集或纯化核酸的方法是本领域普通技术人员所公知的。以非限制性实例的方式，用于从各种样本类型中分离基因组DNA的试剂盒是可商购的(例如，目录号51104、51304、56504和56404；Qiagen；Germantown，MD)。
术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，指的是从中获取样本的生物体。受试者可为期望对生物体内或者包含该生物体的一个或多个细胞或该生物体内含有的一个或多个细胞中核酸的存在进行测定的任何生物体。本文使用的“受试者”可意味着生物体，例如细菌、寄生虫、植物或动物。在一些实施方式中，受试者可为人或动物。通常，所述动物为脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物(gameanimal)。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括例如小鼠、大鼠、旱獭(woodchucks)、雪貂(ferrets)、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛(cows)、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(如家猫)、犬科物种(如狗、狐狸、狼)、鸟类物种(如鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟)和鱼类(如鳟鱼(trout)、鲶鱼和鲑鱼)。个体或受试者包括前面所述的任何子集，例如上述的所有。
为方便起见，下文提供了在说明书、实施例以及所附权利要求书中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。提供此类定义以辅助描述具体实施方式，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不意味着限制所请求保护的发明。除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如果在本领域中术语的使用和本文所提供的该术语的定义之间存在明显不一致，应以本说明书中所提供的定义为准。
为方便起见，在此收集了本文在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。
术语“降低/下降(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”在本文中都用于表示降低了统计学显著的量。在一些实施方式中，“减少”或“降低/下降”或“抑制”通常是指与参照水平(例如不进行指定治疗)相比降低至少10％，并且可以包括例如降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。本文所使用的“减少”或“抑制”不包括与参照水平相比完全抑制或减少。“完全抑制”是指相比于参照水平而言100％抑制。降低/下降可优选低至对于未患有指定疾病的个体而言被认可为正常范围内的水平。
术语“增加/提高(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中都用于表示增加了统计学显著的量。在一些实施方式中，术语“增加/提高”、“增强”或“活化”可以是指与参照水平相比增加至少10％，例如与参照水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或10％-100％之间的任何增加，或与参照水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或2倍至10倍之间的任何增加或更高量的增加。在标志物或症状的情况下，“增加/提高”指此类水平的统计学显著增加。
本文使用的“改变”可以指例如与参照相比水平或数量(例如基因表达水平或基因拷贝数)的统计学显著变化或与参照(例如野生型和/或共有序列)相比序列的变化(例如核酸序列中的至少单个核苷酸变化)。
本文使用的“归一化”指的是用第一值除以第二值(例如获得每y水平的x水平)的过程，从而以相对于第二值表示第一值。x通常为被测量的项目(例如NRAS和/或BRAF的拷贝数或表达水平)，而y为参照(例如参照基因的拷贝数或表达水平)。归一化允许通过为例如存在于样本中的核酸的水平以及反应间的效率差异提供对照，对多个样本和/或反应中测得的水平进行比较。
本文使用的“部分(portion)”指的是整体的一部分(part/fraction)，例如整个分子的一部分。具体的分子可具有多个部分，例如两个部分、三个部分、四个部分、五个部分或更多部分。
在核酸的情况下，本文所使用的术语“分离的”或“部分纯化的”涉及从在其天然来源中与核酸一起存在的至少一种其它成分(例如，核酸或多肽)中分离出的核酸；和/或从当由细胞表达时会与核酸一起存在的至少一种其它成分(例如，核酸或多肽)中分离出的核酸。化学合成的核酸或使用体外转录/翻译合成的核酸被认为是“分离的”。
本文所使用的术语“核酸”或“核酸序列”指的是包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或它们的类似物的单元的聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链。或者，单链核酸可为不衍生自任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，模板核酸为DNA。在另一方面，模板为RNA。合适的核酸分子包括DNA，包括基因组DNA和cDNA。其它合适的核酸分子包括RNA，包括mRNA、rRNA和tRNA。核酸分子可为天然存在的(如在基因组DNA中)，或者可为合成的(即，基于人的行为制备)，或者可为两者的组合。核酸分子也可具有某些修饰，例如2'-脱氧、2'-脱氧-2'-氟代、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙基氧乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)、胆固醇添加以及硫代磷酸酯骨架(如美国专利申请20070213292中所述的)以及2'-氧和4'-碳原子之间通过亚甲基单元连接的某些核糖核苷(如美国专利号6,268,490中所述的)，将该专利和专利申请以引用的方式整体并入本文。
术语“基因”是指当可操作地连接至合适调控序列时在体外或体内转录(DNA)成RNA的核酸序列。所述基因可包含编码区域之前和之后的调控区域，例如，5'非翻译(5'UTR)序列或“前导(leader)”序列；以及3'UTR或“尾随(trailer)”序列；以及各编码片段(外显子)之间的间插序列(interveningsequences)(内含子)。
本文所使用的术语“互补”指的是核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对形成偏好的层级(hierarchy)，以使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。本文所使用的“基本上互补”指的是引物在引物的全长内与第二核苷酸序列具有至少90％的互补性，例如，90％互补、95％互补、98％互补、99％互补或100％互补。
术语“统计学显著的(statisticallysignificant)”或“显著地(significantly)”指统计显著性，并且通常意味着两个标准差(2SD)或更大的差别。
除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1％。
本文所使用的术语“包含/包括/含有(comprising或comprises)”用于表示对本发明方法或组合物必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对纳入未指定的要素保持开放。
术语“由…组成”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。
本文所使用的术语“基本上由…组成”涉及给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响该实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的要素。
除非上下文中明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非上下文中明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本文公开的实践或测试中，合适的方法和材料在下文有所描述。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempligratia)，并在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(forexample)”同义。
细胞生物学和分子生物学中常用术语的定义可以在如下著作中找到：“TheMerckManualofDiagnosisandTherapy”，第19版，MerckResearchLaboratories出版，2006(ISBN0-911910-19-0)；RobertS.Porter等(著)，TheEncyclopediaofMolecularBiology，BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；BenjaminLewin，GenesX，Jones&BartlettPublishing出版，2009(ISBN-10:0763766321)；以及Kendrew等(著)，MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference，VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。
除非另有说明，使用例如如下著作中所述的标准程序来实施本发明：Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第三版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，USA(2001)；Davis等，BasicMethodsinMolecularBiology，ElsevierSciencePublishing,Inc.，NewYork，USA(1995)；或MethodsinEnzymology：GuidetoMolecularCloningTechniques第152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmel著，AcademicPressInc.，SanDiego，USA(1987)；以引用的方式将它们全部整体并入本文。
其它术语在本发明各个方面的描述中进行定义。
出于描述和公开的目的，在此以引用的方式将本申请通篇所引用的所有专利与其它出版物(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请以及共同的未决(co-pending)专利申请)明确地并入本文，例如在此类出版物中描述的可用于本文所述技术的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
对本公开的实施方式的描述不意味着穷举或将本公开限制在所公开的确切形式。尽管本文出于说明目的对本公开的具体实施方式和实施例进行了描述，本领域技术人员将会认识到，可在本公开范围内作出多种等同修改。例如，虽然将方法步骤或功能以给定顺序给出，其它实施方式可以不同顺序来实施功能、或可以基本上同时实施这些功能。本文所提供的本公开的教导可以适当的方式应用于其它程序或方法。可将本文所述的各种实施方式组合以提供进一步的实施方式。如有需要的话，可对本公开的方面进行修改，以利用上述参考文献和申请中的组合物、功能和构思，来提供本公开更进一步的实施方式。可根据详细描述来对本公开进行上述改变和其它改变。所有此类修改都旨在落入所附权利要求书的范围之内。
任何前述实施方式中的具体要素均可进行组合或替代其它实施方式中的要素。此外，尽管与本公开的特定实施方式相关的优势已经在这些实施方式的上下文中描述，其它实施方式也可表现出此类优势，但不是所有实施方式都必须展现出此类优势，才能落入本公开的范围。
本文所述的技术进一步由以下实施例予以说明，但决不应当理解为本文所述的技术被进一步限定。
可根据任何以下编号段落对本文所述技术的一些实施方式进行定义：
1.一种用于对NRAS和/或BRAF的突变进行检测的测定法，所述测定法包括：
将核酸样本的部分与引物组相接触，
其中，所述引物组包含引物对亚组，其中，各引物对扩增包含序列变异的NRAS或BRAF序列；
对包含所述样本的所述部分和一个或多个所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；
检测各引物对的扩增子存在或不存在；
其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异；以及
其中，所述引物中的一个或多个选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：39所组成的组。
2.如段落1所述的测定法，其中，所述引物对选自于由如下引物对所组成的组：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
3.如段落1或2所述的测定法，其中，一个或多个所述序列变异为点突变。
4.如段落1-3中任一项所述的测定法，其中，NRAS点突变选自于由如下点突变所组成的组：
G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2。
5.如段落1-4中任一项所述的测定法，其中，BRAF点突变选自于由如下点突变所组成的组：
V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA。
6.如段落1-5中任一项所述的测定法，其中，对存在或不存在G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2进行检测。
7.如段落1-6中任一项所述的测定法，其中，对存在或不存在V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA进行检测。
8.如段落1-7中任一项所述的测定法，其中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。
9.如段落1-8中任一项所述的测定法，其中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：
胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。
10.如段落1-9中任一项所述的测定法，其中，一种或多种所述引物为双结构域引物。
11.如段落1-10中任一项所述的测定法，其中，来自所述引物组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。
12.如段落1-11中任一项所述的测定法，其中，借助有区别的大小，将来自所述引物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。
13.如段落1-12中任一项所述的测定法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自所述引物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。
14.如段落1-13中任一项所述的测定法，其中，所述引物以约为实施例1的浓度存在于所述反应混合物中。
15.包含一个或多个引物对的组合物，所述引物对选自于由具有如下序列的分子所组成的组：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
16.如段落15所述的组合物，所述组合物包含由具有如下序列的分子所组成的引物对：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；以及SEQIDNO：17和SEQIDNO：18。
17.如段落15所述的组合物，所述组合物包含由具有如下序列的分子所组成的引物对：
SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
18.如段落15-17中任一项所述的组合物，其中，所述引物对特异性地杂交至靶多核苷酸。
19.如段落15-18中任一项所述的组合物，其中，各引物对的至少一个成员为荧光标记的。
20.包含荧光标记的扩增产物的组合物，所述荧光标记的扩增产物由利用一个或多个引物对对靶多核苷酸进行扩增而获得，所述一个或多个引物对选自于由具有如下序列的分子所组成的组：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
21.如段落15-20中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含选自于由如下组分所组成的组中的反应混合物组分：
缓冲液、dNTP以及DNA聚合酶。
22.如段落15-21中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含由FFPE肿瘤样本制备的核酸样本。
23.如段落15-22中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：
胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。
24.如段落15-23中任一项所述的组合物，其中，所述引物以约为实施例1的浓度存在。
实施例
实施例1
本文描述了对NRAS/BRAF点突变分析组(pointmutationanalysispanel)的开发，该分析组为能够例如在ICEPlexTM系统或类似系统上在单个反应中使用核酸样本对12种临床最重要的NRAS突变以及其它4种BRAF突变进行检测的多重PCR测定法。
RAS基因为在人类癌症中频繁突变的原癌基因，由三种遍在表达的基因HRAS、KRAS和NRAS编码。这些RAS基因具有GTP/GDP结合活性和GTPase活性，它们的蛋白可参与对细胞生长的控制。RAS蛋白表现出异构体(isoform)特异性功能；并且在NRAS中，改变第12、13或61位氨基酸残基的基因突变活化了所编码的蛋白使培养的细胞转化的潜能，其与多种人类肿瘤(特别是皮肤、血液和淋巴组织的癌症)相关。
设计NRAS/BRAF点突变分析组检测引物，随后经由计算机模拟(insilico)对引物-引物相互作用进行分析。使用ThermoBlastTM程序、野生型细胞系gDNA和合成的DNA模板确定交叉反应性。在ICEPlexTM系统上对反应条件进行优化。
该单反应NRAS/BRAF点突变分析组靶向NRAS和BRAF基因的16种临床最重要的突变。该测定法包含参照基因对照(RGC)以及标定对照(calibrationcontrols，C1-3)，所述参照基因对照用作DNA片段化对照并用于计算ΔCt，以确定突变状态；所述标定对照用于确定PCR扩增子的大小。本文展示了NRAS/BRAFSNP组对于指定靶标而言具有特异性。
该NRAS/BRAF点突变分析组在单孔反应中检测突变状态。本文所述的方法和测定法允许例如对癌症中的基因组突变进行检测。
在本文所述方面的一些实施方式中，本文所述的方法和测定法可在ICEPlexTM系统上实施。ICEPlexTM系统为全自动的实时PCR平台，它组合了扩增模块(热循环仪)和检测模块(毛细管电泳盒、具有的最大激发处于488nm和639nm的两个固态激光器以及带有CCD相机的分光光度计)。ICEPlexTM系统生成荧光标记的PCR产物(扩增子)，基于其大小的不同借助毛细管凝胶电泳(CE)将所述扩增子分开。借助ICEPlexTM系统的软件(该软件将荧光信号转换为扩增曲线，并计算全部PCR靶标的循环阈值(Ct))对荧光扩增子的量进行实时监控。PCR与CE的组合允许同时对多达例如48个独立反应的多重靶标进行检测和定量。
引物设计：
基于可由NCBI获得的NRAS基因序列和BRAF基因序列设计引物。使用PrimerBlastTM(NCBI)经由计算机模拟(insilico)对引物进行测试。将标签序列添加至突变引物，使得标签不会与靶序列具有同源性，且与密切相关的引物具有少于6个核苷酸的同源性。使用GeneiousProTM软件的Cross-HybTM插件以多重方式对引物的引物-引物相互作用进行测试。对引物进行合成。
表1：设计用于生成不同大小的扩增子的引物列表
扩增条件：在1×多重PCR缓冲液(0.3μM各引物、0.25×ICEPlexTM标定物(calibrator)1、1UAptaTaqΔexoDNA聚合酶)中实施PCR反应。总反应体积为25μL，在ICEPlexTM系统上进行反应。PCR扩增条件如下：
96℃6分钟，2个循环的54℃45秒、72℃45秒以及96℃20秒；16个循环的64℃45秒、72℃45秒以及98℃5秒；28个循环的64℃45秒、72℃220秒以及96℃10秒。
表2：由表1的引物所检测的改变
ICEPlexNRAS/BRAF组检测：
该测定法能够同时对4种BRAF靶标和12种NRAS靶标进行检测和区分(图1)。使用两种不同的染料(FAM和TYE)。使用标定对照对该测定法中靶标的大小进行确定。
开发了允许内部DNA片段化对照的参照基因对照。这些对照允许对DNA起始物质的质量(quality)进行确定，并对ΔCt进行计算。三个引物对扩增NRAS基因上的参照基因对照。在TYE通道中检测3个靶标(TYE-RGC1、TYE-RGC2和TYE-RGC3)，在FAM通道中检测2个靶标(FAM-RGC1和FAM-RGC2)(图2)。可在利用表1的引物的单个多重反应中包含参照基因对照。
表3：交叉反应性研究获得的NRAS/BRAF点突变分析组。展示了
高度的特异性，仅两个靶标观察到交叉反应性。
本文描述了开发用于对NRAS和BRAF癌基因生物标志物的点突变进行检测的NRAS/BRAF点突变分析组。该高度多重性的NRAS/BRAF点突变分析组不仅检测全部的NRAS/BRAF突变靶标，还检测用于DNA片段化和ΔCt计算的参照基因对照以及用于确定大小的标定对照。本文所述研究的结果展示了该NRAS/BRAF点突变分析组在高度多重性的单管形式中对于辨别靶向的全部NRAS/BRAF突变具有高度特异性。
实施例2
表4：与实施例1所述的条件(包括表1中示出的BRAF引物)兼容的另一NRAS引物组
表4的引物与cDNA模板和基因组DNA均兼容。

Claims (24)

1.一种用于对NRAS和/或BRAF的突变进行检测的测定法，所述测定法包括：
将核酸样本的部分与引物组相接触，
其中，所述引物组包含引物对亚组，其中，各引物对扩增包含序列变异的NRAS或BRAF序列；
对包含所述样本的所述部分和一个或多个所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；
检测各引物对的扩增子存在或不存在；
其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异；以及
其中，所述引物中的一个或多个选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：39所组成的组。
2.如权利要求1所述的测定法，其中，所述引物对选自于由如下引物对所组成的组：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
3.如权利要求1或2所述的测定法，其中，一个或多个所述序列变异为点突变。
4.如权利要求1-3中任一项所述的测定法，其中，NRAS点突变选自于由如下点突变所组成的组：
G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2。
5.如权利要求1-4中任一项所述的测定法，其中，BRAF点突变选自于由如下点突变所组成的组：
V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA。
6.如权利要求1-5中任一项所述的测定法，其中，对存在或不存在G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2进行检测。
7.如权利要求1-6中任一项所述的测定法，其中，对存在或不存在V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA进行检测。
8.如权利要求1-7中任一项所述的测定法，其中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。
9.如权利要求1-8中任一项所述的测定法，其中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：
胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。
10.如权利要求1-9中任一项所述的测定法，其中，一种或多种所述引物为双结构域引物。
11.如权利要求1-10中任一项所述的测定法，其中，来自所述引物组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的测定法，其中，借助有区别的大小，将来自所述引物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。
13.如权利要求1-12中任一项所述的测定法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自所述引物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。
14.如权利要求1-13中任一项所述的测定法，其中，所述引物以约为实施例1的浓度存在于所述反应混合物中。
15.包含一个或多个引物对的组合物，所述引物对选自于由具有如下序列的分子所组成的组：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
16.如权利要求15所述的组合物，所述组合物包含由具有如下序列的分子所组成的引物对：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；以及SEQIDNO：17和SEQIDNO：18。
17.如权利要求15所述的组合物，所述组合物包含由具有如下序列的分子所组成的引物对：
SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
18.如权利要求15-17中任一项所述的组合物，其中，所述引物对特异性地杂交至靶多核苷酸。
19.如权利要求15-18中任一项所述的组合物，其中，各引物对的至少一个成员为荧光标记的。
20.包含荧光标记的扩增产物的组合物，所述荧光标记的扩增产物由利用一个或多个引物对对靶多核苷酸进行扩增而获得，所述一个或多个引物对选自于由具有如下序列的分子所组成的组：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
21.如权利要求15-20中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含选自于由如下组分所组成的组中的反应混合物组分：
缓冲液、dNTP以及DNA聚合酶。
22.如权利要求15-21中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含由FFPE肿瘤样本制备的核酸样本。
23.如权利要求15-22中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：
胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。
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