JP2016500253A - 上皮成長因子受容体キナーゼドメインにおける新規変異 - Google Patents
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Abstract
ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９において新規変異を発見した。当該エキソンは腫瘍においてしばしば変異されている。本発明は、配列番号１における変異2240_2264>CGAAAGA又は2252_2277>GAGAAGCCの存在又は不存在に基づく、治療応答の予後判定方法及び予測方法を含む。
Description
発明の技術分野
本発明は、癌診断、及び癌療法のためのコンパニオン診断に関する。特に、本発明は、癌の診断及び予後判定（prognosis）のために、並びに癌治療の有効性を予測するために有用である、変異の検出に関する。
本発明は、癌診断、及び癌療法のためのコンパニオン診断に関する。特に、本発明は、癌の診断及び予後判定（prognosis）のために、並びに癌治療の有効性を予測するために有用である、変異の検出に関する。
発明の背景
ＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１としても知られている上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、成長因子受容体のタイプ１チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。それらの膜結合されるタンパク質は、種々のシグナル伝達経路と相五作用する細胞内チロシンキナーゼドメインを有する。リガンド結合に基づいて、このファミリーの受容体は、チロシンキナーゼドメインの二量体化及び続く自己リン酸化を受ける。自己リン酸化は、Ras/MAPK、PI3K 及びAKT経路を包含する細胞内シグナル伝達経路内の一連の事象を誘発する。それらの経路を通して、ＨＥＲファミリーのタンパク質は、細胞増殖、分化及び生存を調節する。
ＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１としても知られている上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、成長因子受容体のタイプ１チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。それらの膜結合されるタンパク質は、種々のシグナル伝達経路と相五作用する細胞内チロシンキナーゼドメインを有する。リガンド結合に基づいて、このファミリーの受容体は、チロシンキナーゼドメインの二量体化及び続く自己リン酸化を受ける。自己リン酸化は、Ras/MAPK、PI3K 及びAKT経路を包含する細胞内シグナル伝達経路内の一連の事象を誘発する。それらの経路を通して、ＨＥＲファミリーのタンパク質は、細胞増殖、分化及び生存を調節する。
多くのヒト悪性腫瘍は、ＥＧＦＲの異常発現又は機能に関連している（Mendelsohn et al., (2000), “The EGF receptor family as targets for cancer therapy,” Oncogene, 19:6550-6565.）。特に、いくつかの癌はＥＧＦＲキナーゼドメイン（エキソン１８−２１）に突然変異を有することが実証されている。非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）においては、それらの突然変異は悪性細胞において抗−アポトーシス経路を促進することが示されている（Pao et al. (2004), "EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib", P.N.A.S. 101 (36): 13306-13311; Sordella et al. (2004), "Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways", Science 305 (5687): 1163-1167.）。
ＥＧＦＲを標的化する治療が開発されてきた。例えば、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（商標））及びパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（商標））が抗ＥＧＦＲ抗体である。エルロチニブ(ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）)及びゲフィチニブ(ＩＲＥＳＳＡ（商標）)は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの経口活性選択的阻害剤として有用なキナゾリンである。それらの薬剤は、癌が異常ＥＧＦＲ活性により駆動されている患者において最も効果的である。ＩＲＥＳＳＡ（商標）のランダム化された、大規模、二重盲検試験（ＩＲＥＳＳＡ Ｐａｍ−Ａｓｉｓａ試験（ＩＰＡＳＳ））は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における一次治療としてゲフィチニブを従来の化学療法と比較した（Mok et al. (2009), “Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma.” N Eng J Med 361:947-957）。ＩＰＡＳＳにおいて、確認された腺癌組織学を有する１，２１７人の患者が試験された。この試験は、無増悪生存性（ＰＦＳ）が、ＥＧＦＲ変異陽性腫瘍の患者において、化学療法よりも、ＩＲＥＳＳＡ（商標）に関して有意に長かったことを示した。反対のことが、ＥＧＦＲが変更されていない腫瘍については真であった：すなわち、ＰＦＳは、ＩＲＥＳＳＡ（商標）よりも化学療法に関して有意に長かった。この試験は、好結果をもたらす治療の肺癌患者の可能性を改善するためには、ＥＧＦＲ突然変異状態を知るべきであることを示した。
臨床結果の分析は、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン（エキソン１８〜２１）に突然変異を有する腫瘍を担持する患者が、野生型ＥＧＦＲを発現する腫瘍を有するそれらの患者よりもエルロチニブに対する良好な応答を有することを示した（米国特許第７，２９４，４６８号及び第７，９６０，１１８号）。それらの突然変異は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えばキナゾリンエルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標））及びグフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））に対する応答が予測される。ＥＧＦＲ突然変異間で、ヌクレオチド２２３５〜２２５７（アミノ酸７４６〜７５３に対応する）を包含するエキソン１９の領域におけるヌクレオチドのインフレーム欠失及び置換が肺癌患者において特に一般的である（米国特許第７，２９４，４６８号及びLynch et al. (2004), “Activating mutations in the epidermal growth factor underlying responsiveness of non-small cell lung cancer to gefitinib.” NEJM 350:2129を参照のこと）。それらの突然変異は、変更された性質、例えば阻害に対する増強された感受性を有する活性キナーゼをもたらすと思われる（Paez et al. (2004), EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to Gefitinib therapy, Science 304:1497を参照のこと）。
他の突然変異はあまり頻繁には発生しないが、ＥＧＦＲキナーゼドメインにおけるいくつかの突然変異が、一般的である。しかしながら、ＥＧＦＲ突然変異についての臨床試験は、できるだけ多くの突然変異を標的とすることが必須である。これは、希な突然変異を有する患者は、「儀陰性」の試験結果を受けることを保証するであろう。希突然変異が検出されない場合、そのような突然変異を有する患者は、潜在的救命治療を受けないであろう。従って、ＥＧＦＲキナーゼドメインにおける新規突然変異が発見される場合、この突然変異の検出は、いくらかの患者において臨床結果に影響を及ぼす可能性を有する。
１つの実施形態によれば、本発明は、配列番号１において変異2240_2264>CGAAAGA又は2252_2277>GAGAAGCCを含む核酸と特異的にハイブリダイズする、単離されたオリゴヌクレオチドに関する。この実施形態の変形によれば、前記オリゴヌクレオチドは、天然配列とマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドを含む。この実施形態の更なる変形によれば、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列と少なくとも９０％同一である。この実施形態の更なる変形によれば、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列からなる。この実施形態の更なる変形によれば、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１において変異2240_2264>CGAAAGAを含む核酸の選択的増幅をプライミング (priming)することはできるが、非変異の配列番号１の選択的増幅をプライミングすることはできない。この実施形態の更なる変形によれば、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１において変異2252_2277>GAGAAGCCを含む核酸の選択的増幅をプライミング (priming)することはできるが、非変異の配列番号１の選択的増幅をプライミングすることはできない。
別の実施形態によれば、本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子に突然変異を有する細胞をおそらく有する腫瘍を担持する患者の治療方法に関し、ここで前記方法は、配列番号１において変異2240_2264>CGAAAGA 又は 2252_2277>GAGAAGCCにより特徴づけられる、変異誘発されたＥＧＦＲ遺伝子の存在について患者の試料を試験し、そして前記変異の１つが存在する場合、チロシンキナーゼ阻害剤化合物を、前記患者に投与することを含む。本実施形態の変形によれば、前記化合物は、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ又はゲフェニチブである。この実施形態の更なる変形によれば、前記試験は、配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるオリゴヌクレオチドを使用して行われる。この実施形態の更なる変形によれば、前記方法は、以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、の１つ又は２つ以上の変異により特徴づけられる、変異誘導されたＥＧＦＲ遺伝子の存在について、患者の試料を試験し；そして段階（ｂ）において、いずれかの変異が存在する場合、チロシンキナーゼ阻害剤化合物を、前記患者に投与することをさらに含む。
別の実施形態によれば、本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤療法に対する癌患者の応答の可能性を決定する方法であり、ここで前記方法は、患者試料中のＥＧＦＲ遺伝子における変異2240_2264>CGAAAGA又は2252_2277>GAGAAGCCに関して患者試料を試験し、そして前記変異が存在する場合には、チロシンキナーゼ阻害剤療法に対して患者が応答する可能性があると決定することを含む。本実施形態の変形によれば、前記チロシンキナーゼ阻害剤療法は、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ又はゲフェニチブを含む。この実施形態の更なる変形によれば、前記試験は、配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるオリゴヌクレオチドを使用して行われる。この実施形態の更なる変形によれば、前記方法は、ＥＧＦＲ遺伝子における以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、の１つ又は２つ以上に関して、患者の試料をさらに試験し、そして、前記変異のいずれかが存在すると報告される場合、ステップ（ｂ）において、チロシンキナーゼ阻害剤療法に対して患者が応答する可能性があると決定することをさらに含む。
別の実施形態によれば、本発明は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子における変異2240_2264>CGAAAGA又は2252_2277>GAGAAGCCを検出するためのキットであって、配列番号１中の変異2240_2264>CGAAAGA又は2252_2277>GAGAAGCCと特異的にハイブリダイズするが、非変異の配列番号１とはハイブリダイズしない、１つ又は２つ以上のオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。本実施形態の変形によれば、前記キットは、配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるオリゴヌクレオチドを含む。この実施形態の更なる変形によれば、前記キットは、核酸前駆体、核酸ポリメラーゼ、並びに、前記核酸ポリメラーゼの活性を補助するために必要な試薬及び溶液をさらに含む。この実施形態の更なる変形によれば、前記キットは、配列番号１における以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、と特異的にハイブリダイズするが、非変異の配列番号１とはハイブリダイズしない、１つ又は２つ以上のオリゴヌクレオチドをさらに含む。
別の実施形態によれば、本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子に突然変異を有する細胞をおそらく有する腫瘍を担持する患者の治療方法に関し、ここで前記方法は、配列番号１において変異2240_2264>CGAAAGA or 2252_2277>GAGAAGCCにより特徴づけられる、変異誘発されたＥＧＦＲ遺伝子の存在について患者の試料を試験し、そして前記変異の１つが存在する場合、チロシンキナーゼ阻害剤化合物を、前記患者に投与することを含む。本実施形態の変形によれば、前記化合物は、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ又はゲフェニチブである。この実施形態の更なる変形によれば、前記試験は、配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるオリゴヌクレオチドを使用して行われる。この実施形態の更なる変形によれば、前記方法は、以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、の１つ又は２つ以上の変異により特徴づけられる、変異誘導されたＥＧＦＲ遺伝子の存在について、患者の試料を試験し；そして段階（ｂ）において、何れかの変異が存在する場合、チロシンキナーゼ阻害剤化合物を、前記患者に投与することをさらに含む。
発明の詳細な説明
定義
本開示の理解を促進するために、本明細書に使用される用語の次の定義が提供される。
定義
本開示の理解を促進するために、本明細書に使用される用語の次の定義が提供される。
用語「ｎ_ｍ」又は「ｎ−ｍ ｄｅｌ」とは、位置「ｎ」と「ｍ」との間のヌクレオチドを欠いている核酸をもたらす変異のことである。用語「ｎ_ｍ＞ＸＹＺ」とは、核酸が位置「ｎ」と「ｍ」との間のヌクレオチドを欠いているが、しかしヌクレオチド配列ＸＹＺがそれらの位置に挿入されている複合変異のことである。例えば、因語「２２３９_２２４０ＴＴ＞ＣＣ」とは、ヌクレオチド２２３９〜２２４０を欠いている核酸をもたらし、そしてヌクレオチド配列ＣＣが欠失されたヌクレオチドの代わりに挿入されている変異のことである。
用語「対立遺伝子−特異的プライマー」（allele-specific primer）又は「ＡＳプライマー」（ＡＳ primer）とは、標的配列の複数の変異体に対してハイブリダイズするが、しかし標的配列の変異体間を区別できるプライマーのことであり、ここで前記変異体の１つによってのみ、プライマーは適切な条件下で核酸ポリメラーゼにより効果的に延長される。標的配列の他の変異体によれば、その延長は低効率的、非効率的又は検出不能である。
用語「共通プライマー」（common primer）とは、対立遺伝子プライマーを含むプライマー対における第二プライマーのことである。共通プライマーは、対立遺伝子特異的ではなく、すなわち対立遺伝子−特異的プライマーが区別する標的配列の変異体間を区別しない。
用語「相補的」（complementary）又は「相補性」（complementarity）は、ワトソン−クリック塩基対規則により関連するポリヌクレオチドの逆平行鎖に関連して使用される。用語「完全に相補的」（perfectly complementary）又は「１００％相補的」（１００％complementary）とは、逆平行鎖間のすべての塩基のワトソン−クリック対を有する相補的配列のことであり、すなわちポリヌクレオチド二重鎖における任意の２つの塩基間にミスマッチは存在しない。しかしながら、二重鎖は、完全な相補性の不在下でさえ、逆平行鎖間で形成される。用語「部分的に相補的」（partially complementary）又は「不完全に相補的」（incompletely complementary）とは、１００％未満、完全である逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基の任意の配置のことである（例えば、ポリヌクレオチド二重鎖に少なくとも１つのミスマッチ又はマッチしない塩基が存在する）。部分的に相補的鎖間の二重鎖は一般的に、完全に相補的鎖間の二重鎖よりも低い安定性である。
用語「試料」（sample）とは、核酸を含むか又は含むと推定される任意の組成物のことである。これは、個人から単離された組織又は体液、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官及び腫瘍の試料、及びまた、個人から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）及びそれらから単離される核酸の試料のことである。
用語「ポリヌクレオチド」（polynucleotide）及び「オリゴヌクレオチド」（oligonucleotide）は、交換可能的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、より短いポリヌクレオチドを記載するために時々使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する、少なくとも６個のヌクレオチド、例えば少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５〜３０個のヌクレオチドから成る。
用語「一次配列」（primary sequence）とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの配列のことである。ヌクレオチド修飾、例えば窒素含有塩基修飾、糖修飾又は他の主鎖修飾は、一次配列の一部ではない。標識、例えばオリゴヌクレオチドに接合される発色団もまた、一次配列の一部ではない。従って、２つのオリゴヌクレオチドは、同じ一次配列を共有することができないが、しかし修飾及び標識に関しては異なることができる。
用語「プライマー」（primer）とは、標的核酸における配列とハイブリダイズし、そして核酸の相補的鎖に沿って合成の開始点として、そのような合成のために適切な条件下で作用することができるオリゴヌクレオチドのことである。本明細書において使用される場合、用語「プローブ」（probe）とは、標的核酸における配列とハイブリダイズし、そして通常、検出可能的に標識されるオリゴヌクレオチドのことである。プローブは、修飾、例えば核酸ポリメラーゼ、及び１つ又は２つ以上の発光団によりプローブを非延長性にする３′−末端修飾を有することができる。同じ配列を有するオリゴヌクレオチドは、１つのアッセイにおいてプライマーとして、及び異なったアッセイにおいてプローブとして作用することができる。
本明細書において使用される場合、用語「標的配列」（target sequence）、「標的核酸」（target nucleic acid）又は「標的物」（target）とは、増幅されるか、検出されるか、又は両者である核酸配列の一部のことである。
用語「ハイブリダイズされる」（hybridized）及び「ハイブリダイゼーション」（hybridization）とは、二重鎖の形成をもたらす、２つの核酸間の塩基対合相互作用のことである。２種の核酸は、ハイブリダイゼーションを達成するために、それらの全長にわたって１００％の相補性を有することは必要条件ではない。
用語「選択的ハイブリダイゼーション」（selective hybridization）及び「特異的ハイブリダイゼーション」（specific hybridization）とは、他の核酸もまた存在する複合混合物に存在する特定核酸に対する核酸の主な（ハイブリダイズする分子の５０％又はそれ以上）又はほぼ独占的な（ハイブリダイズする分子の９０％又はそれ以上）ハイブリダイゼーションのことである。例えば、典型的ＰＣＲ条件下で、プライマーは、溶液にまた存在する非標的核酸を除いて、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズする。特異的にハイブリダイズされたプライマーは、標的核酸の増幅を駆動し、少なくとも最も主要な増幅生成物であり、そして好ましくは、ほぼ独占的（例えば、試料におけるすべての増幅生成物の９０％又はそれ以上を表す）増幅生成物である標的核酸の増幅生成物を生成する。好ましくは、非特異的増幅生成物は、検出できないか、又は特異的増幅生成物から容易に区別できるよう少量で検出されるような少量で存在する。同様に、プローブは、反応混合物にも存在する非標的核酸を除いて、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズする。特異的にハイブリダイズされたプローブは、少なくとも最も主要なシグナルであり、そして好ましくは、ほぼ独占的（例えば、試料におけるすべての増幅生成物の９０％又はそれ以上を表す）シグナルである検出可能シグナルを生成するために、標的核酸の特異的検出を可能にする。
本発明は、癌診断及び予後のために、治療計画の設計のために、そして治療の成功を予測するために有用である、ＥＧＦＲキナーゼドメイン中の新規変異を記載する。
本明細書に使用されるヌクレオチド番号付けは、図１上に示される配列番号１を参照している。配列番号１内で、本明細書に記載される７個の変異を包含する、ヌクレオチド２２２１と２２８０との間の配列の一部が強調され、そして下線が引かれている。
本明細書に使用されるアミノ酸番号付けは、図２上に示される配列番号２を参照している。配列番号２内で、シグナル配列はアミノ酸１〜２４を含み、細胞外ドメインはアミノ酸２４〜６４５を含み、トランスメンブランドメインはアミノ酸６４６〜６６８を含み、そして細胞質ドメインはアミノ酸６６９〜１２１０を含み、その中のチロシンキナーゼドメインはアミノ酸７１８〜９６４であり、そしてトレオニンリン酸化部位はアミノ酸６７８である。
本発明は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９（キナーゼドメインの一部）に、２つの新規変異を含む。変異2240_2264>CGAAAGA 及び 2252_2277>GAGAAGCC及びその対応する野生型配列が表１に示される。
１つの実施形態によれば、本発明は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における変異2240_2264>CGAAAGA及び2252_2277>GAGAAGCCを検出するためのオリゴヌクレオチドを包含する。この実施形態の変形によれば、オリゴヌクレオチドのいくつかは、対立遺伝子−特異的ＰＣＲへの使用のための対立遺伝子−特異的プライマーである（米国特許第６，６２７，４０２号を参照のこと）。対立遺伝子−特異的プライマーは典型的には、標的配列（変異配列）にマッチされ、そして他の配列（例えば、野生型配列）にマッチされない３'末端を有する。任意には、対立遺伝子−特異的プライマーは、野生型及び変異標的配列の両者と共に内部ミスマッチを含むことができる。対立遺伝子−特異的ＰＣＲプライマー中の追加のミスマッチは、プライマーの選択性を高めることが示されている（米国特許第８，５８６，２９９号を参照のこと）。プライマーの成功した拡張のためには、プライマーは、標的配列に対して少なくとも部分的相補性を有する必要がある。一般的に、プライマーの３'末端での相補性は、プライマーの５’末端での相補性よりも決定的である（Innis et al. Eds. PCR Protocols, (1990) Academic Press, Chapter 1, pp. 9-11）。これは、５'末端の変動、すなわち５'末端でのヌクレオチドの付加、置換又は除去がＰＣＲアッセイにおいてプライマーの性能に影響を及ぼさないことを意味する。従って、本発明は、対立遺伝子−特異的プライマー（例えば、表２に開示されるそれら）、及び５'末端変動を有するそれらの同等体を包含する。この実施形態の変形によれば、オリゴヌクレオチドは、表２（配列番号６〜８及び９〜１２）から選択される。
この実施形態の他の変形によれば、オリゴヌクレオチドのいくつかは、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における変異2240_2264>CGAAAGA 又は 2252_2277>GAGAAGCCに対して特異的な検出プローブである。典型的変異−特異的検出プローブは、標的配列（例えば、変異2240_2264>CGAAAGA 又は 2252_2277>GAGAAGCCを有する配列）と安定したハイブリッドを形成し、そして検出が実施される反応条件下で他の配列（例えば、同じ部位での野生型配列）と安定したハイブリッドを形成しない。成功したプローブハイブリダイゼーションのためには、プローブは標的配列に対して少なくとも部分的相補性を有する必要がある。一般的に、プローブの中心部分に隣接する相補性は、プローブの端での相補性よりも決定的である（Innis et al. Chapter 32, pp. 262-267）。これは、プローブの末端の変動、すなわち少数のヌクレオチドの付加、置換又は除去が、ハイブリダイゼーションにおけるプローブの性能に影響を及ぼさないことを意味する。従って、本発明は、検出プローブ（例えば、表２に開示されるそれら）、及び５’末端及び３'末端変動を有するそれらの同等体を包含する。この実施形態のさらなる変形によれば、プローブは特定の構造体、例えばタンパク質−核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、分子ビーコンプローブ（Tyagi et al. (1996) Nat. Biotechnol. 3:303-308）、又はＳＣＯＲＰＩＯＮＳ（登録商標）自己プロービングプライマー（Whitcombe et al. (1999) Nat. Biotechnol. 8:804-807）を有する。プローブは、放射性、蛍光性又は発光団ラベルにより標識され得る。例えば、変異は、リアルタイム対立遺伝子特異的ポリメラーゼ鎖反応により検出され得、ここで増幅生成物へのプローブのハイブリダイゼーションが、プローブの酵素消化及び消化性生物の検出をもたらす（TaqMan（登録商標）プローブ、 Holland et al. (1991) P.N.A.S. USA 88:7276-7280）。プローブと標的物との間のハイブリダイゼーションはまた、核酸二重鎖形成による蛍光の変化を検出することにより（米国公開第２０１０／０１４３９０１号）、又はプローブと標的物との間のハイブリッドの特徴的融解温度を検出することにより（米国特許第５，８７１，９０８号）、検出され得る。
変異ＥＧＦＲ遺伝子又は遺伝子生成物は、腫瘍又は他の身体試料、例えば尿、癌又は血清において検出され得る。腫瘍試料における変異ＥＧＦＲ遺伝子又は遺伝子生成物の検出について上記で論じられる同じ技法が、他の身体試料に適用され得る。例えば、癌細胞が腫瘍から剥がれ、そしてそのような身体試料中に現れる。当技術分野の核酸検出方法は、広範囲の種類の試料型における非腫瘍細胞のバックグラウンド下の変異細胞を検出することができる。
別の実施形態によれば、本発明は、エキソン１９に変異2240_2264>CGAAAGA 及び 2252_2277>GAGAAGCCの１つを有するＥＧＦＲ遺伝子を有する細胞をおそらく担持する腫瘍を有する患者の治療方法であり、ここで前記方法は、上記に言及された変異について患者の試料を試験し、そして変異が検出される場合、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）又はＥＧＦＲ阻害剤を、前記患者に投与することを含む。この実施形態の変形によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ又はゲフェニチブである。
この実施形態の別の変形によれば、前記方法はさらに、以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、の１以上について、患者の試料を試験し；そして前記変異の１つ又は２つ以上が存在する場合、変異遺伝子によりコードされる変異ＥＧＦＲタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物を、前記患者に投与することを含む。上記に列挙される変異を引起すヌクレオチド変化及びそれらの検出方法は、米国特許第7,294,468号 及び第7,960,118号、国際公開第2012/065705号 (変異E746-A750 del AP ins) 及び米国公開第2013/0121996 号(変異2236_2248>ACCC, 2237_2244>CGCCC, 2252_2277>AC, 2240-2264>CGAAAGA, 2239_2240 TT>CC 及び2264 C>A)に開示されている。複数変異は、例えばドット−ブロット又は核酸アレー形式、多重ＰＣＲ、例えば多重対立遺伝子−特異的ＰＣＲ及び多重ＰＣＲ、続く変異−特異的融点により特徴づけられる各プローブを用いてのプローブ融解アッセイ下で、複数プローブに対するハイブリダイゼーションを用いることにより、同時に又は別々に検出され得る。複数変異はまた、核酸配列解読装置によっても検出され得る。複数試料は従来、例えば固体支持体に付着される単一分子のエマルジョンＰＣＲ増幅、合成及び配列データの生物情報分析による続く配列決定を包含する方法、例えば454 Life Sciences, Inc. (Branford, Conn.)により開発された方法を用いるハイスループット・シーケンシング法、又は別のハイスループット・シーケンシング法及び装置、例えばION PROTON（登録商標）及びPGM（商標）、 Life Technologies, Grand Island, N.Y.; HISEQ（登録商標）及びMISEQ（登録商標）, Illumina, San Diego, Cal./USAを用いて分析され得る。
別の実施形態によれば、本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）又はＥＧＦＲ阻害剤に対する、患者における悪性腫瘍の応答の可能性を決定する方法である。前記方法は、ＥＧＦＲのエキソン１９における変異2240_2264>CGAAAGA 及び 2252_2277>GAGAAGCCの１つの存在について、患者の試料を試験し、そして変異が見出される場合、治療が好結果をもたらす可能性があることを決定することを含む。この実施形態の変形によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤又はＥＧＦＲ阻害剤、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ又はゲフェニチブである。
この実施形態の別の変形によれば、前記方法はさらに、以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、の１つ以上について、患者の試料を試験し；そして１つ又は２つ以上の変異が存在する場合、チロシンキナーゼ阻害剤による治療が好結果をもたらす可能性を有することを決定することを含む。
さらなる別の実施形態によれば、本発明は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９における変異2240_2264>CGAAAGA 及び2252_2277>GAGAAGCCの１つ又は両者を検出するために必要な試薬を含むキットである。前記キットは、変異配列に対して特異的であるが、野生型配列とは特異的ではないオリゴヌクレオチド、例えばプローブ及び増幅プライマーを含んでもよい。いくつかの実施形態によれば、キットは、表２（配列番号６〜８又は９〜１２）から選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、キットは、増幅及び検出アッセイの実施のために必要な試薬、例えばＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ又は転写介在増幅（ＴＭＡ）の成分をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、変異−特異的オリゴヌクレオチドは検出可能に標識される。そのような実施形態によれば、キットは、ラベルを標識するための試薬、及び標識を検出するための試薬を含む。例えば、オリゴヌクレオチドがビオチンにより標識される場合、キットは、酵素及びその発色性基質と共にストレプタビジン試薬を含む。この実施形態の変形によれば、キットはさらに、以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、から選択された、ＥＧＦＲ遺伝子における少なくとも１つ以上の変異を検出するための試薬を含む。
さらなる別の実施形態によれば、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９において変異2240_2264>CGAAAGA及び2252_2277>GAGAAGCCの１つの存在について、患者の試料を試験し、そして変異が検出される場合、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を、前記患者に投与することを含む、腫瘍を有する患者の治療方法に関する。この実施形態の変形によれば、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ又はゲフェニチブある。
この実施形態のさらなる変形によれば、前記方法はさらに、以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、の１以上について、患者の試料を試験し；そして１つ又は２つ以上の変異が存在する場合、チロシンキナーゼ阻害剤を、前記患者に投与することを包含する。
実施例１
肺癌患者試料中の変異の同定
組織試料を、肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者から入手した。試料を、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）として保存した。核酸を試料から単離し、そしてGenome Sequencer FLX装置上で、その製造業者（454 Life Sciences, Branford, Conn./USA）の指示に従って、直接的配列決定にゆだねた。
肺癌患者試料中の変異の同定
組織試料を、肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者から入手した。試料を、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）として保存した。核酸を試料から単離し、そしてGenome Sequencer FLX装置上で、その製造業者（454 Life Sciences, Branford, Conn./USA）の指示に従って、直接的配列決定にゆだねた。
2240_2264>CGAAAGA変異は、試料からの合計３，５９０の読み取りの平均２６％で検出された。2252_2277>GAGAAGCC変異は、試料から合計３，４３９の読み取りの平均２１．６３％で検出された。読み取りの一部のみが、変異を含むことが見出され、このことは、腫瘍が不均質であり、そしてさらに、典型的な試料が腫瘍及び非腫瘍細胞の混合物である事実を反映している。
Claims (14)
- 配列番号１において変異2240_2264>CGAAAGA又は2252_2277>GAGAAGCCを含む核酸と特異的にハイブリダイズする、単離されたオリゴヌクレオチド。
- 天然配列とマッチしない少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列と少なくとも９０％同一である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列からなる、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号１において変異2240_2264>CGAAAGAを含む核酸の選択的増幅をプライミングすることはできるが、非変異の配列番号１の選択的増幅をプライミングすることはできない、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号１において変異2252_2277>GAGAAGCCを含む核酸の選択的増幅をプライミングすることはできるが、非変異の配列番号１の選択的増幅をプライミングすることはできない、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
- チロシンキナーゼ阻害剤療法に対する癌患者の応答の可能性を決定する方法であって、
（ａ）患者試料中のＥＧＦＲ遺伝子における変異2240_2264>CGAAAGA又は2252_2277>GAGAAGCCに関して患者試料を試験し、そして前記変異が存在する場合には、
（ｂ）チロシンキナーゼ阻害剤療法に対して患者が応答する可能性があると決定すること
を含む、前記方法。 - 前記チロシンキナーゼ阻害剤療法が、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ又はゲフェニチブを含む、請求項７に記載の方法。
- 前記試験が、配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるオリゴヌクレオチドを使用して行われる、請求項７に記載の方法。
- ステップ（ａ）において、ＥＧＦＲ遺伝子における以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、の１つ又は２つ以上に関して、患者の試料をさらに試験し、そして、前記変異のいずれかが存在すると報告される場合、ステップ（ｂ）において、チロシンキナーゼ阻害剤療法に対して患者が応答する可能性があると決定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
- ヒトＥＧＦＲ遺伝子における変異2240_2264>CGAAAGA又は2252_2277>GAGAAGCCを検出するためのキットであって、配列番号１中の変異2240_2264>CGAAAGA又は2252_2277>GAGAAGCCと特異的にハイブリダイズするが、非変異の配列番号１とはハイブリダイズしない、１つ又は２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、前記キット。
- 配列番号６〜８及び９〜１２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のキット。
- 核酸前駆体、核酸ポリメラーゼ、並びに、前記核酸ポリメラーゼの活性を補助するために必要な試薬及び溶液をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
- 配列番号１における以下の変異：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 及びE746-A750 del AP ins、と特異的にハイブリダイズするが、非変異の配列番号１とはハイブリダイズしない、１つ又は２つ以上のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１１に記載のキット。
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