CN109694905A - 检测待测基因甲基化的核酸组合物及其试剂盒和待测基因甲基化的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测待测基因甲基化的核酸组合物及其试剂盒和待测基因甲基化的检测方法。该核酸组合物包括用于扩增待测基因中甲基化片段的扩增引物对；扩增引物对的正向引物从5’端到3’端包括正向识别片段与正向匹配片段，正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，正向匹配片段能够与甲基化片段的正义链互补配对，正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团；扩增引物对的反向引物从5’端到3’端包括反向识别片段与反向匹配片段，反向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，反向匹配片段能够与甲基化片段的反义链互补配对，反向引物的两端分别连接有反向荧光基团和反向猝灭基团。上述核酸组合物的敏感度较高。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，特别是涉及一种检测待测基因甲基化的核酸组合物及其试剂盒和待测基因甲基化的检测方法。
背景技术
肺癌的发生已成为威胁居民生命的恶性疾病，其发病率持续攀升而治疗效果往往不尽人意，因此加强癌症的早期诊断、治疗、预后等方面的研究至关重要。目前肺癌的筛查和诊断主要依赖影像学检查和组织细胞学检查，此外肿瘤分子标志物在肺癌的辅助诊断中也发挥重要作用。但是细胞学检查和X线胸片检查的敏感度偏低。
DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化是DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要原因。通过检测肿瘤相关基因的甲基化以对肿瘤进行筛查和诊断，能够一定程度提高检测的敏感度，但仍然不能满足实际需求。
发明内容
基于此，有必提供一种敏感度较高的检测待测基因甲基化的核酸组合物。
此外，还有必要提供一种检测待测基因甲基化的试剂盒和待测基因甲基化的检测方法。
一种检测待测基因甲基化的核酸组合物，包括用于扩增待测基因中甲基化片段的扩增引物对；
所述扩增引物对的正向引物从5’端到3’端包括正向识别片段与正向匹配片段，所述正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，所述正向匹配片段能够与所述甲基化片段的正义链互补配对，所述正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团；
所述扩增引物对的反向引物从5’端到3’端包括反向识别片段与反向匹配片段，所述反向识别片段能够特异性识别所述核酸内切酶，所述反向匹配片段能够与所述甲基化片段的反义链互补配对，所述反向引物的两端分别连接有反向荧光基团和反向猝灭基团。
上述检测待测基因甲基化的核酸组合物包括用于扩增待测基因中甲基化片段的扩增引物对，扩增引物对的正向引物从5’端到3’端包括正向识别片段与正向匹配片段，正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，正向匹配片段能够与甲基化片段的正义链互补配对，正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团，使得正向引物不仅能够扩增甲基化片段，还能够作为探针，在核酸内切酶的作用下使得正向荧光基团和正向猝灭基团分离，以提供荧光信号而对待测基因的甲基化片段进行检测；同样地，扩增引物对的反向引物从5’端到3’端包括反向识别片段与反向匹配片段，反向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，反向匹配片段能够与甲基化片段的反义链互补配对，反向引物的两端分别连接有反向荧光基团和反向猝灭基团，使得反向引物不仅能够扩增甲基化片段，还能够作为探针，在核酸内切酶的作用下使得反向荧光基团和反向猝灭基团分离，以提供荧光信号而对待测基因的甲基化片段进行检测。上述检测待测基因甲基化的核酸组合物能够有效地检测待测基因的甲基化情况，敏感度较高，特异性较强。经试验验证，采用上述检测待测基因甲基化的核酸组合物对60例样本进行检测，敏感度为90％，特异性为100％。
其中一个实施例中，所述核酸内切酶为PspGI核酸内切酶；
及/或，所述待测基因为hOGG1基因启动子序列。
其中一个实施例中，所述正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID No.2所示。
其中一个实施例中，所述正向引物的3’端连接有所述正向荧光基团，所述正向引物的5’端连接有所述正向猝灭基团；
及/或，所述反向引物的3’端连接有所述反向荧光基团，所述反向引物的5’端连接有所述反向猝灭基团。
其中一个实施例中，还包括用于扩增甲基化内参基因的内参正向引物和内参反向引物；
所述内参正向引物从5’端到3’端包括内参正向识别片段与内参正向匹配片段，所述内参正向识别片段能够特异性识别所述核酸内切酶，所述内参正向匹配片段能够与所述甲基化内参基因的正义链互补配对，所述内参正向引物的两端分别连接有内参正向荧光基团和内参正向猝灭基团；
所述内参反向引物从5’端到3’端包括内参反向识别片段与内参反向匹配片段，所述内参反向识别片段能够特异性识别所述核酸内切酶，所述内参反向匹配片段能够与所述甲基化内参基因的反义链互补配对，所述内参反向引物的两端分别连接有内参反向荧光基团和内参反向猝灭基团。
其中一个实施例中，所述内参基因为U6、GAPDH或β-actin。
其中一个实施例中，所述内参正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，所述内参反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。
一种检测待测基因甲基化的试剂盒，包括上述检测待测基因甲基化的核酸组合物。
其中一个实施例中，还包括核酸内切酶。
一种待测基因甲基化的检测方法，包括如下步骤：
对待测DNA进行亚硫酸盐处理，得到处理后基因；及
采用扩增引物对对所述处理后基因进行荧光定量PCR扩增，根据反应结果进行检测分析，其中，所述扩增引物对用于扩增所述待测DNA中甲基化片段；所述扩增引物对的正向引物从5’端到3’端包括正向识别片段与正向匹配片段，所述正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，所述正向匹配片段能够与所述甲基化片段的正义链互补配对，所述正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团；所述扩增引物对的反向引物从5’端到3’端包括反向识别片段与反向匹配片段，所述反向识别片段能够特异性识别所述核酸内切酶，所述反向匹配片段能够与所述甲基化片段的反义链互补配对，所述反向引物的两端分别连接有反向荧光基团和反向猝灭基团。
附图说明
图1为一实施方式的待测基因甲基化的检测方法对甲基化样本和非甲基化样本进行检测的原理对比图；
图2为实施例3中实验组与对照组对待测样品进行检测的对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究提供一实施方式的检测待测基因甲基化的核酸组合物，能够有效地检测待测基因的甲基化情况，敏感度较高，特异性较强。具体地，该核酸组合物包括用于扩增待测基因中甲基化片段的扩增引物对。
在其中一个实施例中，扩增引物对的正向引物从5’端到3’端包括正向识别片段与正向匹配片段。正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶。正向匹配片段能够与甲基化片段的正义链互补配对。正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团。
TaqMan荧光探针法中，增加一对引物的同时，加入一个特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，一端标记为荧光报告基团，另一端标记荧光猝灭基团。当进行PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，导致荧光报告基团与荧光猝灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。然而探针的引入会增加设计的复杂性，若探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，需要验证效果，探针的合成成本较高，且可能无法检测出杂合甲基化。上述实施方式的设置，使得正向引物不仅能够扩增甲基化片段，还能够作为探针，在核酸内切酶的作用下使得正向荧光基团和正向猝灭基团分离，以提供荧光信号而对待测基因的甲基化片段进行检测，设计简单，无需额外合成探针，节省成本。
在一个具体示例中，待测基因为hOGG1基因启动子序列。进一步地，hOGG1基因启动子序列如SEQ ID No.5所示。
具体地，如SEQ ID No.5所示序列为：5’-CGGATTGGCTACCTCTAGGTGAAATGAGCGGTGGTTGAGCCCTACTTCC GGTGGTGCTGT-3’。
研究发现，hOGG1基因启动子甲基化在肺癌(NSCLC)中频繁发生的情况，尤其是在NSCLC(nonsmall-cell lung cancer，非小细胞(型)肺癌)中hOGG1基因启动子甲基化情况更加频繁，通过检测外周血单核细胞的hOGG1基因甲基化水平，发现甲基化的hOGG1基因携带者发展为NSCLC的几率是非甲基化hOGG1基因携带者的2.25倍，因此通过对外周血单核细胞的hOGG1基因启动子甲基化水平的检测能够有效预测特定人群早期肺癌发病风险。
在其中一个实施例中，核酸内切酶为热稳定的核酸内切酶。传统的甲基化检测技术中，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA处理后，设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行目的基因片段扩增，扩增产物通过电泳检测，如果用甲基化引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；如果用非甲基化引物能得到扩增片段，说明被检测的位点没有发生甲基化。然而，传统的甲基化检测技术为了扩增到PCR产物，不得不降低退火温度，导致形成许多非特异性产物，并且随着退火温度的降低，该方法可靠性也随之下降。本研究通过选择热稳定的核酸内切酶，使得在检测过程中无需降低退火温度既能够有效地检测待测基因的甲基化，从而降低非特异性产物的形成，提高检测结果的可靠性。
在一个具体示例中，核酸内切酶为PspGI核酸内切酶。PspGI核酸内切酶能够在95℃条件下具有2个小时半衰期，能够在PCR反应过程中保持活性，减少了退火过程中非特异性产物的形成，使结果更加可靠。
在一个具体示例中，扩增引物对的正向引物的序列如SEQ ID No.1所示。具体地，如SEQ ID No.1所示序列为：5’-TTTCCAGGTTTGACGGACAGCCCTGAGGAACCG-3’。
在其中一个实施例中，正向引物的3’端连接有正向荧光基团，正向引物的5’端连接有正向猝灭基团。通过在正向引物的5’端连接正向猝灭基团，使得在扩增过程中，正向识别位点被核酸内切酶识别而被切断，以使正向猝灭基团与正向荧光基团分离而发出荧光。具体地，正向荧光基团为FAM，正向猝灭基团为MGB。
需要说明的是，正向荧光基团不限于FAM，可以为其他荧光基团，例如可以为CY5或JOE。需要说明的是，正向猝灭基团不限于MGB，可以为其他猝灭基团，例如可以为CY5或JOE。
在其中一个实施例中，扩增引物对的反向引物从5’端到3’端包括反向识别片段与反向匹配片段。反向识别片段能够特异性识别核酸内切酶。反向匹配片段能够与甲基化片段的反义链互补配对。反向引物的两端分别连接有反向荧光基团和反向猝灭基团。
上述设置，使得反向引物不仅能够扩增甲基化片段，还能够作为探针，在核酸内切酶的作用下使得反向荧光基团和反向猝灭基团分离，以提供荧光信号而对待测基因的甲基化片段进行检测。
在一个具体示例中，扩增引物对的反向引物的序列如SEQ ID No.2示。具体地，如SEQ ID No.2示序列为：5’-TTTCCAGGTTTCGCCCCCTCCTTGCGACTTATC-3’。
在其中一个实施例中，反向引物的3’端连接有反向荧光基团，反向引物的5’端连接有反向猝灭基团。通过在反向引物的5’端连接反向猝灭基团，使得在扩增过程中，反向识别位点被核酸内切酶识别而被切断，以使反向猝灭基团与反向荧光基团分离而发出荧光。具体地，反向荧光基团为FAM，反向猝灭基团为MGB。
需要说明的是，反向荧光基团不限于FAM，可以为其他荧光基团，例如可以为CY5或JOE。需要说明的是，反向猝灭基团不限于MGB，可以为其他猝灭基团，例如可以为BHQ或DABCYL。
在其中一个实施例中，核酸组合物还包括用于扩增甲基化内参基因的内参正向引物和内参反向引物。进一步地，内参基因为U6、GAPDH或β-actin。在一个具体示例中，内参基因为β-actin。
在其中一个实施例中，内参正向引物从5’端到3’端包括内参正向识别片段与内参正向匹配片段。内参正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶。内参正向匹配片段能够与甲基化内参基因的正义链互补配对。内参正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团。
在一个具体示例中，内参正向引物的序列如SEQ ID No.3所示。具体地，如SEQ IDNo.3所示的序列为：5’-TTTCCAGGTTTTGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’。
在其中一个实施例中，内参正向引物的3’端连接有内参正向荧光基团，内参正向引物的5’端连接有内参正向猝灭基团。具体地，内参正向荧光基团为FAM，内参正向猝灭基团为MGB。
需要说明的是，内参正向荧光基团不限于FAM，可以为其他荧光基团，例如可以为CY5或JOE。需要说明的是，内参正向猝灭基团不限于MGB，可以为其他猝灭基团，例如可以为BHQ或DABCYL。
在其中一个实施例中，内参反向引物从5’端到3’端包括内参反向识别片段与内参反向匹配片段。内参反向识别片段能够特异性识别核酸内切酶。内参反向匹配片段能够与甲基化内参基因的反义链互补配对。内参反向引物的两端分别连接有内参反向荧光基团和内参反向猝灭基团。
在一个具体示例中，内参反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。具体地，如SEQ IDNo.4所示的序列为：5’-TTTCCAGGTTTAACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’。
在其中一个实施例中，内参反向引物的3’端连接有内参反向荧光基团，内参反向引物的5’端连接有内参反向猝灭基团。具体地，内参反向荧光基团为FAM，内参反向猝灭基团为MGB。
需要说明的是，内参反向荧光基团不限于FAM，可以为其他荧光基团，例如可以为CY5或JOE。需要说明的是，内参反向猝灭基团不限于MGB，可以为其他猝灭基团，例如可以为BHQ或DABCYL。
上述检测待测基因甲基化的核酸组合物进行甲基化检测的原理为：将核酸内切酶加入到实时荧光定量PCR反应中，当用于扩增待测基因的甲基化片段的扩增引物对与待测基因的甲基化片段结合并扩增后，核酸内切酶便可以特异性识别切割正向识别片段或反向识别片段，使得猝灭基团与荧光基团分离而产生实时荧光信号，以对待测基因的甲基化进行定量定性检测。
上述检测待测基因甲基化的核酸组合物包括用于扩增待测基因中甲基化片段的扩增引物对，扩增引物对的正向引物从5’端到3’端包括正向识别片段与正向匹配片段，正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，正向匹配片段能够与甲基化片段的正义链互补配对，正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团，使得正向引物不仅能够扩增甲基化片段，还能够作为探针，在核酸内切酶的作用下使得正向荧光基团和正向猝灭基团分离，以提供荧光信号而对待测基因的甲基化片段进行检测；同样地，扩增引物对的反向引物从5’端到3’端包括反向识别片段与反向匹配片段，反向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，反向匹配片段能够与甲基化片段的反义链互补配对，反向引物的两端分别连接有反向荧光基团和反向猝灭基团，使得反向引物不仅能够扩增甲基化片段，还能够作为探针，在核酸内切酶的作用下使得反向荧光基团和反向猝灭基团分离，以提供荧光信号而对待测基因的甲基化片段进行检测。上述检测待测基因甲基化的核酸组合物能够有效地检测待测基因的甲基化情况，敏感度较高，特异性较强。经试验验证，采用上述检测待测基因甲基化的核酸组合物对60例样本进行检测，敏感度为90％，特异性为100％。
上述核酸组合物中，正向识别位点或反向识别位点能够被热稳定性核酸内切酶PspGI特异性识别，使得无需降低退化温度即可对待测样品的甲基化进行检测，降低非特异性扩增，提高检测结果的可靠性。
上述核酸组合物中正向引物和反向引物均既可以作为引物，又可以作为探针，能够同时检测多个CpG位点的甲基化情况，定量分析基因启动子区CpG岛每个CpG位点的甲基化水平，无需引入荧光探针，减少了设计和操作的难度，降低了检测成本。
此外，本研究还提供一实施方式的检测待测基因甲基化的试剂盒，能够检测待测基因的甲基化情况，检测敏感度高，特异性强。具体地，该试剂盒包括上述检测待测基因甲基化的核酸组合物。
在其中一个实施例中，试剂盒还包括核酸内切酶。进一步地，核酸内切酶为热稳定的核酸内切酶。具体地，核酸内切酶为PspGI核酸内切酶。
在其中一个实施例中，试剂盒还包括提取试剂。提取试剂用于提取待测样本中待测基因。
在其中一个实施例中，待测样本为外周血、血浆或者实验用血液样本。
在其中一个实施例中，试剂盒还包括亚硫酸盐转化试剂。亚硫酸盐转化试剂用于将待测基因DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，最后得到Bis-DNA。通过将待测基因DNA中的胞嘧啶(C)可转化为尿嘧啶(U)，而5-甲基胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶的概率极低，因此，经亚硫酸氢盐处理后的DNA样本中的胞嘧啶只能来至于5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化后，由于5-甲基胞嘧啶的存在并不影响碱基的配对，因此相较于传统的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)扩增过程会丢失甲基化信息，通过亚硫酸盐转化能够有效地保留DNA甲基化信息。
在其中一个实施例中，试剂盒还包括PCR反应液、阳性质控品以及阴性质控品中的至少一种。
进一步地，PCR反应液包括dNTPs、Taq酶、Mg2+。
阳性质控品为人工合成的甲基化片段。更进一步地，阳性质控品的序列如如SEQID No.8所示。具体地，如SEQ ID No.8所示的序列为：5’-GACGGATAGTTTTGAGGAATCGCGTATCACCATTGCGCGTTTTA-3’。
阴性质控品为人工合成的非甲基化片段。更进一步地，阴性质控品的序列如SEQID No.9所示。具体地，如SEQ ID No.9所示的序列为：5’-TGCCCGTCCTTTTCGCGAACCTCGCCGGCGCCGGTCTCCGTATC-3’。
上述检测待测基因甲基化的试剂盒能够有效地检测待测基因的甲基化情况，敏感度较高，特异性较强。
此外，本研究还提供一实施方式的待测基因甲基化的检测方法，能够对待测基因的甲基化情况进行检测，检测敏感度高，特异性强，有利于对待测基因甲基化情况进行研究。例如：可以检测低甲基化饮食或高甲基化饮食对体内基因组甲基化水平的影响，具体如高甲基化饮食的孕妇比正常饮食的孕妇所生婴儿体内基因组的甲基化程度更高。
在一个具体示例中，待测基因为hOGG1基因启动子序列。进一步地，hOGG1基因启动子序列如SEQ ID No.5所示。
具体地，如SEQ ID No.5所示序列为：5’-CGGATTGGCTACCTCTAGGTGAAATGAGCGGTGGTTGAGCCCTACTTCCGGTGGTGCTGT-3’。
具体地，上述检测方法包括如下步骤S110～S120：
S110、对待测DNA进行亚硫酸盐处理，得到处理后基因。
通过亚硫酸盐处理使得待测DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，最后得到Bis-DNA。
在其中一个实施例中，对待测DNA进行亚硫酸盐处理的步骤包括：将待测DNA与亚硫酸盐溶液混合，置于温度循环变温器中并按照以下条件：98℃10min、64℃1.5h、4℃(≦20h)进行反应，得到处理后基因。
在其中一个实施例中，在对待测DNA进行亚硫酸盐处理的步骤之前，还包括提取待测DNA的步骤。
S120、采用扩增引物对对处理后基因进行荧光定量PCR扩增，根据反应结果进行检测分析。
在其中一个实施例中，扩增引物对的正向引物从5’端到3’端包括正向识别片段与正向匹配片段。正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶。正向匹配片段能够与所述甲基化片段的正义链互补配对。正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团。
在其中一个实施例中，核酸内切酶为热稳定的核酸内切酶。在一个具体示例中，核酸内切酶为PspGI核酸内切酶。
在一个具体示例中，扩增引物对的正向引物的序列如SEQ ID No.1所示。具体地，如SEQ ID No.1所示序列为：5’-TTTCCAGGTTTGACGGACAGCCCTGAGGAACCG-3’。
在其中一个实施例中，正向引物的3’端连接有正向荧光基团，正向引物的5’端连接有正向猝灭基团。具体地，正向荧光基团为FAM，正向猝灭基团为MGB。
在其中一个实施例中，扩增引物对的反向引物从5’端到3’端包括反向识别片段与反向匹配片段。反向识别片段能够特异性识别核酸内切酶。反向匹配片段能够与甲基化片段的反义链互补配对。反向引物的两端分别连接有反向荧光基团和反向猝灭基团。
在一个具体示例中，扩增引物对的反向引物的序列如SEQ ID No.2示。具体地，如SEQ ID No.2示序列为：5’-TTTCCAGGTTTCGCCCCCTCCTTGCGACTTATC-3’。
在其中一个实施例中，反向引物的3’端连接有反向荧光基团，反向引物的5’端连接有反向猝灭基团。具体地，反向荧光基团为FAM，反向猝灭基团为MGB。
在一个具体示例中，进行荧光定量PCR扩增的反应体系为：总体积25μL，1μL的Taq酶、0.5μL的dNTP、1μL的Mg2+、7μL的5X buffer、1μL的正向引物、1μL的反向引物、2μL的样本DNA、2μL的核酸内切酶、10.5μLddH2O(即双蒸水)。
在一个具体示例中，进行荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃10min；95℃15s，58℃1min，45个循环。
在其中一个实施例中，S120的步骤包括S121～S123：
S121、采用扩增引物对对处理后基因进行荧光定量PCR扩增，获得待测DNA的扩增曲线和Ct值。
S122、采用内参正向引物和内参反向引物对甲基化内参基因进行荧光定量PCR扩增，获得内参基因的扩增曲线和Ct值。
在其中一个实施例中，内参基因为U6、GAPDH或β-actin。在一个具体示例中，内参基因为β-actin。
在其中一个实施例中，内参正向引物从5’端到3’端包括内参正向识别片段与内参正向匹配片段。内参正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶。内参正向匹配片段能够与甲基化内参基因的正义链互补配对。内参正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团。
在一个具体示例中，内参正向引物的序列如SEQ ID No.3所示。具体地，如SEQ IDNo.3所示的序列为：5’-TTTCCAGGTTTTGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’。
在其中一个实施例中，内参正向引物的3’端连接有内参正向荧光基团，内参正向引物的5’端连接有内参正向猝灭基团。具体地，内参正向荧光基团为FAM，内参正向猝灭基团为MGB。
需要说明的是，内参正向荧光基团不限于FAM，可以为其他荧光基团，例如可以为CY5或JOE。需要说明的是，内参正向猝灭基团不限于MGB，可以为其他猝灭基团，例如可以为BHQ或DABCYL。
在其中一个实施例中，内参反向引物从5’端到3’端包括内参反向识别片段与内参反向匹配片段。内参反向识别片段能够特异性识别核酸内切酶。内参反向匹配片段能够与甲基化内参基因的反义链互补配对。内参反向引物的两端分别连接有内参反向荧光基团和内参反向猝灭基团。
在一个具体示例中，内参反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。具体地，如SEQ IDNo.4所示的序列为：5’-TTTCCAGGTTTAACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’。
在其中一个实施例中，内参反向引物的3’端连接有内参反向荧光基团，内参反向引物的5’端连接有内参反向猝灭基团。具体地，内参反向荧光基团为FAM，内参反向猝灭基团为MGB。
需要说明的是，内参反向荧光基团不限于FAM，可以为其他荧光基团，例如可以为CY5或JOE。需要说明的是，内参反向猝灭基团不限于MGB，可以为其他猝灭基团，例如可以为BHQ或DABCYL。
S123、对待测DNA的扩增曲线和Ct、内参基因的扩增曲线和Ct值进行检测分析，若内参基因的扩增曲线呈S型，且待测DNA的Ct值与内参基因的Ct值之差小于或等于预设值，则待测DNA发生甲基化。
在一个具体示例中，预设值为8。
需要说明的是，若内参基因的扩增曲线呈S型，且待测DNA的Ct值与内参基因的Ct值之差大于预设值，则待测DNA未发生甲基化。
图1为上述待测基因甲基化的检测方法对甲基化样本和非甲基化样本进行检测的原理对比图。其中，图1A为上述待测基因甲基化的检测方法对甲基化样本进行甲基化检测过程示意图，图1A中，Step1:引物与模板DNA结合；Step2：正向扩增；Step3：反向扩增；Step4：限制性内切酶便可以特异性识别切割双链PCR产物5’端，淬灭荧光基团脱离，产生实时荧光信号，“Methylated Target DNA”表示甲基化模板DNA；图1B为上述待测基因甲基化的检测方法对非甲基化样本进行甲基化检测过程示意图，“mismatches”表示错配或者没有匹配。需要说明的是，图1A中，Step2与Step3可以为同时进行，也可以为分步进行。当两者分步进行时，没有先后顺序。
从图1可以看出，当待测DNA没有甲基化时，经亚硫酸盐处理后使得待测DNA中5’胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，得到处理后基因。上述实施方式的扩增引物对不能扩增处理后基因。当待测DNA有甲基化时，经亚硫酸盐处理后使得待测DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，最后得到Bis-DNA。将核酸内切酶加入到实时荧光定量PCR反应中，当上述实施方式的扩增引物对与Bis-DNA中甲基化片段结合并扩增后，核酸内切酶便可以特异性识别切割正向识别片段或反向识别片段，使得猝灭基团与荧光基团分离而产生实时荧光信号，以对待测基因的甲基化进行定量定性检测。
上述待测基因甲基化的检测方法，能够对待测基因的甲基化情况进行检测，检测敏感度高，特异性强，有利于对待测基因甲基化情况进行研究。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
提供一种检测待测基因甲基化的试剂盒。
该试剂盒包括核酸组合物、阳性质控品、阴性质控品、核酸内切酶、PCR反应液；
核酸组合物如表1所示；核酸组合物中的待测DNA的扩增引物对根据hOGG1基因启动子序列设计，hOGG1基因启动子序列如SEQ ID No.5所示；具体地，如SEQ ID No.5所示序列为：5’-CGGATTGGCTACCTCTAGGTGAAATGAGCGGTGGTTGAGCCCTACTTCCGGTGGTGCTGT-3’；
阳性质控品为人工合成的甲基化片段，阳性质控品的序列如SEQ ID No.8所示；具体地，如SEQ ID No.8所示的序列为：5’-GACGGATAGTTTTGAGGAATCGCGTATCACCATTGCGCGTTTTA-3’，阳性质控品委托上海生工公司合成；
阴性质控品为人工合成的非甲基化片段，阴性质控品的序列如如SEQ ID No.9所示；具体地，如SEQ ID No.9所示的序列为：5’-TGCCCGTCCTTTTCGCGAACCTCGCCGGCGCCGGTCTCCGTATC-3’，阴性质控品委托上海生工公司合成；
PCR反应液包括dNTPs、Taq酶、Mg2+、5X buffer。
表1核酸组合物
实施例2
样本DNA提取及亚硫酸盐处理
用血液基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)并按照该试剂盒的操作指南从待测样本中提取游离DNA，在核酸定量仪上测DNA浓度，选取OD260/OD280在1.8～2.0之间的样本DNA，用DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)并按照该试剂盒的操作指南进行重亚硫酸盐转化，使DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，最后得到Bis-DNA。待测样本为外周血样本。
具体操作步骤如下：
(1)在1mL的待测样本中加入3mL的红细胞裂解液，混匀，12000rpm离心1min，吸去上清，向沉淀中加200uL的溶液A，振荡混匀，得到悬浮液。向悬浮液中加入20uL、10mg/mL的RnaseA，混匀，室温放置10min。再加入20uL、10mg/mL的蛋白酶K，混匀，65℃水浴消化50min，得到消化液。需要说明的是，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。加入溶液B(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)，溶液B与消化液的体积比为2，混匀，室温放置2min。12000rpm离心2min，弃去上清。
(2)将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入700uL的漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃去上清。将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入500uL的漂洗液，12000rpm离心1min，弃去上清。将吸附柱放入收集管中。12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温放置数分钟。将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加150uL、经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。将所得洗脱液放入吸附柱中，12000rpm离心2min，获得样本DNA。
(3)取1uL的样本DNA在核酸定量仪上测试DNA浓度，选择选取OD260/OD280在1.8～2.0之间的样本DNA进行后续实验。
(4)将样本DNA转移至0.2mL的离心管中，添加150μL亚硫酸氢盐溶液，混匀后短暂离心。将离心管放置于温度循环变温器中并按照以下程序：98℃10min、64℃1.5h、4℃(≦20h)进行反应，得到混合液。
(5)向吸附柱中加入500μL的结合液，再将混合液转移至吸附柱中，混匀，12000rpm离心30sec，弃废液。向吸附柱中加入600μL的漂洗液，12000rpm离心30sec，弃废液。再向吸附柱中加入600μL的漂洗液，12,000rpm离心2min，弃废液；将吸附柱室温静置2min，以彻底挥发吸附柱中残留的漂洗液。将吸附柱转入1.5mL的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL洗脱液，室温静置2min，12000rpm离心2min后将溶液收集到离心管中，得Bis-DNA。
实施例3
(1)按照实施例2的操作将待测样本进行样本DNA提取及亚硫酸盐处理，得到Bis-DNA。待测样本为待测样本为肺癌Ⅰ期患者外周血。
(2)实验共分为两组，分别为实验组和对照组。实验组的试剂盒为实施例1的试剂盒。对照组的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同，不同之处在于，待测DNA的正向引物的序列如SEQ ID No.6所示，且正向引物的5’端连接有MGB，3’端连接有FAM；待测DNA的反向引物的序列如SEQ ID No.7所示，且反向引物的5’端连接有MGB，3’端连接有FAM。具体地，如SEQID No.6所示的序列为5’-TTTCCAGGTTTGACGGATAGTTTTGAGGAATCG-3’，如SEQ ID No.7所示的序列为5’-TTTCCAGGTTTCGTTTTTTTTTTGCGATTTATT-3’。
(3)采用实验组试剂盒与对照组试剂盒分别对Bis-DNA进行PCR扩增反应，同时对甲基化内参基因进行PCR扩增反应，反应体系如表2所示，反应程序如表3所示。每组重复3次。检测结果如图2。图2为实施例3中实验组与对照组对待测样品进行检测的对比图。图2中，Fluorescence即为荧光值，横坐标为Ct值(循环阈值)。甲基化内参基因为甲基化的β-actin，甲基化内参基因委托上海生工公司合成。
具体地，将PCR反应液充分混匀后，分装于PCR八联管中，并做好标记后转移至样本处理区。将Bis-DNA、引物、PspGI核酸内切酶加入到分装好的PCR管中压紧管盖，并短暂离心，将管壁液体离心至管底。将PCR管放置在仪器样本槽的相应位置，并记录好摆放次序。
仪器检测通道选择：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2(β-act)，Quencher Dye2：none；Passive Reference：none。对应检测孔的设定：在扩增反应开始前，将待检样本和质控品设定为“Unknown”。
自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际情况调节阈值线至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，且目标基因FAM信号的阈值线需超过正常阴性对照的最高点处设定的阈值线；根据待测样本的定量PCR检测信号，达到设定阈值线所需的循环次数，得到Ct值。
试剂盒结果判定
满足内标通道有S型扩增曲线，若△Ct＝目标基因的Ct值-内参基因的Ct值≤临界值，则该样本为发生甲基化样本，判断为肺癌早期诊断阳性；
满足内标通道有S型扩增曲线，若△Ct＝目标基因Ct值-内参基因的Ct值>临界值，则该样本为未发生甲基化样本，判断为肺癌早期诊断阴性；
若内标通道无S型扩增曲线，则判定结果无效，建议重新提取样本进行检测。临界值为目标基因检测体系检测浓度为10ng/μL的0.1％比例甲基化内参基因对应的△Ct值，本研究中临界值为8。
表2反应体系
| 名称 | 添加量(每份) |
| Taq酶 | 1μL |
| d NTP | 0.5μL |
| Mg<sup>2+</sup> | 1.5μL |
| 5X Buffer | 7μL |
| 正向引物 | 1μL |
| 反向引物 | 1μL |
| Bis-DNA | 2μL |
| PspGI酶 | 0.5μL |
| dd H<sub>2</sub>O | 10.5μL |
| 总量 | 25μL |
表3反应程序
从图2可以看出，实验组的试剂盒进行三次测定均能够扩增Bis-DNA，从而能够有效地检测待测样品的甲基化；而对照组的试剂盒进行三次测定均未能够扩增Bis-DNA，不能够有效地检测待测样品的甲基化；说明上述实施方式的检测待测基因甲基化的核酸组合物能够有效地检测待测样本中hOGG1基因启动子序列的甲基化情况。
实施例4
(1)待测样本共60例，经结合影像学以及病理学测定，其中30例为不同性别、不同年龄阶层的I期肺癌患者30外周血样本(即肺癌样本)，另外30例为健康人外周血样本(即健康样本)。将60例样本分别进行编号，按照实施例2的操作对各样本进行样本DNA和亚硫酸盐处理得Bis-DNA，采用实施例1的试剂盒并按照实施例3的操作对各例样本的Bis-DNA进行荧光定量PCR，并对检测结果进行分析。检测如表4所示，表4中阳性表示待测样本的Bis-DNA中有甲基化，阴性表示待测样本的Bis-DNA中没有甲基化。同时，根据检测结果，按照如下公式计算敏感度和特异性：
敏感度＝检测结果为阳性的肺癌样本数/总的肺癌样本数；
特异性＝检测结果为阴性的肺癌样本数/总的健康样本数。
表4 60例待测样本的检测结果
结合表4，经计算，60例样本检测的敏感度为90％，特异性为100％，说明上述实施方式的试剂盒能够快速、准确的待测基因的甲基化情况，从而有利于肺癌的早期诊断和筛查。
综上，上述检测待测基因甲基化的核酸组合物能够有效地检测待测基因的甲基化情况，敏感度较高，特异性较强，快速、高效，其结果的判读非常明确、直观，结果可靠，价格低廉，性价比高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
<120> 检测待测基因甲基化的核酸组合物及其试剂盒和待测基因甲基化的检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttccaggtt tgacggacag ccctgaggaa ccg 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttccaggtt tcgccccctc cttgcgactt atc 33
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttccaggtt ttggtgatgg aggaggttta gtaagt 36
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttccaggtt taaccaataa aacctactcc tcccttaa 38
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggattggct acctctaggt gaaatgagcg gtggttgagc cctacttccg gtggtgctgt 60
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttccaggtt tgacggatag ttttgaggaa tcg 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttccaggtt tcgttttttt tttgcgattt att 33
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacggatagt tttgaggaat cgcgtatcac cattgcgcgt ttta 44
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcccgtcct tttcgcgaac ctcgccggcg ccggtctccg tatc 44
Claims (10)
1.一种检测待测基因甲基化的核酸组合物，其特征在于，包括用于扩增待测基因中甲基化片段的扩增引物对；
所述扩增引物对的正向引物从5’端到3’端包括正向识别片段与正向匹配片段，所述正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，所述正向匹配片段能够与所述甲基化片段的正义链互补配对，所述正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团；
所述扩增引物对的反向引物从5’端到3’端包括反向识别片段与反向匹配片段，所述反向识别片段能够特异性识别所述核酸内切酶，所述反向匹配片段能够与所述甲基化片段的反义链互补配对，所述反向引物的两端分别连接有反向荧光基团和反向猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测待测基因甲基化的核酸组合物，其特征在于，所述核酸内切酶为PspGI核酸内切酶；
及/或，所述待测基因为hOGG1基因启动子序列。
3.根据权利要求1所述的检测待测基因甲基化的核酸组合物，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的检测待测基因甲基化的核酸组合物，其特征在于，所述正向引物的3’端连接有所述正向荧光基团，所述正向引物的5’端连接有所述正向猝灭基团；
及/或，所述反向引物的3’端连接有所述反向荧光基团，所述反向引物的5’端连接有所述反向猝灭基团。
5.根据权利要求1～3任一项所述的检测待测基因甲基化的核酸组合物，其特征在于，还包括用于扩增甲基化内参基因的内参正向引物和内参反向引物；
所述内参正向引物从5’端到3’端包括内参正向识别片段与内参正向匹配片段，所述内参正向识别片段能够特异性识别所述核酸内切酶，所述内参正向匹配片段能够与所述甲基化内参基因的正义链互补配对，所述内参正向引物的两端分别连接有内参正向荧光基团和内参正向猝灭基团；
所述内参反向引物从5’端到3’端包括内参反向识别片段与内参反向匹配片段，所述内参反向识别片段能够特异性识别所述核酸内切酶，所述内参反向匹配片段能够与所述甲基化内参基因的反义链互补配对，所述内参反向引物的两端分别连接有内参反向荧光基团和内参反向猝灭基团。
6.根据权利要求5所述的检测待测基因甲基化的核酸组合物，其特征在于，所述内参基因为U6、GAPDH或β-actin。
7.根据权利要求5所述的检测待测基因甲基化的核酸组合物，其特征在于，所述内参正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，所述内参反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。
8.一种检测待测基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的检测待测基因甲基化的核酸组合物。
9.根据权利要求8所述的检测待测基因甲基化的试剂盒，其特征在于，还包括核酸内切酶。
10.一种待测基因甲基化的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
对待测DNA进行亚硫酸盐处理，得到处理后基因；及
采用扩增引物对对所述处理后基因进行荧光定量PCR扩增，根据反应结果进行检测分析，其中，所述扩增引物对用于扩增所述待测DNA中甲基化片段；所述扩增引物对的正向引物从5’端到3’端包括正向识别片段与正向匹配片段，所述正向识别片段能够特异性识别核酸内切酶，所述正向匹配片段能够与所述甲基化片段的正义链互补配对，所述正向引物的两端分别连接有正向荧光基团和正向猝灭基团；所述扩增引物对的反向引物从5’端到3’端包括反向识别片段与反向匹配片段，所述反向识别片段能够特异性识别所述核酸内切酶，所述反向匹配片段能够与所述甲基化片段的反义链互补配对，所述反向引物的两端分别连接有反向荧光基团和反向猝灭基团。
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