ES2564674T3 - Nuevas mutaciones complejas en el dominio quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico - Google Patents

Nuevas mutaciones complejas en el dominio quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico Download PDF

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Abstract

Utilización de un oligonucleótido específico de mutación para la detección de una o más mutaciones en el gen del factor de crecimiento humano (RFCE) humano, hibridando específicamente dicho oligonucleótido con una mutación seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA y 2264 C>A en SEC ID nº 1.

Description

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DESCRIPCION
Nuevas mutaciones complejas en el dominio quinasa del receptor del factor de crecimiento epidermico CAMPO DE LA INVENCION
La invencion se refiere al diagnostico del cancer y a pruebas diagnosticas para las terapia del cancer. En particular, la invencion se refiere a la deteccion de mutaciones que resultan utiles para el diagnostico y el pronostico, asf como para la prediccion de la eficacia del tratamiento del cancer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El receptor del factor de crecimiento epidermico (RFCE), tambien conocido como HER1 o ErbBI, es un miembro de la familia de la tirosina quinasa de tipo I de receptores de factor de crecimiento. Estas protemas unidas a membrana presentan un dominio tirosina quinasa intracelular que interactua con diversas rutas de senalizacion. Tras la union de ligando, los receptores en dicha familia experimentan dimerizacion y posteriormente autofosforilacion del dominio tirosina quinasa. La autofosforilacion desencadena una cascada de sucesos en las rutas de senalizacion intracelular, incluyendo las rutas Ras/MAPK, PI3K y AKT. A traves de estas rutas las protemas de la familia de HER regulan la proliferacion, diferenciacion y supervivencia celulares.
Vario tumores malignos humanos se asocian a la expresion o funcion aberrante del RFCE (Mendelsohn et al., The EGF receptor family as targets for cancer therapy, Oncogene 19:6550-6565, 2000). En particular, se ha demostrado que algunos canceres incluyen mutaciones en el dominio quinasa del RFCE (exones 18 a 21). En el cancer de pulmon de celulas no pequenas (CPCNP), se ha demostrado que dichas mutaciones inducen rutas antiapoptoticas en las celulas malignas (Pao et al., EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib", P.N.A.S. 101 (36):13306-13311, 2004; Sordella et al., Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways, Science 305(5687):1163-1167, 2004).
Se han desarrollado terapias con diana en el RFCE. Por ejemplo, el cetuximab (ERBITUX™) y el panitumumab
__ __ yfyl __ __ __ __ __ __ __ yM __ __ yM
(VECTIBIX ) son anticuerpos anti-RFCE. El erlotinib (TARCEVA ) y el gefitinib (IRESSA ) son quinazolinas que resultan utiles como inhibidores selectivos oralmente activos de la RFCE tirosina quinasa. Dichos farmacos resultan maximamente efectivos en pacientes con canceres controlados por la actividad aberrante del RFCE. Un estudio a gran escala aleatorizado de doble ciego de IRESSA™ (estudio IRESSA Pan-Asia Study (IPASS)) ha comparado el gefitinib con la quimioterapia tradicional como tratamiento de primera lmea en el cancer de pulmon de celulas no pequenas (CPCNP) (Mok et al., Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma, N. Eng. J. Med. 361:947-957, 2009). El IPASS ha estudiado 1.217 pacientes con histologfa confirmada de adenocarcinoma. El estudio ha revelado que la supervivencia sin progresion (SSP) era significativamente mayor para IRESSA™ que para la quimioterapia en pacientes con tumores positivos para mutacion de RFCE. Lo contrario es cierto para los tumores en los que no se encontraba mutado el RFCE: la SSP era significativamente mayor para la quimioterapia que para IRESSA™. El estudio demostro que para mejorar la probabilidad de tratamiento con exito de un paciente de cancer de pulmon, debe conocerse la condicion de mutacion del RFCE.
El analisis del resultado clmico revela que los pacientes con tumores que portan mutaciones en el dominio quinasa del RFCE (exones 18 a 21) presentan una mejor respuesta al erlotinib que los tumores que expresan RFCE de tipo salvaje (patentes US n° 7.294.468 y n° 7.960.118). Estas mutaciones son predictivas de la respuesta a inhibidores de tirosina quinasa (ITQ) tales como las quinazolinas erlotinib (TARCeVa™) y gefitinib (IRESSA™). Entre las mutaciones del RFCE, la delecion de los aminoacidos 746 a 750 resulta especialmente comun en los pacientes de cancer de pulmon (ver la patente US n° 7.294.468 y Kosaka et al., Mutations of the epidermal growth factor receptor gene in lung cancer, biological and clinical implications", Cancer Res. 64:8919-23, 2004). Kosaka et al. documentan un estudio con 277 pacientes de cancer de pulmon japoneses. El estudio japones revelo que se produdan mutaciones del RFCE en el 40% de los adenocarcinomas de pulmon. Aproximadamente la mitad de las mutaciones (20% de los pacientes) eran deleciones en torno a los aminoacidos 746 a 750 (nucleotidos 2238 a 2250).
El documento n° US2006/0147959 da a conocer el diagnostico de cancer basado en mutaciones de RFCE, en el que algunas mutaciones confieren sensibilidad a los inhibidores de tirosina quinasa. Dicho documento no da a conocer las mutaciones de la presente invencion.
Algunas mutaciones en el dominio de RFCE quinasa son comunes, mientras que otras se producen con menor frecuencia. Sin embargo, resulta esencial que un ensayo clmico de mutaciones de RFCE presente como diana el maximo numero posible de mutaciones. Lo anterior garantizara que los pacientes con mutaciones raras no presenten un resultado de ensayo "falso negativo". En el caso de que se omita la deteccion de una mutacion rara, el paciente portador de dicha mutacion no recibira un tratamiento que potencialmente podna salvar su vida. Por lo tanto, al descubrir una nueva mutacion en el dominio de RFCE quinasa, la deteccion de dicha mutacion presenta el potencial de afectar al resultado clmico en algunos pacientes.
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DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION La invencion se define en las reivindicaciones 1 a 9.
La exposicion comprende ademas un metodo para detectar una mutacion el gen del receptor del factor de crecimiento epidermico (RFCE) en una muestra de un ser humano, que comprende: poner en contacto el acido nucleico en la muestra con un oligonucleotido capaz de hibridarse selectivamente con un acido nucleico diana que contiene una mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1; incubar la muestra bajo condiciones que permitan la hibridacion selectiva del oligonucleotido con el acido nucleico diana, y detectar la hibridacion.
Se da a conocer ademas un metodo de tratamiento de un paciente que presenta un tumor que posiblemente incluye celulas con una mutacion en el gen del receptor del factor de crecimiento epidermico (RFCE), que comprende solicitar que la muestra del paciente se someta a ensayo para la presencia del gen de RFCE mutado, caracterizado por una mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, y en el caso de que se informe de la presencia de alguna de las mutaciones, la administracion en el paciente de un compuesto que inhibe la senalizacion de la protema RFCE mutante codificada por el gen mutado. La exposicion incluye un compuesto que inhibe la senalizacion de la protema RFCE mutante codificada por el gen mutado para la utilizacion en el tratamiento de una enfermedad relacionada o causada por un tumor que posiblemente incluye celulas con una mutacion en el gen del receptor del factor de crecimiento epidermico (RFCE), que comprende solicitar que la muestra del paciente se someta a ensayo para la presencia del gen de RFCE mutado, caracterizado or una mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, y en el caso de que alguna de las mutaciones se informe como presente.
Se da a conocer un kit para detectar mutaciones en el gen de RFCE humano, incluyendo cualquier mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CgCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, comprendiendo el kit uno o mas oligonucleotidos seleccionados de entre SEC ID n° 11 y n° 40.
La exposicion incluye una mezcla de reaccion para detectar mutaciones en el gen de RFCE humano, incluyendo cualquier mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, comprendiendo la mezcla de reaccion uno o mas oligonucleotidos seleccionados de entre SEC ID n° 11 y n° 40.
Se da a conocer ademas la utilizacion de oligonucleotidos seleccionados de entre SEC ID n° 11 y n° 40 para detectar mutaciones en el gen de RFCE humano seleccionadas de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1. La exposicion incluye la utilizacion de la deteccion de las mutaciones en el gen de RFCE humano seleccionadas de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, en el diagnostico o el pronostico del cancer. Una variacion adicional es la utilizacion de la deteccion de las mutaciones en el gen de RFCE humano seleccionadas de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, en el diseno del tratamiento de un paciente de cancer o en la prediccion de la respuesta del paciente de cancer al tratamiento.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 (1A-1C) muestra la SEC ID n° 1, la secuencia de ADNc del RFCE de tipo salvaje.
La FIG. 2 muestra la SEC ID n° 2, la secuencia de aminoacidos del RFCE de tipo salvaje.
La FIG. 3 muestra la SEC ID n° 3, la secuencia de tipo salvaje de los nucleotidos 2221 a 2260 del gen RFCE, y la SEC ID n°
4, la mutacion 2236_2248>ACCC.
La FIG. 4 muestra la SEC ID n° 3, la secuencia de tipo salvaje de los nucleotidos 2221 a 2260 del gen RFCE, y la SEC ID n°
5, la mutacion 2237_2244>CGCCC.
La FIG. 5 muestra la SEC ID n° 6, la secuencia de tipo salvaje de los nucleotidos 2221 a 2280 del gen RFCE, y la SEC ID n°
7, la mutacion 2252_2277>AC.
La FIG. 6 muestra la SEC ID n° 6, la secuencia de tipo salvaje de los nucleotidos 2221 a 2280 del gen RFCE, y la SEC ID n°
8, la mutacion 2240_2264>CGAAAGA.
La FIG. 7 muestra la SEC ID n° 3, la secuencia de tipo salvaje de los nucleotidos 2221 a 2260 del gen RFCE, y la SEC ID n°
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9, la mutacion 2239_2240 TT>CC.
La FIG. 8 muestra la SEC ID n° 6, la secuencia de tipo salvaje de los nucleotidos 2221 a 2280 del gen RFCE, y la SEC ID n°
10, la mutacion 2264 C>A.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones
Con el fin de facilitar la comprension de la presente exposicion, se proporcionan las definiciones siguientes de los terminos utilizados en la presente memoria.
El termino "n_m" o "n-m del" se refiere a una mutacion que resulta en un acido nucleico que no presenta los nucleotidos entre las posiciones "n" y "m". El termino "n_m>XYZ" se refiere a una mutacion compleja en la que el acido nucleico no presenta los nucleotidos entre las posiciones "n" y "m" sino que la secuencia de nucleotidos XYZ esta insertada en su lugar. Por ejemplo, el termino "2236_2248>ACCC" se refiere a una mutacion que resulta en un acido nucleico que no presenta los nucleotidos 2236 a 2248 sino que la secuencia de nucleotidos ACCC se encuentra insertada en el lugar de los nucleotidos delecionados.
El termino "nX>Y" se refiere a una mutacion que resulta en una sustitucion del nucleotido X en la posicion "n" por el nucleotido Y. Por ejemplo, el termino "2264C>A" se refiere a una mutacion que resulta en una sustitucion de una citosina en la posicion 2264 por una adenina. De manera similar, el termino "2239_2240TT>CC" se refiere a una mutacion que resulta en una sustitucion de dos timinas en las posiciones 2239 y 2240 por dos citosinas.
La expresion "cebador espedfico de alelo" o "cebador EA" se refiere a un cebador que se hibrida con mas de una variante de la secuencia diana pero que es capaz de discriminar entre las variantes de la secuencia diana en el aspecto de que unicamente con una de las variantes, el cebador es extendido eficientemente por el acido nucleico polimerasa bajo condiciones adecuadas. Con otras variantes de la secuencia diana, la extension resulta menos eficiente, ineficiente o indetectable.
La expresion "cebador comun" se refiere al segundo cebador en la pareja de cebadores que incluye un cebador espedfico de alelo. El cebador comun no es espedfico de alelo, es decir, no discrimina entre las variantes de la secuencia diana entre las que discrimina el cebador espedfico de alelo.
Los terminos "complementario" o "complementariedad" se utilizan en referencia a cadenas antiparalelas de polinucleotidos relacionados con las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick. Las expresiones "perfectamente complementarias" o "100% complementarias" se refieren a secuencias complementarias que presentan apareamiento de Watson-Crick en todas las bases entre las cadenas antiparalelas, es decir, no hay desapareamientos entre cualesquiera dos bases en el duplex polinucleotido. Sin embargo, los duplex se forman entre cadenas antiparalelas incluso en ausencia de complementariedad perfecta. Las expresiones "parcialmente complementarias" o "incompletamente complementarias" se refieren a cualquier alineacion de bases entre cadenas polinucleotidas antiparalelas que es menos de 100% perfecta (por ejemplo existe por lo menos un desapareamiento o base no correspondiente en el duplex polinucleotido). Los duplex entre cadenas parcialmente complementarias generalmente son menos estables que los duplex entre cadenas perfectamente complementarias.
El termino "muestra" se refiere a cualquier composicion que contiene o que se presume que contiene acidos nucleicos. Lo anterior incluye una muestra de tejido o lfquido aislada de un individuo, por ejemplo piel, plasma, suero, lfquido espinal, lfquido linfatico, lfquido sinovial, orina, lagrimas, celulas sangumeas, organos y tumores, y tambien muestras de cultivos in vivo establecidos a partir de celulas obtenidas de un individuo, incluyendo los tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPET) y acidos nucleicos aislados a partir de los mismos.
Los terminos "polinucleotido" y "oligonucleotido" se utilizan intercambiablemente. El termino "oligonucleotido" se utiliza en ocasiones para referirse a un polinucleotido mas corto. Un oligonucleotido puede comprender por lo menos 6 nucleotidos, por ejemplo por lo menos aproximadamente 10 a 12 nucleotidos, o por lo menos aproximadamente 15 a 30 nucleotidos correspondiente a una region de la secuencia de nucleotidos designada.
La expresion "secuencia primaria" se refiere a la secuencia de nucleotidos en un polinucleotido u oligonucleotido. Las modificaciones de nucleotidos, tales como las modificaciones de las bases nitrogenadas, las modificaciones de azucares u otras modificaciones del esqueleto no son una parte de la secuencia primaria. Los marcajes, tales como cromoforos conjugados con los oligonucleotidos, tampoco son una parte de la secuencia primaria. De esta manera, dos oligonucleotidos pueden compartir la misma secuencia primaria pero diferir con respecto a las modificaciones y etiquetas.
El termino "cebador" se refiere a un oligonucleotido que se hibrida con una secuencia en el acido nucleico diana y que es capaz de actuar como punto de inicio de la smtesis a lo largo de una cadena complementaria del acido nucleico bajo condiciones adecuadas para dicha smtesis. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "sonda" se refiere a un oligonucleotido que se hibrida con una secuencia en el acido nucleico diana y habitualmente
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se encuentra marcada detectablemente. La sonda puede presentar modificaciones, tales como una modificacion 3'- terminal que provoca que la sonda sea no extensible por las acido nucleico polimerasas y uno o mas cromoforos. Un oligonucleotido con la misma secuencia puede servir como cebador en un ensayo y una sonda en un ensayo diferente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "secuencia diana", "acido nucleico diana" o "diana" se refiere a una parte de la secuencia de acidos nucleicos que debe amplificarse, detectarse o ambas.
Los terminos "hibridado" e "hibridacion" se refieren a la interaccion de apareamiento de bases entre dos acidos nucleicos que resulta en la formacion de un duplex. No es un requisito que dos acidos nucleicos presenten una complementariedad de 100% a lo largo de su longitud completa para conseguir la hibridacion. Las expresiones "hibridacion selectiva" e "hibridacion espedfica" se refieren a la hibridacion de un acido nucleico predominantemente (50% o mas de la molecula hibridante) o practicamente de manera exclusiva (90% o mas de la molecula hibridante) con un acido nucleico particular presente en una mezcla compleja en la que tambien se encuentran presentes otros acidos nucleicos. Por ejemplo, bajo condiciones de PCR tfpicas, los cebadores se hibridan espedficamente con los acidos nucleicos diana con exclusion de los acidos nucleicos no diana tambien presentes en la solucion. Los cebadores hibridados espedficamente controlan la amplificacion del acido nucleico diana, produciendo un producto de amplificacion del acido nucleico diana que es por lo menos el producto de amplificacion predominante y preferentemente el producto de amplificacion practicamente exclusivo (por ejemplo que representa 90% o mas de todos los productos de amplificacion en la muestra). Preferentemente el producto de amplificacion no espedfico se encuentra presente en cantidades tan pequenas que es no detectable o que se detecta en cantidades tan pequenas que resulta facilmente distinguible del producto de amplificacion espedfico. De manera similar, las sondas se hibridan espedficamente con los acidos nucleicos diana con exclusion de los acidos nucleicos no diana tambien presentes en la mezcla de reaccion. Los cebadores hibridados espedficamente permiten la deteccion espedfica del acido nucleico diana, generando una senal detectable que es por lo menos la senal predominante y preferentemente la senal de amplificacion practicamente exclusiva (por ejemplo que representa 90% o mas de todos los productos de amplificacion en la muestra).
La presente exposicion describe una nueva mutacion en el dominio quinasa de RFCE que resulta util para el diagnostico y el pronostico del cancer, permitiendo el diseno de un regimen de terapia y que predice el exito de la terapia.
La numeracion de los nucleotidos utilizada en la presente memoria hace referencia a la SEC ID n° 1, mostrada en la figura 1. En la SEC ID n° 1, la parte de la secuencia entre los nucleotidos 2221 y 2280, que comprende las seis mutaciones indicadas en la presente memoria, se encuentra resaltada y subrayada.
La numeracion de los aminoacidos utilizada en la presente memoria hace referencia a la SEC ID n° 2, mostrada en la figura 2. En la SEC ID n° 2, la secuencia de senal incluye los aminoacidos 1 a 24, el dominio extracelular incluye los aminoacidos 24 a 645, el dominio transmembranal incluye los aminoacidos 646 a 668 y el dominio citoplasmatico incluye los aminoacidos 669 a 1210, de entre los que el dominio de tirosina quinasa esta constituido por los aminoacidos 718 a 964, y el sitio de fosforilacion de la treonina es el aminoacido 678.
El presente estudio ha identificado seis mutaciones en el exon 19 (parte del dominio quinasa) del gen de la RFCE humana. Las mutaciones se ilustran en las figuras 3 a 8. En las figuras, se ha subrayado la secuencia delecionada del gen de tipo salvaje. La secuencia insertada en el gen mutante en lugar de la delecion se muestra en italica y negrita. Las mutaciones tambien se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1: nuevas mutaciones y secuencias de tipo salvaje en el exon 19 del gen de RFCE humano
SEC ID n°
SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS
3
WT 2221-2260 CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGA
4
Mut 2236 2248>ACCC CCCGTCGCTATCAAGACCCCAACATCTCCGA
5
Mut 2237_2244>CGCCC CCCGTCGCTATCAAGGCGCCCGAAGCAACATCTCCGA
6
WT 2221-2280 CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACA AGGAAATCCTC
7
Mut 2252 2277>AC CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAACCTC
8
Mut 2240- 2264>CGAAAGA CCCGTCGCTATCAAGGAATCGAAAGACAAGGAAATCCTC
9
Mut 2239 2240 TT>CC CCCGTCGCTATCAAGGAACCAAGAGAAGCAACATCTCCGA
10
Mut 2264 C>A CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG A CAACA AGGAAATCCTC
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La primera mutacion 2236_2248>ACCC se muestra en la figura 3. La figura 3 muestra el fragmento de la secuencia de nucleotidos de la RFCE de tipo salvaje (SEC ID n° 3) y el fragmento correspondiente codificante de la mutacion 2236_2248>AC-CC (SEC ID n° 4).
La segunda mutacion 2237_2244>CGCCC se muestra en la figura 4. La figura 4 muestra el fragmento de la secuencia de nucleotidos de la RFCE de tipo salvaje (SEC ID n° 3) y el fragmento correspondiente codificante de la mutacion 2237_2244>CGCCC (SEC ID n° 5).
La tercera mutacion 2252_2277>AC se muestra en la figura 5. La figura 5 muestra el fragmento de la secuencia de nucleotidos de la RFCE de tipo salvaje (SEC ID n° 6) y el fragmento correspondiente codificante de la mutacion 2252_2277>AC (SEC ID n° 7).
La cuarta mutacion 2240_2264>CGAAAGA se muestra en la figura 6. La figura 6 muestra el fragmento de la secuencia de nucleotidos de la RFCE de tipo salvaje (SEC ID n° 6) y el fragmento correspondiente codificante de la mutacion 2240_2264>CGAAAGA (SEC ID n° 8). La quinta mutacion 2239_2240 TT>CC se muestra en la figura 7. La figura 7 muestra el fragmento de la secuencia de nucleotidos de la RFCE de tipo salvaje (SEC ID n° 3) y el fragmento correspondiente codificante de la mutacion 2239_2240 TT>CC (SEC ID n° 9).
La sexta mutacion 2264 C>A se muestra en la figura 8. La figura 8 muestra el fragmento de la secuencia de nucleotidos de la RFCE de tipo salvaje (SEC ID n° 6) y el fragmento correspondiente codificante de la mutacion 2264 C>A (SEC ID n° 10).
En una realizacion, la presente exposicion comprende oligonucleotidos para detectar mutaciones en el exon 19 de RFCE seleccionadas de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1. En una realizacion, la exposicion comprende oligonucleotidos (SEC ID n° 11 a n° 40) para detectar las mutaciones anteriormente indicadas mediante PCR espedfica de alelo (Tabla 2) (la PCR espedfica de alelo ha sido descrita en la patente US n° 6.627.402). Tal como se indica en la Tabla 2, los oligonucleotidos SEC ID n° 12 a 14, 17 a 20, 23 a 25, 28 a 30, 33 a 35, 37 y 38 son selectivos, es decir cebadores espedficos de alelo. Algunos de dichos cebadores espedficos de alelos contienen desapareamientos internos con la secuencia diana tanto de tipo salvaje como mutante. Se ha demostrado que algunos desapareamientos adicionales en los cebadores de PCR espedfica de alelo incrementan la selectividad de los cebadores; ver la publicacion de patente US n° 2010/0099110. Otros oligonucleotidos en la Tabla 2, SEC ID n° 11, 15, 16, 21, 26, 27, 31, 32 y 36 no son selectivos, es decir no son espedficos de alelo. Estos oligonucleotidos dirigen la amplificacion del molde tanto mutante como de tipo salvaje. Dichos cebadores selectivos y no selectivos de la presente invencion se denominan arbitrariamente cebadores "directos". Para la amplificacion exponencial, dichos cebadores pueden aparearse con un segundo cebador "inverso" que no es espedfico de alelo, por ejemplo SEC ID n° 40. Para la deteccion basada en sondas, puede utilizarse una sonda, por ejemplo la SEC ID n° 39. El experto en la materia entendera que las SEC ID n° 39 y n° 40 son ejemplos no limitativos. Tambien puede utilizarse un cebador inverso diferente y una sonda diferente con un cebador directo seleccionado de entre las SEC ID n° 11 a n° 40.
Tabla 2
Oligonucleotidos para detectar nuevas mutaciones en el exon 19 de RFCE
Descripcion
SEC ID n° Secuencia 5'-3'
Mutacion 2240 2264>CGAAAGA
Cebador directo comun
11 AATTCCCGTCGCTATCAAGGAA
Cebador directo selectivo
12 TTCCCGTCGCTATCAAGGAATC
Cebador directo selectivo
13 CCGTCGCTATCAAGGAATCGAA
Cebador directo selectivo
14 GTCGCTATCAAGGAATCGAAAGACAA
Cebador directo comun
15 CAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGT
Mutacion 2252 2277>AC
Cebador directo comun
16 GTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCA
Cebador directo selectivo
17 GTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAA
Cebador directo selectivo
18 CGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAAC
Cebador directo selectivo
19 CTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAACCT
Cebador directo selectivo
20 CTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAACCTC
Cebador directo comun
21 TCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCT
Mutacion 2236 2248>ACCC
Cebador directo comun
22 AAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA
Mutacion 2236 2248>ACCC
Cebador directo selectivo
23 AGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGA
Cebador directo selectivo
24 GTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGAC
Cebador directo selectivo
25 CCGTCGCTATCAAGACCCCA
Cebador directo comun
26 CAACATCTCCGAAAGCCAACAA
Mutacion 2237 2244>CGCCC
5
10
15
20
25
30
35
Cebador directo comun
27 AAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA
Cebador directo selectivo
28 AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGC
Cebador directo selectivo
29 CCGTCGCTATCAAGGCGC
Cebador directo selectivo
30 CGCTATCAAGGCGCCCGA
Cebador directo comun
31 GAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGA
Mutacion 2264C>A
Cebador directo comun
32 GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA
Cebador directo selectivo
33 ATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGA
Cebador directo selectivo
34 ATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAFGA
Cebador directo selectivo
35 ATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAFGAC
Mutacion 2239 2240TT>CC
Cebador directo comun
36 TTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGA
Cebador directo selectivo
37 TAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAAC
Cebador directo selectivo
38 AATTCCCGTCGCTATCAAGGAACC
Oligonucleotidos adicionales
Sonda
39 MATGGCTCQTGAACCTCAGGCCCACCTTTP
Cebador inverso
40 AGAGCAGAGCAGCTGCCAGA
Cebador comun = un cebador que amplifica el acido nucleico tanto mutante como de tipo salvaie
Cebador selectivo = un cebador que amplifica unicamente el acido nucleico mutante y no el de
tipo salvaje
E = N4-terc-butil-bencil-dC
F = N6-terc-butil-bencil-dA
M = FAM
Q = BHQ2
P = fosfato
Para la extension con exito de un cebador, el cebador necesita presentar una complementariedad por lo menos parcial con la secuencia diana. Generalmente, la complementariedad en el extremo 3' del cebador resulta mas cntica que la complementariedad en el extremo 5' del cebador (Innis et al., editores, PCR Protocols, Academic Press, capftulo, paginas 9 a 11, 1990).Lo anterior implica que las variaciones del extremo 5', es decir, las adiciones, sustituciones o eliminacion de nucleotidos en el extremo 5', no afectan al rendimiento de un cebador en un ensayo de PCR. Por lo tanto, la presente exposicion comprende los cebadores dados a conocer en la Tabla 2 asf como las variantes de dichos cebadores con variaciones en el extremo 5'. De manera similar, para la hibridacion con exito de una sonda, esta necesita presentar una complementariedad por lo menos parcial con la secuencia diana. Generalmente la complementariedad proxima a la parte central de la sonda resulta mas cntica que la complementariedad en los extremos de la sonda (Innis et al., capftulo 32, paginas 262-267). Lo anterior implica que las variaciones de los extremos de la sonda, es decir, las adiciones, sustituciones o eliminacion de nucleotidos de unos cuantos nucleotidos no afectan al rendimiento de la sonda durante la hibridacion. Por lo tanto, la presente exposicion comprende la sonda dada a conocer en la Tabla 2 asf como las variantes de dichos sondas con variaciones terminales.
En otras variaciones de dicha realizacion, la sonda presenta una estructura particular, incluyendo un acido protema- nucleico (APN), un acido nucleico bloqueado (ANB), una sonda baliza molecular (Tyagi et al., Nat. Biotechnol. 3:303308, 1996) o cebadores con sonda incorporada SCORPIONS® (Whitcome et al., Nat. Biotechnol. 8:804-807, 1999). Una sonda puede marcarse con un marcaje radioactivo, fluorescente o cromoforo. Por ejemplo, las mutaciones pueden detectarse mediante reaccion en cadena de la polimerasa espedfica de alelo en tiempo real, en la que la hibridacion de una sonda con el producto de amplificacion resulta en la digestion enzimatica de la sonda y la deteccion de los productos de digestion (sonda TaqMan™, Holland et al., PNAS USA 88:7276-7280, 1991). La hibridacion entre la sonda y la diana tambien puede detectarse mediante la deteccion del cambio de la fluorescencia debido a la formacion de duplex de acidos nucleicos (publicacion de patente US n° 2010/0143901) o mediante la deteccion de la temperatura de fusion caractenstica del tubrido entre sonda y diana (patente US n° 5.871.908).
El gen o producto genico RFCE mutante puede detectarse en tumores o en otras muestras del cuerpo, tales como orina, esputo o suero. Las mismas tecnicas comentadas anteriormente para la deteccion de genes o productos genicos RFCE mutantes en muestras de tumor pueden aplicarse a otras muestras del cuerpo. Por ejemplo, las celulas de cancer pueden desprenderse de tumores y aparecer en dichas muestras corporales. Los metodos de deteccion de acidos nucleicos del estado de la tecnica son capaces de detectar celulas mutantes sobre un fondo de celulas no tumorales en una amplia diversidad de tipos de muestra.
En otra realizacion, la exposicion es un metodo de tratamiento de un paciente que presenta un tumor que posiblemente incluye celulas con un gen de RFCE con mutaciones en el exon 19, seleccionadas de entre el grupo que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, comprendiendo el metodo la solicitud de que el paciente se someta a ensayo para una o mas de las mutaciones anteriormente indicadas en la muestra del paciente, y, en el caso de que se
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detecte la mutacion, se administre en el paciente un inhibidor de tirosina quinasa (ITQ) o un inhibidor de RFCE. Dicha realizacion incluye un inhibidor de tirosina quinasa (ITQ) o un inhibidor de RFCE que inhibe la senalizacion de la protema RFCE mutante codificada por el gen mutado, para la utilizacion en el tratamiento de una enfermedad relacionada o causada por un tumor que posiblemente incluye celulas con una mutacion en el gen del receptor del factor de crecimiento epidermico (RFCE), que comprende solicitar que la muestra del paciente se someta a ensayo para la presencia del gen de RFCE mutado, caracterizado por una mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, y en el caso de que alguna de las mutaciones se informe como presente. En variaciones de dicha realizacion, los inhibidores de tirosina quinasa son inhibidores de la RFCE quinasa tales como, por ejemplo, cetuximab, panitumumab, erlotinib o gefitinib.
En una variacion de dicha realizacion, el metodo comprende ademas investigar la presencia de una o mas de las mutaciones siguientes: G719A, G719C, K745-A750 del K ins, E746V, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, S768I, L858P, L858R, E746R748 del, E746-S752 del V ins, L747-E749 del, L747-A750 del P ins, L747-T751 del, L747- T751 del P ins, L747-P753 del S ins, L747-S752 del, R748-P753 del, T751-I759 del T ins, S752-I759 del, P753-K757 del, D770-N771 del NPG ins, D770-N771 del SVD ins, P772-H773 dup, P772-H773 del V ins, M766-A767 del AI ins, S768-V769 del SVA ins, G779S, P848L, G857V, L858R, L861Q, L883S, D896Y y E746-A750 del AP ins; y en el caso de encontrarse presente una o mas de las mutaciones, se administra en el paciente un compuesto que inhibe la senalizacion de la protema RFCE mutante codificada por el gen mutado. Los cambios de nucleotidos que causan las mutaciones listadas anteriormente y los metodos de deteccion de los mismos se dan a conocer en las patents US n° 7.294.468 y n° 7.960.118 y en la solicitud de patente US n° de ser. 13/280.976, presentada el 25 de octubre de 2011 (mutacion E746-A750 delAP ins). Pueden detectarse multiples mutaciones simultanea o separadamente mediante la utilizacion de hibridacion con multiples sondas, por ejemplo en un formato de transferencia por puntos o de matriz de acidos nucleicos, PCR multiplex, por ejemplo pCr espedfica de alelo multiplex y pCr multiplex seguida de un ensayo de fusion de sonda con cada sonda caracterizada por una temperatura de fusion espedfica de la mutacion. Tambien pueden detectarse multiples mutaciones mediante secuenciacion de alto rendimiento, por ejemplo utilizando un metodo que implica la amplificacion por PCR en emulsion de moleculas individuales adheridas a un soporte solido, la posterior secuenciacion mediante smtesis y analisis bioinformatico de datos de secuencias, tal como el metodo desarrollado por 454 Life Sciences, Inc. (Branford, Conn.).
En otra realizacion, la invencion es un metodo de determinacion de una respuesta alterada de un paciente que presenta un tumor maligno frente a inhibidores de tirosina quinasa (ITQ) o inhibidores de RFCE. El metodo comprende investigar la presencia en la muestra del paciente de una o mas mutaciones en el exon 19 de RFCE seleccionadas de entre el grupo que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, y en caso de hallarse la mutacion, determinar que el tratamiento es probable que tenga exito. En variaciones de dicha realizacion, los inhibidores de tirosina quinasa son inhibidores de la RFCE quinasa o inhibidores de RFCE, por ejemplo cetuximab, panitumumab, erlotinib o gefitinib.
En una variacion de dicha realizacion, el metodo comprende ademas investigar la presencia de una o mas de las mutaciones siguientes: G719A, G719C, K745-A750 del K ins, E746V, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, S7681, L858P, L858R, E746R748 del, E746-S752 del V ins, L747-E749 del, L747-A750 del P ins, L747-T751 del, L747-T751 del P ins, L747-P753 del S ins, L747-S752 del, R748-P753 del, T751-I759 del T ins, S752-I759 del, P753-K757 del, D770-N771 del NPG ins, D770-N771 del SVD ins, P772-H773 dup, P772-H773 del V ins, M766- A767 del AI ins, S768-V769 del SVA ins, G779S, P848L, G857V, L858R, L861Q, L883S, D896Y y E746-A750 del AP ins; y en caso de encontrarse presente una o mas de las mutaciones, determinar que el tratamiento con inhibidores de tirosina quinasa es probable que tenga exito.
En todavfa otra realizacion, la invencion es un kit que contiene los reactivos necesarios para detectar una o mas mutaciones en el exon 19 de RFCE seleccionadas de entre el grupo que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1. El kit puede comprender oligonucleotidos tales como sondas o cebadores de amplificacion espedficos para la secuencia mutada pero para la secuencia de tipo salvaje. Opcionalmente, uno o mas cebadores espedficos de alelo, cebadores comunes y sondas en el kit pueden seleccionarse de la Tabla 2. El kit comprende ademas los reactivos necesarios para realizar el ensayo de amplificacion y deteccion, tales como componentes de la PCR, una PCR en tiempo real, o la amplificacion mediada por la transcripcion (AMT). En algunas realizaciones, el oligonucleotido espedfico de mutacion se encuentra marcado detectablemente. En dichas realizaciones, el kit comprende reactivos para el marcaje y la deteccion del marcaje. Por ejemplo, en el caso de que el oligonucleotido se marque con biotina, el kit puede comprender un reactivo de estreptavidina con un enzima y su sustrato cromogenico. En variaciones de dicha realizacion, el kit incluye ademas reactivos para detectar por lo menos una mutacion mas en el gen RFCE, seleccionada de entre las siguientes: G719A, G719C, K745-A750 del K ins, E746V, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, S7681, L858P, L858R, E746-R748 del, E746-S752 del V ins, L747-E749 del, L747-A750 del P ins, L747-T751 del, L747-T751 del P ins, L747-P753 del S ins, L747-S752 del, R748-P753 del, T751I759 del T ins, S752-I759 del, P753-K757 del, D770-N771 del NPG ins, D770-N771 del SVD ins, P772-H773 dup, P772H773 del V ins, M766-A767 del AI ins, S768-V769 del SVA ins, G779S, P848L, G857V, L858R, L861Q, L883S, D896Y y E746-A750 del AP ins.
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En todavfa otra realizacion, a exposicion es una mezcla de reaccion para detectar mutaciones en el gen de RFCE humano, incluyendo una o mas mutaciones seleccionadas de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, comprendiendo la mezcla de reaccion uno o mas oligonucleotidos seleccionados de entre SEC ID n° 11-40.
Se da a conocer ademas la utilizacion de oligonucleotidos seleccionados de entre SEC ID n° 11 y n° 40 para detectar una o mas mutaciones seleccionadas de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1. Se da a conocer ademas la utilizacion de la deteccion de una o mas mutaciones seleccionadas de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, en el diagnostico o el pronostico del cancer.
Se da a conocer ademas la utilizacion de la deteccion de una o mas mutaciones seleccionadas de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC y 2264 C>A en SEC ID n° 1, en el diseno del tratamiento de un paciente de cancer o en la prediccion de la respuesta del paciente de cancer al tratamiento.
Ejemplo 1
Identificacion de mutaciones en muestras de pacientes de cancer de pulmon
Las muestras de tejido se obtuvieron de pacientes de cancer de pulmon (CPCNP). Las muestras se conservaron como tejido fijado en formalina e incluido en parafina (TFFIP). Se aislaron acidos nucleicos a partir de las muestras y se sometieron a secuenciacion directa en el instrumento Genome Sequencer FLX (454 Life Sciences, Branford, Conn.).
La mutacion 2236_2248>ACCC se detecto en una media de 24,6% del total de 3.550 lecturas de una muestra. La mutacion 2237_2244>CGCCC se detecto en una media de 27,7% del total de 4.205 lecturas de una muestra. La mutacion 2252_2277>AC se detecto en una media de 24,6% del total de 5.368 lecturas de una muestra. La mutacion 2240_2264>CGAAAGA se detecto en una media de 32,2% del total de 3.394 lecturas de una muestra. La mutacion 2239_2240 TT>CC se detecto en una media de 74,3% del total de 3.120 lecturas de una muestra. La mutacion 2264 C>A se detecto en una media de 32,8% del total de 3.394 lecturas de una muestra. Se encontro que solo una fraccion de las lecturas contema una mutacion, reflejando el hecho de que las muestras son mezclas de celulas tumorales y celulas no tumorales.
Ejemplo 2
Deteccion de mutaciones utilizando oligonucleotidos especificos de alelo
En el presente ejemplo, las dianas mutante y de tipo salvaje se representaron mediante plasmidos que conteman las inserciones mutante y de tipo salvaje, respectivamente. Se amplificaron las dianas utilizando cebadores especificos de mutacion o, en reacciones de control, cebadores "comunes" no selectivos.
Cada 15 pl de reaccion conteman 10.000 copias del ADN diana y reactivos de PCR estandar, incluyendo nucleosidos trifosfato, ADN polimerasa, uracil-N-glucosilasa y 0,1 mM de cada uno de los cebadores directo e inverso y 0,05 mM de sonda (todos seleccionados de la Tabla 2). La amplificacion y el analisis se llevaron a cabo utilizando el instrumento LightCycler™ 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, Ind ). Las reacciones se ciclaron utilizando el perfil siguiente: 50°C durante minutos, seguido de 2 ciclos de 95°C durante 10 segundos y 62°C durante 30 segundos, seguido de 55 ciclos de 93°C durante 10 seguidos y 62°C durante 30 segundos.
Los resultados para cada cebador directo se muestran en la Tabla 3. La amplificacion se representa por el valor "ciclos hasta el umbral" o Ct. El valor mas alto de Ct representa una amplificacion menos eficiente, por ejemplo por un cebador desapareado. ACt representa la diferencia entre la amplificacion de la diana de tipo salvaje y la amplificacion de la diana mutante. La presencia de ACt indica que se ha detectado la mutacion y el valor de ACt representa la selectividad del ensayo.
Tabla 3
Deteccion de mutaciones mediante PCR espedfica de alelo
CEBADOR DIR. SEC ID n°
mut Ct * wt Ct ACt
Mutacion 2240 2264>CGAAAGA
11
22,2 22,6 0,4
12
22,3 30,1 7,8
13
22,5 36,7 14,2
14
21,9 33,1 11,3
15
22,5 22,5 0 (control)
Mutacion 2252 2277>AC
16
22,1 22,5 0,4 (control)
17
22,2 22,6 0,4 (control)
18
24,5 39,4 14,9
19
22,3 27,7 5,4
20
22,6 29,5 6,9
21
21,2 22,3 1,1 (control)
Mutacion 2236_2248>ACCC
22
22,8 23,0 0,2 (control)
23
22,6 29,8 7,2
24
22,5 47,4 24,9
25
22,7 NA >32,3
26
22,4 22,4 0 (control)
Mutacion 2237 2244>CGCCC
27
23,1 22,9 -0,2 (control)
28
22,7 28,4 5,6
29
22,6 NA >32,4
30
22,4 NA >32,6
31
22,8 23,0 0,2 (control)
Mutacion 2264C>A
32
23,1 23,0 -0,1 (control)
33
23,5 39,0 15,5
34
24,7 NA >30,3
35
24,8 36,5 11,7
Mutacion 2239 2240 TT>CC
36
22,2 22,8 0,6 (control)
37
22,5 25,3 2,8
38
22,4 38,0 15,5
* cada Ct es una media de dos experimented NA: no amplificado Control - cebador directo comun, no espedfico de alelo
Aunque la invencion se ha descrito en detalle haciendo referencia a ejemplos espedficos, resultara evidente para el experto en la materia que pueden llevarse a cabo diversas modificaciones dentro del alcance de la presente invencion. De esta manera, el alcance de la invencion no debena considerarse limitado a los ejemplos indicados en 5 la presente memoria, sino a las reivindicaciones proporcionadas posteriormente.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Utilizacion de un oligonucleotido espedfico de mutacion para la deteccion de una o mas mutaciones en el gen del factor de crecimiento humano (RFCE) humano, hibridando espedficamente dicho oligonucleotido con una mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA y 2264 C>A en SEC ID n° 1.
  2. 2. Utilizacion del oligonucleotido segun la reivindicacion 1, en la que el oligonucleotido se selecciona de entre SEC ID n° n° 12 a n° -14, n° 17 a n° 20, n° 23 a n° 25, n° 28 a n° 30, y n° 33 a n° 35.
  3. 3. Metodo de deteccion de una mutacion en el gen del receptor del factor de crecimiento epidermico (RFCE) en una muestra de un ser humano, que comprende:
    (a) poner en contacto el acido nucleico en la muestra con un oligonucleotido espedfico de mutacion capaz de hibridarse selectivamente con una mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA y 2264 C>A en SEC ID n° 1,
    (b) incubar la muestra bajo condiciones que permitan la hibridacion selectiva del oligonucleotido con el acido nucleico diana, y
    (c) detectar la hibridacion.
  4. 4. Metodo segun la reivindicacion 3, que comprende ademas despues de la etapa (b), la amplificacion del acido nucleico diana, en el que la hibridacion en la etapa (b) resulta en la extension del oligonucleotido selectivamente hibridable.
  5. 5. Metodo segun la reivindicacion 3 o 4, en el que la deteccion en la etapa (c) tiene lugar durante cada ronda de amplificacion.
  6. 6. Metodo segun la reivindicacion 3 o 4, en el que la deteccion en la etapa (c) tiene lugar despues del ultimo ciclo de amplificacion.
  7. 7. Metodo segun la reivindicacion 3, en el que el oligonucleotido se selecciona de entre SEC ID n° n° 12 a n° -14, n° 17 a n° 20, n° 23 a n° 25, n° 28 a n° 30, y n° 33 a n° 35.
  8. 8. Kit para detectar mutaciones en el gen de RFCE humano, incluyendo cualquier mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA y 2264 C>A en sEc ID n° 1, comprendiendo el kit uno o mas oligonucleotidos seleccionados de entre SEC ID n° 12 a n° 14, n° 17 a n° 20, n° 23 a n° 25, n° 28 a n° 30 y n° 33 a n° 35, y que ademas comprende opcionalmente precursores de acidos nucleicos, polimerasa de acidos nucleicos, y los reactivos y soluciones necesarios para respaldar la actividad de la polimerasa de acidos nucleicos.
  9. 9. Mezcla de reaccion para detectar mutaciones en el gen de RFCE humano, incluyendo cualquier mutacion seleccionada de entre la lista que consiste de 2236_2248>ACCC, 2237_2244>CgCCC, 2252_2277>AC, 2240_2264>CGAAAGA y 2264 C>A en SEC ID n° 1, comprendiendo la mezcla de reaccion uno o mas oligonucleotidos seleccionados de entre SEC ID n° 12 a n° 14, n° 17 a n° 20, n° 23 a n° 25, n° 28 a n° 30 y n° 33 a n° 35, y que ademas comprende opcionalmente precursores de acidos nucleicos, polimerasa de acidos nucleicos, y los reactivos y soluciones necesarios para respaldar la actividad de la polimerasa de acidos nucleicos.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140341884A1 (en) * 2012-12-04 2014-11-20 Roche Molecular Systems, Inc. Novel Complex Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Kinase Domain
CN106795567B (zh) 2014-10-09 2021-07-30 豪夫迈·罗氏有限公司 在表皮生长因子受体激酶结构域中的突变
CN111235272B (zh) * 2020-01-10 2023-07-07 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
DE4234086A1 (de) 1992-02-05 1993-08-12 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsaeuresequenzen
US5981176A (en) 1992-06-17 1999-11-09 City Of Hope Method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
EP1733056B1 (en) * 2004-03-31 2013-05-22 The General Hospital Corporation Method to determine responsiveness of cancer to epidermal growth factor receptor targeting treatments
ES2677562T3 (es) 2004-05-27 2018-08-03 The Regents Of The University Of Colorado Métodos para la predicción del resultado clínico para inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico para pacientes de cáncer
WO2005118876A2 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Genentech, Inc. Egfr mutations
CA2611005A1 (en) 2005-06-13 2006-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Impdh2 snp associated with acute rejection
CN1749417A (zh) 2005-07-27 2006-03-22 上海奇诺肿瘤生物高新技术有限公司 上皮生长因子受体外显子19缺失变异的实时定量pcr检测试剂盒和方法
CN105200097A (zh) 2008-10-20 2015-12-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 改进的等位基因特异性扩增
US20100143901A1 (en) 2008-12-09 2010-06-10 Roche Molecular Systems, Inc. Nuclease-Free Real-Time Detection of Nucleic Acids
WO2010077324A2 (en) 2008-12-17 2010-07-08 Life Technologies Corporation Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants
US9238832B2 (en) 2009-12-11 2016-01-19 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids
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