ES2290979T3 - Cebador marcado para uso en la deteccion de acidos nucleicos diana. - Google Patents

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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN CEBADOR MARCADO (POR EJEMPLO PARA LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA), EL CUAL ESTA MARCADO EN LOS DOS EXTREMOS DE LA HEBRA OLIGONUCLEOTIDICA, CON UNA MOLECULA DE COLORANTE MARCADORA Y UNA MOLECULA APAGADORA. EN DICHO CEBADOR, AL MENOS LA ULTIMA BASE DEL EXTREMO 3'' NO ES COMPLEMENTARIA CON LA SECUENCIA DE ADN DESTINADA A SER AMPLIFICADA. SE DESCRIBE ASIMISMO UN PROCEDIMIENTO DE DETECCION DE UNA SECUENCIA DE ADN (POR MEDIO DE LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA), UTILIZANDO DICHO CEBADOR MARCADO. DICHO PROCEDIMIENTO EMPLEA PARA LA AMPLIFICACION UNA O MAS ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES, UNA DE LAS CUALES POSEE ASIMISMO PROPIEDADES DE CORRECTORA DE PRUEBAS Y LIBERA LAS BASES NO APAREADAS DEL CEBADOR MARCADO, JUNTO CON LA MOLECULA APAGADORA QUE ESTA UNIDA AL MISMO, PROVOCANDO UN INCREMENTO DE LA FLUORESCENCIA A LA LONGITUD DE ONDA DEL COLORANTE MARCADOR, E INDICANDO POR TANTO LA FORMACION DE LA SECUENCIA DE ADN MARCADA CON DICHO COLORANTE FLUORESCENTE.

Description

Cebador marcado para uso en la detección de ácidos nucleicos diana.
La invención se refiere a un cebador marcado para reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa) y a un procedimiento para detectar una secuencia de ADN mediante un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos en el que se emplea un cebador marcado.
Tal y como ya es conocido, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método muy eficaz para detectar pequeñas cantidades de una secuencia conocida de ácido nucleico en una muestra (Erlich HA, Gelfand, D. Sninsky J.J. (1991). Science, 252, págs. 1643-1651, cuya publicación se incorpora en esta memoria como referencia; "PCR Protocols, Current methods and applications" (1993), editado por B.A. White, Humana Press, Totowa, New Jersey, ISBN 0-89603-244-2, cuya publicación se incorpora en esta memoria como referencia). Si la secuencia, por ejemplo, de un ADN vírico ya es conocida, es posible sintetizar una pareja de cebadores que sean complementarios a regiones en cadenas monocatenarias opuestas y que flanqueen la secuencia de ADN buscada. Bajo las condiciones de la PCR, conocidas por sí mismas, se pueden amplificar a continuación grandes cantidades de un ADN específico in vitro, mediante una serie generalmente de más de 30 ciclos de reacción. Con ciclos de la PCR se amplifica un fragmento de ADN que tiene un tamaño específico y que está compuesto de las longitudes de los dos cebadores más la longitud de, p. ej., un ADN vírico entre ellos, sólo cuando, p. ej., el ADN vírico buscado está presente en la muestra. La técnica de la PCR es tan sensible que se puede emplear para detectar cantidades extremadamente pequeñas de un ADN con un alto grado de fiabilidad.
El documento de solicitud de patente internacional WO 92/02638, incorporado en esta memoria como referencia, describe un procedimiento para detectar una secuencia de ADN en cuyo procedimiento una muestra que contiene o que se sospecha que contiene el ADN, que se va a detectar (como una cadena sencilla), es decir, el ADN diana, se hibrida con dos cebadores diferentes, es decir, el cebador de avance y el cebador inverso, que flanquean la hebra de ADN que se va a amplificar, es decir, el ADN diana. Una sonda de oligonucleótido marcada que se proporciona en una realización preferida del documento WO 92/02638, con un sistema de tinción fluorescente como marcador, tanto en el extremo 5' terminal como en el extremo 3' terminal, también se emplea en la reacción. Esta sonda marcada se selecciona de modo que se hibrida entre los dos cebadores dentro del segmento de ADN que se va a amplificar, es decir, dentro del ADN diana. Los dos colorantes fluorescentes que se fijan a la sonda como marcadores preferidos, tienen el rasgo característico de que la fluorescencia de uno de los colorantes, el colorante informador, disminuye ("se atenúa rápidamente") con la proximidad de la segunda molécula, es decir, el atenuador (del inglés, "quencher") a través de un procedimiento conocido como transferencia de energía por resonancia fluorescente (Stryer, L. 1978; "Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler". Ann. Rev. Biochem. 47:819-846, que se incorpora en esta memoria como referencia). Esta sonda marcada, que se fija al ADN situado entre los dos cebadores, que se caracterizan por las secuencias mencionadas anteriormente, tiene a modo de ejemplo, la secuencia siguiente:
^{5'}FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA^{3'}
Una secuencia de esta naturaleza se puede ordenar y obtener a partir de una variedad de compañías y se dirige al uso en un ensayo con 5'-nucleasa, es decir, el ensayo TaqMan®. El método anterior está detalladamente descrito por Livak K.J., Flood S.J.A., Marmaro J., Giusti W., Deetz K., "Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization". PCR Method and Appl. 1995; 4:357-362, cuya publicación se incorpora en esta memoria como referencia.
La característica especial de esta sonda es que la fluorescencia del colorante (FAM), es decir, el colorante informador, que se fija al extremo 5' de la sonda, se reduce con la proximidad del segundo colorante fluorescente (TAMRA), es decir, el colorante atenuador, que está dispuesto en el extremo 3' de la sonda, véase más arriba.
Si la nueva cadena de ADN se forma durante el curso de la amplificación y bajo la influencia de una polimerasa de ADN adecuada, preferentemente termoestable, p. ej., la polimerasa de ADN Taq, no sólo la polimerasa desplaza la sonda marcada de la cadena sencilla, sino que también degrada la sonda con su actividad nucleasa 5'\rightarrow3', liberando de este modo los dos colorantes fluorescentes. La fluorescencia del colorante informador ya no está ahora inhibida por el colorante atenuador y se incrementa. Si se emplea a continuación un espectómetro de la fluorescencia para medir la fluorescencia a la longitud de onda del colorante informador, entonces es posible observar un incremento de la fluorescencia que se corresponde con la cantidad de ADN formada recientemente.
El hecho de que sea necesaria una sonda marcada, además del cebador de avance y del cebador inverso, para poder observar o medir la amplificación del segmento de ADN que se va a detectar, se debe considerar una desventaja para este método. Por ello surge el objeto de simplificar este procedimiento conocido.
Se ha encontrado ahora que no es necesario el uso de una sonda marcada adicional en la reacción en cadena de la polimerasa, si al menos uno de los dos cebadores está marcado, p. ej., en una realización preferida de la invención, con una molécula informadora y una molécula atenuadora (en términos generales: un sistema de marcación interactivo) y, simultáneamente, se tiene cuidado de que el cebador que se marca no se hibride completamente con la hebra de ADN que se va a amplificar.
La invención emplea, por tanto, un cebador marcado para las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa) marcándose dicho cebador, en una realización preferida, con un sistema de marcación en el extremo 3' del cebador o próximo al mismo, con una molécula de colorante informadora y una molécula atenuadora, en la realización preferida y al menos una de las bases, preferentemente al menos de dos a cinco o más de las últimas bases del extremo 3' del cebador (es decir, una porción desemparejada de forma deliberada del extremo 3'-terminal) que se marca de este modo, no son complementarias a la secuencia de ADN que se va a amplificar. El marcador o parte de un sistema de marcación se fija a la porción 3'-terminal desemparejada, preferentemente al nucleótido 3'-terminal. La longitud de la región desemparejada se selecciona y/o se mejora según es conocido en la técnica, dependiendo del marcador utilizado en particular y de la polimerasa en particular. Un cebador marcado de este modo, no es capaz de emparejarse completamente en su extremo 3' con la secuencia de ADN que se va a amplificar. Bajo la influencia de la polimerasa empleada para la amplificación, dicha polimerasa debe poseer la propiedad de lectura correctora de errores (del inglés "proofreading"), las bases no emparejadas del cebador marcado, junto con el marcador empleado, p. ej., la molécula colorante informadora o la molécula atenuadora, según sea el caso, se escinden con la actividad nucleolítica 3'\rightarrow5' de la polimerasa, antes de que tenga lugar la reacción real de elongación. Esto, sin embargo, en el caso mencionado a modo de ejemplo, da como resultado que el atenuador ya no está más espacialmente próximo al colorante informador, cuya fluorescencia se incrementa de este modo, indicando así la presencia de un ácido nucleico diana y/o la amplificación de un ácido nucleico diana.
La invención también se refiere a un procedimiento para detectar un ácido nucleico diana de ADN mediante la amplificación del ácido nucleico, en dicho procedimiento uno de los cebadores posee las características mencionadas anteriormente. En la amplificación, para la que es posible emplear una o varias polimerasas de ADN termoestables, al menos una de ellas debe poseer la propiedad de corrección de errores, a continuación, las bases desemparejadas del cebador marcado, junto con el marcador o parte de un sistema de marcación, p. ej., el colorante informador que se fija al mismo, se escinden, dando como resultado un incremento de la señal, p. ej., incremento de la fluorescencia en la longitud de onda del colorante informador.
En el nuevo procedimiento, el cebador de avance o el cebador inverso o ambos, se pueden marcar con las moléculas informadora y atenuadora, cada una tal y como se han descrito anteriormente. Mientras que el colorante atenuador se libera en la solución de la reacción, el segmento de ADN formado recientemente también transporta el colorante informador fluorescente además del resto del cebador. Este es el procedimiento preferido para aplicaciones cuantitativas. Sin embargo, el marcador con el colorante atenuador y el informador también se puede efectuar del mismo modo, de forma conveniente, para que el colorante informador se libere en la solución y el segmento de ADN formado recientemente sea portador del atenuador. Si se van a detectar simultáneamente en paralelo diversos parámetros (multiplexión), es oportuno seleccionar los colorantes informadores que se puedan detectar en paralelo. En esta memoria se describe que el método de la invención es muy adecuado para la multiplexión.
En general, el extremo 3' de un cebador se marca o se fija a la parte del sistema de marcación, tal y como se describe a continuación, incorporando restos detectables por medios espectroscópicos, fotoquímicos, inmunoquímicos o químicos. El método para ligar o conjugar el marcador con el cebador depende naturalmente del tipo de marcador(s) empleado(s) y de la posición del marcador en el cebador.
Se conocen en la técnica una variedad de marcadores que podrían ser adecuados para el uso en la invención, así como métodos para su inclusión en el cebador y que incluyen, sin estar limitados a los mismos, enzimas (p. ej., fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante) y sustratos enzimáticos, átomos radiactivos, colorantes fluorescentes, cromóforos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores electro-quimioluminiscen-tes, tales como Origen® (Igen) ligandos que tienen partícipes específicos para la unión o cualquier otro marcador que puede interaccionar con otro para potenciar, alterar o disminuir una señal. Evidentemente, si la amplificación se realiza mediante PCR y se procesa empleando un instrumento de ciclación térmica, el marcador tiene que ser capaz de resistir la temperatura de ciclación requerida en el proceso automatizado.
Entre los átomos radiactivos, ^{32}P es el preferido. Los métodos para introducir ^{32}P en los ácidos nucleicos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el marcador en 5' con una quinasa o la inserción al azar mediante la traslación de una muesca. Las enzimas se detectan típicamente por su actividad. "Partícipes específicos para la unión" se refiere a una proteína capaz de unirse a un anticuerpo monoclonal ligando, específico de la misma. Otros partícipes específicos para la unión incluyen la biotina y la avidina o la estreptavidina, la IgG y la proteína A y diversas parejas de receptor-ligando conocidas en la técnica.
La descripción anterior no pretende clasificar los diversos marcadores en distintas clases, ya que el mismo marcador puede servir para diversos modos diferentes. Por ejemplo, ^{125}I puede servir como un marcador radiactivo o como un reactivo electrodenso. La HRP puede servir como enzima o como antígeno para un anticuerpo monoclonal. Además, se pueden combinar varios marcadores para obtener el efecto deseado. Por ejemplo, se puede marcar un cebador con biotina y detectar la presencia del cebador con el marcador avidina con ^{125}I, o con un anticuerpo monoclonal anti-biotina marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán evidentes para los expertos en la técnica y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención.
Los fluoróforos para emplear como marcadores en la construcción de cebadores marcados de la invención, incluyen la rodamina y derivados, tales como Rojo de Texas, la fluoresceína y derivados, tales como 5-bromometil fluoresceína, Amarillo de Lucifer, IAEDANS, 4-acetato de 7-Me_{2}N-coumarina, 3-acetato de 7-OH-4-CH_{3}-coumarina (AMCA), monobromobimano, trisulfonatos de pireno, tales como Azul de Cascada y monobromotrimetilamoniobimano. En general, se prefieren los fluoróforos con desplazamiento de Stoke amplios, para permitir el empleo de fluorímetros con filtros, más que el uso de un monocromómetro y para incrementar la eficacia de la detección. Sin embargo, la(s) marca(s)
particular(es) escogida(s) tiene(n) preferentemente alguna cualidad (p. ej., la relación entre informador-atenuador) para permitir la detección en un sistema de ensayo homogéneo.
La detección o la verificación del marcador en el procedimiento descrito, se realiza según una variedad de métodos y depende de la fuente de la(s) marca(s) empleada(s). En la realización preferida de la invención, el incremento de la fluorescencia se mide en un fluorómetro adecuado.
En una realización preferida de la presente invención, dos marcadores que interaccionan sobre un cebador aislado, se emplean como sistema de marcación informador-atenuador, véase más arriba y en los ejemplos.
Ejemplos de las moléculas informadoras son 6-carboxi-fluoresceína (FAM), tetracloro-6-carboxi-fluoresceína
(TET), 6-carboxi-X-carboxi-tetrametil-rodamina (ROX). Ejemplos de moléculas atenuadoras son 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA) o ácido 4-(4'-dimetilamino-fenilazo)benzoico (DABCYL). Mientras que TAMRA es un colorante fluorescente, DABCYL no lo es.
Se pueden emplear diferentes polimerasas de ADN para la nueva reacción de amplificación. Si la polimerasa de ADN que se emplea tiene la propiedad de lectura correctora, entonces es posible realizar la reacción empleando una única polimerasa (p. ej., la polimerasa de ADN ULTma®, que es producida por Perkin Elmer en Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, EE.UU.). De otro modo, es necesario emplear una mezcla de diversas polimerasas con otras polimerasas que tengan actividad nucleasa 3'\rightarrow5' que también se emplean adicionalmente, por ejemplo, la polimerasa de ADN Taq, la polimerasa de ADN Tii (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.) o la polimerasa de ADN Vent (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.) que son polimerasas termoestables adecuadas que poseen actividad nucleasa 3'\rightarrow5'. Es muy adecuada para la presente invención la mezcla de polimerasa de ADN AccuTaq® LA, vendida por SIGMA Corp. (anejo 1). Dicha mezcla y las composiciones enzimáticas relacionadas se describen en el documento de patente de EE.UU. nº 5.436.149, en el ejemplo 6 en el mismo lugar, dicha descripción de la patente se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad.
Los nuevos procedimientos se basan en el reconocimiento del hecho que las bases desemparejadas del cebador son un punto de ataque para la polimerasa que posee una función de lectura correctora. Las polimerasas de ADN termoestables que se emplean poseen una actividad nucleasa 3'\rightarrow5', preferentemente la actividad exonucleasa 3'\rightarrow5' que da como resultado las bases no hibridadas junto con, en el caso que pueda tener lugar, la escisión de la molécula atenuadora o informadora.
Los cebadores empleados en los nuevos procedimientos comprenden preferentemente oligonucleótidos de 18 a 25 bases en la región emparejada o acoplada en relación con el ácido nucleico diana para la proporción promedio de G/C y de A/T, pero son algo más largos en el caso de más parejas de bases A/T y conforme a la metodología general descrita anteriormente para la PCR.
Los procedimientos descritos son valiosos en particular por su simplicidad en comparación con, p. ej., el documento WO 92/02638, debido a que sólo son necesarios dos oligonucleótidos (cebadores) para implementar la amplificación de los ácidos nucleicos, por ejemplo, la PCR. Esto es ventajoso cuando, por ejemplo, segmentos de ácido nucleico conservados se tienen que amplificar para detectar secuencias diana variables, tales como las de los virus, o cuando se tienen que detectar simultáneamente algunos parámetros, p. ej., víricos.
Además, el método que se describe en esta memoria es muy adecuado para la amplificación cuantitativa, puesto que el incremento de la fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de ADN amplificado.
Las realizaciones más preferidas de la invención son procesos que emplean la PCR como método para la amplificación de ácidos nucleicos y en donde el cebador 3' desemparejado se marca con una molécula de colorante atenuable y fluorescente y una molécula de atenuador, en donde al menos una de dichas moléculas está en el extremo 3' desemparejado o próxima al extremo de dicho cebador, en el caso de tener que detectar una diana de ARN, se realiza una transcripción inversa del ARN diana en ADN, antes de la amplificación vía PCR. En el caso de que el ácido nucleico diana sea abundante, es preferible una PCR normal sencilla junto con protocolos conocidos en la técnica, pero empleando un cebador marcado (Ejemplo 2). En caso de desear una alta sensibilidad en la detección de la diana, una primera amplificación con PCR que amplifica la diana empleando cebadores perfectamente emparejados y no marcados puede preceder a una segunda amplificación del ácido nucleico diana mediante una PCR anidada, empleando los cebadores marcados de la invención. Especialmente en la segunda amplificación (PCR anidada) se ha encontrado que la adición de cebador sin marcar con o sin la porción o la cola 3' desemparejada, puede ser ventajosa porque puede volver la amplificación más eficaz y permitir la reducción del cebador marcado.
Los reactivos empleados en los métodos de la invención se pueden empaquetar en equipos de reactivos para diagnóstico. Los equipos de reactivos para diagnóstico incluyen los cebadores marcados en recipientes separados. Si el(los) cebador(es) está(n) sin marcar, los reactivos específicos para el marcador también pueden estar incluidos en el equipo de reactivos. El equipo de reactivos también puede contener otros reactivos empaquetados de forma adecuada y materiales necesarios para la preparación de muestras y la amplificación, por ejemplo, soluciones para extracción del ácido nucleico diana, tampones, dNTPs y/o medios de polimerización y para análisis de detección, por ejemplo, enzimas y agentes de extracción en fase sólida, así como las instrucciones para realizar el ensayo. Otro objeto de la invención son las diversas mezclas de reacción para detectar un ácido nucleico diana en una muestra, útil para los procesos descritos. Las muestras pueden ser fluidos corporales de origen animal o humano, o extractos de cualquier componente corporal de interés. Las muestras preferidas son sangre, plasma o cualquier producto resultante de los mismos.
La invención se ilustra, pero no se limita, con los ejemplos siguientes:
Ejemplo 1
Este ejemplo es para aplicaciones en las que se requiere la mayor sensibilidad posible. En este caso, una primera ronda de amplificación precede a la PCR anidada que contiene el cebador marcado.
Para detectar el ARN del virus de la hepatitis C, lo primero es la extracción del mismo empleando métodos convencionales (por ejemplo, Ishizawa M., Kobayashi Y, Miyamura T, Matsuma, S: "Simple procedure of DNA isolation from human serum". Nucl. Acids Res. 1991; 19:5792, cuya publicación se incorpora en esta memoria como referencia) y el ARN aislado se transcribe posteriormente de forma inversa y se amplifica empleando métodos convencionales (RT-PCR). La amplificación anidada y la reacción de detección se realizan del modo siguiente:
Cinco \mul de 10x tampón ULTma (Tris-HCl 100 mM, pH 8,8, KCl 100 mM, 0,02% de Tween 20, procedente de Perkin-Elmer), 7 \mul de MgCl_{2} 25 mM, 8 \mul de cebador 1 (véase SEQ ID NO:1 de la lista de secuencias) (10 pmol/\mul), 4 \mul de cebador 2 (véase SEQ ID NO:2 de la lista de secuencias) (10 pmol/\mul), 0,25 \mul de cebador 3 (véase SEQ ID NO:3, de la lista de secuencias) (10 pmol/\mul), 2 \mul de dNTPs (10 mM) y 0,5 \mul de la polimerasa de ADN ULTma que posee una función de lectura correctora (Perkin-Elmer, 6 unidades/\mul) se añadieron a 5 \mul de la reacción RT-PCR, después de lo cual, se mezcló todo con 18,25 \mul de agua y se sometió a los siguientes termociclos:
1. Desnaturalización inicial durante 1 minuto a 90º
2. 35 ciclos, cada uno de 28 segundos a 94ºC, para la desnaturalización y 1 minuto a 56ºC para la reasociación y la extensión
3. enfriamiento a 4ºC hasta la valoración.
La reacción de la PCR se evalúa en un espectrómetro de fluorescencia. Para ello, se mide la fluorescencia en la longitud de onda del informador (518 nm para FAM). Se calcula un valor umbral basándose en la fluorescencia de los testigos negativos que no contienen ninguna secuencia diana y se emplea para evaluar valores desconocidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Este ejemplo es para aplicaciones que no requieren la mayor sensibilidad posible. En este caso, la reacción de amplificación aislada contiene el cebador marcado.
Para amplificar el ADN del virus de la hepatitis B a partir de pacientes seropositivos, lo primero es la extracción del mismo empleando métodos convencionales (por ejemplo, Ishizawa M., Kobayashi Y, Miyamura T, Matsuma, S: "Simple procedure of DNA isolation from human serum". Nucl. Acids Res. 1991; 19:5792). La amplificación se realiza del modo siguiente:
Cinco \mul de 10x tampón ULTma (Tris-HCl 100 mM, pH 8,8, KCl 100 mM, 0,02% de Tween 20, procedente de Perkin-Elmer), 7 \mul de MgCl_{2} 25 mM, 8 \mul de cebador 4 (véase SEQ ID NO:4 de la lista de secuencias) (10 pmol/\mul), 4 \mul de cebador 5 (véase SEQ ID NO:5 de la lista de secuencias) (10 pmol/\mul), 0,25 \mul de cebador 6 (véase SEQ ID NO:6, de la lista de secuencias) (10 pmol/\mul), 2 \mul de dNTPs (10 mM) y 0,5 \mul de la polimerasa de ADN ULTma que posee una función de lectura correctora (Perkin-Elmer, 6 unidades/\mul), se añadieron a 5 \mul del ADN extraído (es decir, el ácido nucleico diana), después de lo cual, se mezcló todo con 18,25 \mul de agua y se sometió a los siguientes termociclos:
1. Desnaturalización inicial durante 1 minuto a 90º.
2. 35 ciclos, cada uno de 28 segundos a 94ºC, para la desnaturalización y 1 minuto a 58ºC para la reasociación y la extensión.
3. Enfriamiento a 4ºC hasta la valoración.
La evaluación de los resultados se realiza tal y como se ha descrito para el ejemplo 1.
En ambos ejemplos 1 y 2 el Informador era FAM y el Atenuador era TAMRA.
Leyendas de la Figura 1
La figura describe un ciclo de un procedimiento reivindicado ("Ensayo Taq Woman")
A significa el cebador de avance con su extremo 3' desemparejado
B significa el cebador inverso
R significa la molécula informadora
Q significa la molécula atenuadora
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La denominada reasociación tiene lugar en 1., permaneciendo el extremo 3' desemparejado puesto que no es complementario.
La denominada lectura correctora tiene lugar en 2., en donde la enzima que posee la propiedad de lectura correctora corrige, es decir, escinde el extremo 3' desemparejado.
La denominada elongación de la cadena (fase de elongación) tiene lugar en 3., dicha fase termina en 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Anejo 1
Mezcla^{*} de polimerasa de ADN AccuTaq® LA D 8045 125 unidades
para PCR larga y fiable 500 unidades
1.500 unidades 
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de la polimerasa de ADN AccuTaq LA es un sistema enzimático con dos polimerasas mejoradas para PCR largas de alta precisión. Esta mezcla es una mezcla óptima de la polimerasa de ADN Taq de alto rendimiento de Sigma y una pequeña cantidad de una polimerasa con la actividad 3'\rightarrow5' exonucleasa necesaria para la lectura correctora. Esta formulación consigue rendimientos superiores con una precisión superior (hasta de G.5x) a la de la polimerasa de ADN Taq convencional. Son posibles amplificaciones con la PCR desde 0,25 hasta más de 40 kb. AccuTaq LA es muy adecuada para amplificar moldes de ADN complejo, tales como el ADN genómico humano. Su alta precisión la convierte en la enzima elegida cuando se realizan amplificaciones en las que un pequeño error es decisivo, tales como la RT-PCR y la clonación.
\bullet Mayor exactitud (hasta 6,5x) que la polimerasa convencional de ADN Taq.
\bullet Amplificaciones de hasta 22 kb para moldes de ADN complejos, tales como ADN genómico.
\bullet Amplificaciones de hasta 40 kb para moldes menos complejos, tales como el ADN plasmídico.
\bullet Reacciones más robustas y mayor flexibilidad que los sistemas de alta exactitud de una sola enzima.
\bullet Se incluye un vial de DMSO para mejorar la amplificación de moldes complejos tales como ADN genómico.
\bullet Se proporciona un detallado boletín técnico con los parámetros de la amplificación para ADN de 1-40 kb de longitud. Se administra como 5 unidades/\mul y se emplea como 2,5 unidades/50 \mul de reacción.
Definición de unidad: una unidad incorpora 10 nmol de los dNTPs totales en ADN precipitable en ácido, en 30 minutos a 74ºC.
Almacenamiento: -20ºC
Enviado en hielo húmedo
R: 22.36/37/38 S: 26.36-23
Autorizado bajo el documento de patente de EE.UU. nº 5.438.149 perteneciente a Takara Shuzo Co., Ltd.
\newpage
Boletín técnico Introducción
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)\ding{61} es una técnica potente empleada generalmente para aplicaciones en biología molecular, tales como la clonación, la secuenciación y el cartografiado del genoma. La enzima principal empleada en la PCR es la polimerasa de ADN Taq. La Reacción en Cadena de la Polimerasa que emplea la polimerasa de ADN Taq, se limita generalmente a las amplificaciones de hasta 5 kb, Esto es debido en parte a que la polimerasa de ADN Taq no tiene actividad 3'\rightarrow5' exonucleasa o actividad "de lectura correctora", lo que significa que las incorporaciones erróneas periódicas, no se corrigen. Después de que ha tenido lugar una incorporación errónea, la enzima continuará incorporando nucleótidos provocando un error de deslizamiento, o tendrá lugar un suceso terminal y se detendrá la elongación. Una PCR Larga y Exacta (LA, del inglés "Long and Accurate") combina una polimerasa termoestable y muy procesiva con una segunda polimerasa termoestable que muestra actividad 3'\rightarrow5' exonucleolítica. Esta mezcla incrementa la longitud de los productos de la amplificación empleando la polimerasa con lectura correctora, para corregir las incorporaciones erróneas terminales. Esta corrección permite que la polimerasa continúe con la elongación de la cadena de ADN en crecimiento. La mezcla de la polimerasa AccuTaq LA combina la polimerasa de ADN Taq de alta calidad de Sigma con una pequeña cantidad de una enzima termoestable con actividad correctora. El resultado es una mezcla enzimática que amplifica las dianas genómicas con un exceso de 20 kb. Empleando un molde menos complejo, tal como ADN bacteriano, genómico o vírico, se pueden conseguir amplificaciones de hasta 20 kb o 40 kb, respectivamente. La exactitud de AccuTaq LA es 6,5 veces superior a la de la polimerasa de ADN Taq aislada.
Una amplificación fiable de largas secuencias de ADN requiere: 1) una desnaturalización eficaz del molde de ADN, 2) tiempos de extensión adecuados para producir muchos productos y 3) una protección del ADN diana frente a lesiones por la despurinación. La desnaturalización eficaz se realiza empleando temperaturas más elevadas para periodos de tiempo más cortos o empleando codisolventes, tales como sulfóxido de dimetilo. En algunos casos, los tiempos de extensión se deben incrementar a más de 20 minutos para acomodar los tamaños más largos del ADN diana. El estado del ADN diana es decisivo. La despurinación durante la ciclación se minimiza empleando tampones con un pH superior a 9,0 a 25ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivos proporcionados
\bullet Polimerasa AccuTaq LA, producto nº D 5553 5 unidades/\mul en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Tween 0,5%, IGEPAL CA-630 0,5%, 50% de glicerol proporcionado en 125, 500 y 1500 unidades
\bullet 10X Tampón para la polimerasa de ADN AccuTaq LA, producto nº B0174, 0,5 ml de vial de Tris-HCl 500 mM, sulfato de amonio 150 mM (pH 9,3 ajustado con KOH), MgCl_{2} 25 mM, 1% de Tween 20 proporcionado en 3 viales/125 unidades, 3 viales/500 unidades y 9 viales/1.500 unidades.
\bullet DMSO, producto nº D 8418 proporcionado en 1 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales y reactivos necesarios pero no proporcionados (los números de producto de Sigma se han dado cuando ha sido adecuado)
\bullet Mezcla de desoxinucleótidos, nº de producto D 7295
dATP 10 mM, dCTP 10 mM
dGTP 10 mM, TTP 10 mM
\bullet Agua, producto nº W 174
\bullet Aceite mineral, producto nº M 8662
\bullet Cebadores
\bullet ADN que se va a amplificar
\bullet Pipetas especializadas
\bullet Puntas de pipeta para PCR
\bullet Tubos para microcentrífuga de PCR de pared fina de 0,5 ml
\bullet Ciclador térmico
Precauciones y Advertencias
La mezcla de polimerasas AccuTaq LA de Sigma es únicamente para uso en laboratorio; no para uso en fármacos, uso en el hogar u otros usos. Las declaraciones de advertencia se incluyen en la etiqueta o en la sección de componentes de este boletín, en el caso de que sean aplicables. Además, cuando se emplean ácidos nucleicos marcados radiactivamente, se deben seguir los procedimientos convencionales para el manejo de materiales
radiactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Los parámetros de la amplificación se deben mejorar de forma individual para los cebadores, el molde y el termociclador. Parámetros de ciclación sugeridos (basados en la amplificación en laboratorio de fragmentos de la agrupación génica de la \lambda-globina, procedentes de ADN genómico humano):
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
5. El ADN amplificado se puede evaluar mediante electroforesis en gel de agarosa y una tinción posterior con bromuro de etidio.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento de amplificación para el ADN lambda
Las condiciones óptimas para la concentración de la polimerasa de ADN Taq, el ADN molde, los cebadores y MgCl_{2}, dependerán del sistema que se esté utilizando. Puede ser necesario determinar las condiciones óptimas para cada componente individualmente.
\newpage
1. Añadir los siguientes reactivos a un tubo de microcentrífuga de PCR de 500 \mul de paredes delgadas:
2 
\vskip1.000000\baselineskip
2. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente para recoger todos los componentes del fondo del tubo.
3. Añadir 50 \mul de aceite mineral a la parte superior de cada tubo para evitar la evaporación.
4. Los parámetros de la amplificación se deben mejorar individualmente para los cebadores, el molde y el ciclador térmico. Los parámetros de ciclación sugeridos (basados en la amplificación en nuestro laboratorio del ADN de lambda):
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
5. El ADN amplificado se puede evaluar mediante electroforesis en gel de agarosa y una tinción posterior con bromuro de etidio.
Referencias
Barnes, W.M. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from \lambda bacteriophage templates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2216-2220 (1994).
Cheng, S., y col., Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699 (1994).
Don, R. H., y col. "Touchdown" PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl. Acids Res. 19:4008 (1991).
Erlich, H. A. (compilador) PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification; Stockton Press, Nueva York (1989). (Producto Nº P 3551).
Frey, B. y Suppmann, B. Demonstration fo the Expand^{TM} PCR system's greater fidelity and higher yields with a lacI-based PCR fidelity assay. Biochemica 2:8-9 (1995).
Friezner-Degen, S. J., y col., J. Biol. Chem., 261:6972-6984 (1986).
Griffin, H.G. y Griffin A.M. (compiladores). PCR Technology: Current Innovations, CRC Press, Boca Raton, FL, 1994. (Producto nº Z35, 749-9).
Innis, M.A. y col. (compiladores). PCR Strategies, Academic Press, Nueva York (1995). (Producto nº Z36, 445-2).
Innis, M. y col. (compiladores). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, California (1990). (Producto nº P 8177).
McPherson, M.J. y col. (compiladores). PCR 2: A Practical Approach. IRL Press. Nueva York (1995). (Producto nº Z36, 238-7).
Nelson, y col. The fidelity of TaqPlus^{TM} DNA Polymerase in PCR. Strategies Mol. Biol, 8:24-25 (1995).
Newton, C.R. (compilador). PCR: Essential Data, John Wiley & Sons, Nueva York (1995). (Producto nº Z36, 491-6).
Roux, KH. Optimization and troubleshooting in PCR. PCR Methods Appl. 4:5185-5194 (1995).
Rychlik and Rhoads, Nucl. Acids Res. 17:8543-8551 (1989).
Saiki, R., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton, Nueva York (1989).
Sambrook, J. y col., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989). (Producto nº M 3401).
\ding{61}El procedimiento de la PCR está cubierto por patentes pertenecientes a Hoffman-LaRoche, Inc.
INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip1.000000\baselineskip
SOLICITANTE:
NOMBRE: Centeon Pharma GmbH
CALLE: Emil-von-Behring-Strasse 76
CIUDAD: Marburg
PAÍS: Alemania
CÓDIGO POSTAL: 35041
TELÉFONO: 06421-39-2069
TELEFAX: 06421-39-4558 
\vskip1.000000\baselineskip
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cebador marcado para uso en la detección de ácidos nucleicos diana
\vskip1.000000\baselineskip
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip1.000000\baselineskip
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
TIPO DE MEDIO: Disquete
ORDENADOR: Compatible con PC IBM
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
PROGRAMA: WINWORD 6.0 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD: 21 bases
TIPO: nucleótido
TIPO DE CADENA: monocatenaria
TOPOLOGÍA: lineal 
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
HIPOTÉTICO: No
COMPLEMENTARIO: No
FUENTE ORIGINAL:
ORGANISMO: Virus de la hepatitis C
POSICIÓN EN EL GENOMA:
CARACTERÍSTICAS: región 5' no traducida 
\vskip1.000000\baselineskip
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
^{5'} GCGTCTAGCCATGGCGTTAGT ^{3'} 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD: 29 bases
TIPO: nucleótido
TIPO DE CADENA: monocatenaria
TOPOLOGÍA: lineal 
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
HIPOTÉTICO: No
COMPLEMENTARIO: No
FUENTE ORIGINAL:
ORGANISMO: Virus de la hepatitis C
POSICIÓN EN EL GENOMA:
CARACTERÍSTICAS: región 5' no traducida 
\vskip1.000000\baselineskip
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
^{5'} CCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACTTACT^{3'} 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD: 29 bases
TIPO: nucleótido
TIPO DE CADENA: monocatenaria
TOPOLOGÍA: lineal 
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
HIPOTÉTICO: No
COMPLEMENTARIO: No
FUENTE ORIGINAL:
ORGANISMO: Virus de la hepatitis C
POSICIÓN EN EL GENOMA:
CARACTERÍSTICAS: región 5' no traducida 
\vskip1.000000\baselineskip
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
^{5'}INFORMADOR-CCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACTTACT-ATENUADOR^{3'} 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD: 22 bases
TIPO: nucleótido
TIPO DE CADENA: monocatenaria
TOPOLOGÍA: lineal 
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
HIPOTÉTICO: No
COMPLEMENTARIO: No
FUENTE ORIGINAL:
ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
POSICIÓN EN EL GENOMA:
CARACTERÍSTICAS: gen de la nucleocápsida 
\vskip1.000000\baselineskip
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
^{5'} AATCCACACTCCGAAAGACACC ^{3'} 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD: 20 bases
TIPO: nucleótido
TIPO DE CADENA: monocatenaria
TOPOLOGÍA: lineal 
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
HIPOTÉTICO: No
COMPLEMENTARIO: No
FUENTE ORIGINAL:
ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
POSICIÓN EN EL GENOMA:
CARACTERÍSTICAS: región de la prenucleocápsida 
\vskip1.000000\baselineskip
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
^{5'} GCCTCCAAGCTGTGCCTTGG ^{3'} 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD: 24 bases
TIPO: nucleótido
TIPO DE CADENA: monocatenaria
TOPOLOGÍA: lineal 
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
HIPOTÉTICO: No
COMPLEMENTARIO: No
FUENTE ORIGINAL:
ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
POSICIÓN EN EL GENOMA:
CARACTERÍSTICAS: región de la prenucleocápsida 
\vskip1.000000\baselineskip
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
^{5'}INFORMADOR-GCCTCCAAGCTGTGCCTTGGTGAA-ATENUADOR^{3'} 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Centeon Pharma GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Emil-von-Behring-Strasse 76
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Marburg
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 35041
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cebador marcado para uso en la detección de ácidos nucleicos diana
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Centeon Pharma GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: P.O. Box 12 30
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD : Marburg
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 35002
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: Microsoft Word 6.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 98123569.0
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-12-98
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 19755642.6 (DE)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-12-97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 19806850.6 (DE)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-02-99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 19834913.0 (DE)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-08-98
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 06421-39-2069
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 06421-39-4558
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
COMPLEMENTARIO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: región 5' no traducida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGTCTAGCCATGGCGTTAGT 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
COMPLEMENTARIO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: región 5' no traducida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACTTACT 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
COMPLEMENTARIO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: región 5' no traducida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACAAGGCCTTTCGCGACCCAACTTACT 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xii)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xiii)
COMPLEMENTARIO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: gen de la nucleocápsida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATCCACACTCCGAAAGACACC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xiv)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xv)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xvi)
COMPLEMENTARIO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: región de la prenucleocápsida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCTCCAAGCTGTGCCTTGG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xvii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xvii)
HIPOTÉTICO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xix)
COMPLEMENTARIO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la hepatitis B
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: región de la prenucleocápsida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCTCCAAGCTGTGCCTTGGTGAA 
\hfill
24

Claims (12)

1. Un procedimiento para detectar la presencia de un ácido nucleico diana en una muestra que comprende ADN monocatenario, comprendiendo dicho procedimiento
(a) poner en contacto dicha muestra con un cebador de avance y/o inverso,
en donde al menos un cebador es portador de una parte de un sistema de marcación en la porción 3' terminal del cebador y en donde dicho cebador se selecciona de modo que al menos uno, preferentemente al menos de dos a cinco o más nucleótidos últimos en el extremo 3' del cebador no son complementarios a la secuencia de ácido nucleico que se va a detectar para crear-formar una mezcla de estructuras dobles durante las condiciones de hibridación con el cebador de avance y/o inverso hibridado a cada una de las secuencias de ADN complementario del ácido nucleico diana, en caso de estar presente;
(b) mantener la mezcla de la etapa (a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la matriz que tenga la actividad correctora de 3' a 5' o una mezcla de enzimas que tenga esta actividad correctora con condiciones que sean suficientes para permitir la actividad nucleasa de 3' a 5' de dicha polimerasa o de dicha mezcla de enzimas, para escindir la porción desemparejada en 3' del cebador hibridado, liberando de este modo el marcador o una parte del sistema de marcación;
(c) detectar y/o medir la liberación del marcador o parte del sistema de marcación.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico diana se amplifica y de este modo se libera más marcador o parte de un sistema de marcación.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que la liberación del marcador es directamente proporcional a la cantidad de ADN amplificado.
4. Un procedimiento según la reivindicación 2 o 3, en el que la amplificación se realiza mediante PCR, opcionalmente mediante RT-PCR en caso de que el ácido nucleico diana sea ARN.
5. Un procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador es una pareja de moléculas informadora-atenuadora, ligada a las regiones de los extremos 3'-terminal y 5'-terminal del cebador de avance y/o del cebador inverso.
6. Un procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores en el que la molécula informadora está sobre la parte desemparejada en 3' del cebador y la molécula atenuadora en la parte emparejada de dicho cebador, a una distancia adecuada de la molécula informadora.
7. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que la molécula atenuadora está en la parte 3' desemparejada del cebador y la molécula informadora en la parte emparejada de dicho cebador, a una distancia adecuada de la molécula informadora, preferentemente en el extremo 5'.
8. Un procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha polimerasa de ácido nucleico o dicha mezcla de enzimas son termoestables.
9. Un procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde una variedad de dianas de ácido nucleico es detectada simultáneamente mediante selección de los cebadores correspondientes, en donde al menos un cebador para cada una de las dianas es portador de un marcador o es parte de un sistema de marcación en la porción 3' terminal del cebador.
10. Un procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra es fluido corporal humano o animal, siendo preferentemente plasma.
11. Un equipo de reactivos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra que comprende cebadores marcados empleados en los procedimientos de las reivindicaciones 1 a 10 y una polimerasa de ácido nucleico adecuada que tiene una actividad de lectura correctora 3' a 5' o una mezcla de enzimas que tienen dicha actividad de lectura correctora.
12. Un equipo de reactivos según la reivindicación 10, en donde los cebadores detectas ácidos nucleicos víricos diana.
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Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020188268A1 (en) 1999-06-30 2002-12-12 Mark James Kline Elastomeric side panel for use with convertible absorbent articles
AU5882000A (en) 1999-06-22 2001-01-09 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US20070134686A1 (en) * 1999-10-29 2007-06-14 Stratagene California Methods and compositions for detection of a target nucleic acid sequence utilizing a probe with a 3' flap
US7094532B2 (en) * 1999-12-29 2006-08-22 Vanderbilt University Genetic mutation underlying orthostatic intolerance and diagnostic and therapeutic methods relating thereto
FI20000333A0 (fi) 2000-02-16 2000-02-16 Jussi Nurmi Homogeeninen menetelmä polynukleotidin havaitsemiseksi
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
EP1353936A4 (en) * 2000-12-27 2005-05-18 Invitrogen Corp PRIMER AND METHOD FOR THE DETECTION AND DISTINCTION OF NUCLEIC ACIDS
KR20020089746A (ko) * 2001-05-24 2002-11-30 주식회사 커벡스 크기변형유도 앵커 시발체, 이를 이용한 알티-피씨알 방법및 이를 이용한 진단 방법
WO2003008643A2 (en) * 2001-07-20 2003-01-30 Cancer Research Technology Limited Methods and polynukleotides for assaying the activity of a dna modifying enzyme
FR2829148B1 (fr) * 2001-09-06 2004-10-15 Univ Aix Marseille Ii Identification moleculaire des bacteries du genre staphylococcus
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
WO2003046208A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Mj Bioworks Incorporated Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction
GB0200526D0 (en) * 2002-01-11 2002-02-27 Science And Technology The Methods
US6818420B2 (en) 2002-02-27 2004-11-16 Biosource International, Inc. Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
EP1485056B1 (en) * 2002-02-27 2011-04-06 Life Technologies Corporation Methods of using fet labeled oligonucleotides that include a'5' exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
CN1414110A (zh) * 2002-08-19 2003-04-30 张旭 利用具有3'至5'外切酶活性的多聚酶进行基因序列分析
AU2004230569B2 (en) 2003-03-31 2007-12-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detecting certain flaviviruses, including members of the Japanese encephalitis virus serogroup
EP1502958A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-02 Roche Diagnostics GmbH New detection format for hot start real time polymerase chain reaction
US8304189B2 (en) 2003-12-01 2012-11-06 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
GB0406015D0 (en) * 2004-03-17 2004-04-21 Dynal Biotech Asa Improvements in magnetic polymer particles
US7445898B2 (en) 2004-04-01 2008-11-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Quantitative amplification with a labeled probe and 3′ to 5′ exonuclease activity
CA2502549C (en) * 2004-04-23 2016-02-16 Becton, Dickinson And Company Use of an extraction control in a method of extracting nucleic acids
US20060105348A1 (en) * 2004-11-15 2006-05-18 Lee Jun E Compositions and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US20060275792A1 (en) * 2004-11-15 2006-12-07 Lee Jun E Enhancement of nucleic acid amplification using double-stranded DNA binding proteins
CA2579918A1 (en) * 2005-06-16 2006-12-28 Biotools Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. Nucleic acid detection method involving the direct generation of a measurable signal
DK2292788T3 (da) 2005-06-23 2012-07-23 Keygene Nv Strategier til identifikation og detektion af polymorfismer med højt gennemløb
US10316364B2 (en) 2005-09-29 2019-06-11 Keygene N.V. Method for identifying the source of an amplicon
CA2910861C (en) 2005-09-29 2018-08-07 Michael Josephus Theresia Van Eijk High throughput screening of mutagenized populations
US7781165B2 (en) 2005-10-19 2010-08-24 Roche Diagnostics Operations, Inc. Benzimidazolium compounds and salts of benzimidazolium compounds for nucleic acid amplification
DK2789696T3 (en) 2005-12-22 2016-02-29 Keygene Nv A method for high-throughput AFLP-based polymorphism
CN103172700B (zh) 2006-02-27 2014-12-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 经由镁螯合的pcr热启动
GB0605584D0 (en) * 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
EP2963127B1 (en) 2006-04-04 2017-08-16 Keygene N.V. High throughput detection of molecular markers based on restriction fragments
ES2650066T3 (es) * 2008-05-28 2018-01-16 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Cebador y sonda para la detección de Mycobacterium intracellulare, y método para la detección de Mycobacterium intracellulare empleando el cebador o la sonda
US9447457B2 (en) * 2009-09-24 2016-09-20 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by cyclic exonucleolytic reactions
AU2010315399B2 (en) * 2009-10-27 2016-01-28 Swift Biosciences, Inc. Bimolecular primers
KR20110050327A (ko) * 2009-11-07 2011-05-13 주식회사 씨젠 Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출
EP2516679B1 (en) * 2009-12-21 2017-08-23 Seegene, Inc. Tsg primer target detection
GB201004292D0 (en) * 2010-03-15 2010-04-28 Olink Ab Assay for localised detection of analytes
GB201011971D0 (en) 2010-07-15 2010-09-01 Olink Ab Methods and product
WO2012049316A1 (en) 2010-10-15 2012-04-19 Olink Ab Dynamic range methods
GB201101621D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Olink Ab Method and product
GB201107863D0 (en) 2011-05-11 2011-06-22 Olink Ab Method and product
EP2559774A1 (en) 2011-08-17 2013-02-20 Roche Diagniostics GmbH Improved method for amplification of target nucleic acids using a multi-primer approach
GB201201547D0 (en) 2012-01-30 2012-03-14 Olink Ab Method and product
EP2823065A4 (en) * 2012-03-09 2016-03-02 Insight Genetics Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF RECEPTORT SYROSINE KINASE-CONCERNED CANCER DISORDERS
US10174366B2 (en) 2012-11-14 2019-01-08 Olink Bioscience Ab Localised RCA-based amplification method
EP2920320B1 (en) 2012-11-14 2016-12-28 Olink Bioscience AB Rca reporter probes and their use in detecting nucleic acid molecules
US20140341884A1 (en) * 2012-12-04 2014-11-20 Roche Molecular Systems, Inc. Novel Complex Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Kinase Domain
JP2016509480A (ja) 2013-01-24 2016-03-31 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 発色団に基づく特徴づけおよび検出方法
US10113201B2 (en) * 2013-04-05 2018-10-30 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for diagnosis of glioblastoma or a subtype thereof
GB201320145D0 (en) 2013-11-14 2014-01-01 Olink Ab Localised RCA-based amplification method using a padlock-probe
US20150153346A1 (en) * 2013-11-15 2015-06-04 The Regents Of The University Of Michigan Lung cancer signature
GB201401885D0 (en) 2014-02-04 2014-03-19 Olink Ab Proximity assay with detection based on hybridisation chain reaction (HCR)
JP2018504891A (ja) * 2014-12-31 2018-02-22 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ リアルタイムＰＣＲによる細胞溶解物からのＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ定量化のための新規ハイスループット法
GB201518655D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Olink Ab Method for generating proximity probes
WO2017132139A1 (en) * 2016-01-25 2017-08-03 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions for predicting a colon cancer subtype
GB201621514D0 (en) 2016-12-16 2017-02-01 Q-Linea Ab Padlock probe detection method
WO2019068880A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Cartana Ab RNA MATRIX LIGATION
US20190112636A1 (en) * 2017-10-16 2019-04-18 ChromaCode, Inc. Methods and compositions for nucleic acid detection
CN109694905A (zh) * 2019-01-29 2019-04-30 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 检测待测基因甲基化的核酸组合物及其试剂盒和待测基因甲基化的检测方法
GB201919032D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Cartana Ab Method of detecting an analyte
GB201919029D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Cartana Ab Method of detecting an analyte

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5358990A (en) 1989-03-21 1990-10-22 Collaborative Research Inc. Multiplex dna diagnostic test
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5804380A (en) * 1993-11-12 1998-09-08 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5716784A (en) * 1996-02-05 1998-02-10 The Perkin-Elmer Corporation Fluorescence detection assay for homogeneous PCR hybridization systems

Also Published As

Publication number Publication date
JP4331812B2 (ja) 2009-09-16
KR100702338B1 (ko) 2008-03-19
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CA2255531A1 (en) 1999-06-15
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DE69838210T2 (de) 2008-05-15
CA2255531C (en) 2007-11-13
EP0930370A1 (en) 1999-07-21
AU9708898A (en) 1999-07-01
ATE369439T1 (de) 2007-08-15

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