CN108531594A

CN108531594A - 一种多基因联合用于膀胱癌早期筛查的无创检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN108531594A
Application number: CN201810374235.5A
Authority: CN
Inventors: 邵琦
Original assignee: Anhui Dajian Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Anhui Dajian Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2018-09-14

Abstract

一种多基因联合用于膀胱癌早期筛查的无创检测方法及其试剂盒，所述联合基因为APC、NID2、p16，通过设计特异性甲基化引物分别检测APC、NID2、p16三个靶基因片段甲基化的核酸序列，实现对膀胱癌的早期筛查和辅助诊断。分别通过三通道荧光定量PCR法分析尿沉渣中APC、NID2、p16三个基因标志物的甲基化水平，并根据所报告的CT值判读样本的阳性或阴性结果。在临床前研究中可以检测出绝对多数的膀胱癌和大部分的癌前腺瘤；能检测到90％的早期膀胱癌，64％的癌前腺瘤(≥1厘米)，特异性达到100％，且完全无创，仅需50mL尿液，无症状人群接受度高。

Description

一种多基因联合用于膀胱癌早期筛查的无创检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种多基因联合筛查膀胱癌的无创检测方法及其试剂盒，适用于检测尿沉淀细胞中是否存在膀胱癌突变DNA。

背景技术

膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占泌尿系肿瘤的首位，90％以上为移行细胞癌(BTCC)，其中80％为浸润的浅表性癌，初次治愈后复发率为70％～80％，其发病率和复发率呈逐年增加的趋势。世界各国膀胱癌的发病率相差可达10倍之多，西欧和北美最高，东欧和一些亚洲国家比较低，在我国男性膀胱癌发病率位居全身肿瘤的第8位，据统计，我国每年约有145 000例患者死于膀胱肿瘤，男性发病率为女性的3～4倍。在来源于上皮组织的膀胱癌中，约90％为移行上皮癌；非上皮性膀胱肿瘤较少见，主要包括未分化癌、鳞状细胞癌、腺癌，根据细胞的分化程度可将其分为3级。浅表性膀胱癌早期诊断通常有较好的预后，然而，膀胱癌的复发率为60％～70％，居所有实体瘤的首位，其中11％的复发患者会发展为浸润性膀胱癌，患者术后通常需每年进行3～4次膀胱镜检查。早期发现膀胱癌可以增加手术保留膀胱的机会并提高患者总体生存率。因此，如何早期发现膀胱肿瘤以及术后如何早期检测到膀胱肿瘤的复发具有非常重要的临床意义。

膀胱癌的发生发展是一个多基因改变的复杂过程，包括基因突变、基因表达异常和基因表型改变等。正常人的50mL尿液约含有20万个细胞，其中50％为尿道脱落细胞。在疾病状态下，尿液中的脱落细胞量可明显增加。目前，尿脱落细胞学和膀胱镜检查仍然是膀胱癌诊断和监测的“金标准”。尿脱落细胞学检测虽可作为一非损伤性的诊断手段，特异性高，但敏感性较低，且由于炎症或放化疗影响会有一定的假阳性率，存在临床检出率低及准确性差等不足。最新研究表明，尿细胞学检查实际上只发现了71％的G3级肿瘤，诊断低级别肿瘤的敏感性则更低，而膀胱镜检查是有创检查，其不足之处为操作相对创伤性大，又受检查者操作经验及技巧的影响，存在患者痛苦大，医疗费用高昂等局限，作为一种膀胱癌筛查方法在临床工作中收到一定的制约，且不能进行早期诊断。

通过定性甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)方法有望检出占细胞总量比例极低、却与正常细胞的甲基化谱式呈相反状态的肿瘤细胞。最新研究发现DNA甲基化与膀胱癌的发生、发展、分期、分级、复发以及预后等有着非常密切的关系，目前已从膀胱癌细胞系、膀胱癌组织标本、患者尿液标本检测到多种基因发生甲基化。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到CpG双核苷酸上胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶的过程。人类基因组DNA存在着广泛的甲基化修饰，主要发生在CpG序列。正常人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则是甲基化的。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，从而导致染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的缺失。与膀胱癌发生相关的DNA甲基化可用于膀胱癌的诊断和预后判断，并可作为膀胱癌治疗的靶点，且DNA甲基化检测的优势之一，就是不仅可以采用肿瘤组织，也可以采用血清、尿液等进行肿瘤的早期诊断，完全无创无痛。DNA甲基化检测既可以应用于辅助筛选和早期诊断膀胱肿瘤，还可以作为评价膀胱肿瘤疗效及预后生存率的指标。膀胱肿瘤患者尿沉淀细胞DNA的甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测方法以其高敏感性、高特异性成为继有创性膀胱镜检查、活组织检查及尿细胞学检查之后的又一个重要临床检验方法，为新发及复发性膀胱癌提供了一个简单无创的检测方法，非常适合于复发率很高的膀胱癌的诊断与随访。

由于膀胱癌发生的机制具有多样性，因此在不同的膀胱癌中检测出发生异常甲基化位点也不尽相同，至今仍无单个基因检测能达到满足的临床诊断应用所需要的灵敏度好特异性的报道。几种基因联合检测是膀胱癌甲基化检测的趋势，但是这些已报到的甲基化标志物联用来能否提高诊断敏感性和特异性仍是一个问题(王永强,尿液EOMES,PCDH17和POU4F2基因甲基化分析对膀胱尿路上皮癌早期诊断的意义),Catto等研究12个基因启动子区的甲基化情况，检出率为86％；专利CN104141009B早期膀胱癌的多靶标检测方法，公开7个标志物进行检测来提高灵敏度和检测，但是这些检测方法中筛选出的靶基因数量较多，涉及引物较多，不适合实际临床检测中应用。因此，仍需要继续寻找DNA甲基化的靶基因组来可提高早期膀胱癌检测的特异度和敏感度具有重要的临床意义。

发明内容

为了克服上述技术中存在的不足，本发明从抑癌基因，肿瘤信号通路调控因子，粘附分子和血管生成等四大类多个基因中筛选出和早期膀胱癌有着很高相关性的3个异常甲基化基因p16、APC和NID2。p16是抑癌基因；Wnt信号传导通路的异常激活与人类肿瘤的发生发展密切相关，APC是Wnt信号的下游抑制因子，APC失活后则会导致β-catenin降解减少，胞质β-catenin转移到细胞核与Tcf-4结合，活化靶基因刺激肿瘤生长；NID2是基底膜的主要构成成分之一，在肿瘤细胞黏附、肿瘤血管形成、肿瘤细胞转移过程中起着重要作用。此外，本发明通过设计p16、APC和NID2特异性引物及其探针，并使用标志物联用的方式来提高检测膀胱癌的敏感性和特异性。

本发明目的之一在于提供一种能无创、快速、高敏感度的检测膀胱癌尿沉淀细胞中突变基因的方法及其试剂盒。本发明采用多基因联合筛查结合多重荧光定量PCR技术用于膀胱癌的早期筛查，相关的基因包括APC、NID2、p16，采用甲基化特异性qPCR法分别检测APC、NID2、p16三个靶基因片段甲基化的核酸序列，实现对膀胱癌的早期筛查和辅助诊断，分别通过三通道荧光定量PCR法分析尿沉渣中APC、NID2、p16三个基因标志物的甲基化水平，并根据所报告的CT值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)判读样本的阳性或阴性结果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了早期筛查膀胱癌的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针组成分别为检测膀胱癌标志物APC基因片段甲基化的正、反引物和荧光标记的探针，具体为：正向引物序列为SEQ ID NO:1，反向引物序列为SEQ ID NO:2，荧光探针序列为SEQ ID NO:3，其中荧光探针5′端标记FAM(荧光报告基团)，3′端标记MGB(荧光淬灭基团)；

检测膀胱癌标志物NID2基因片段甲基化的正、反引物和荧光标记的探针，具体为：正向引物序列为SEQ ID NO:4，反向引物序列为SEQ ID NO:5，荧光探针序列为SEQ ID NO:6；其中荧光探针5′端标记VIC(荧光报告基团)，3′端标记MGB(荧光淬灭基团)；

和检测膀胱癌标志物p16基因片段甲基化的正、反引物和荧光标记的探针，具体为：正向引物序列为SEQ ID NO:7，反向引物序列为SEQ ID NO:8，荧光探针序列为SEQ IDNO:9；其中荧光探针5′端标记ROX(荧光报告基团)，3′端标记MGB(荧光淬灭基团)。

本发明针对膀胱癌相关的APC、NID2、p16三个靶基因片段甲基化的核酸序列同时设计并验证了多处引物和探针组合序列，优选了上述三组引物探针序列。在多重荧光定量PCR反应体系中，为了保证结果的稳定性，要求各目的基因和参数基因之间的扩增效率之差控制在10％以内，且基因的扩增的效率直接和灵敏度和特异性密切相关，所以为了同时满足每一个基因都能得到最佳的扩增条件且保证每个基因的扩增效率最好，其对引物的要求较高，换句话说，引物设计的质量是扩增成败的关键性因素，甲基化特异性引物的设计与普通的PCR引物设计不同，甲基化特异性引物的设计原理是:模板DNA在经过亚硫酸盐处理后,发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点5′端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点5′端胞嘧啶转化为尿嘧啶,即C→U。甲基化特异性引物所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG含量相对较高，甲基化特异性扩增难度加大，因此设计好的引物需要从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率<30％的引物要进行优化，本发明通过在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。

本发明还提供一种早期筛查膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒包含上述所述的3种基因的组引物和探针。

本发明提供的试剂盒还包括PCR Master Mix，内标的引物及探针，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液；用于尿沉淀细胞DNA提取及甲基化转化。

优选地，所述PCR Master Mix包含Taq聚合酶、dNTP、PCR Buffer。

优选地，所述内标基因为人类管家基因GAPDH；所述内标的引物及探针，是用于监控每个样本的提取及PCR反应管的扩增情况，从而避免假阴性或部分抑制结果的出现。

本发明还提供上述试剂盒在早期筛查膀胱癌检测中的应用。

优选地，所述试剂盒检测膀胱癌的步骤如下：

(1)收集一定数量人膀胱癌样本和正常样本；

(2)从步骤(1)中收取的尿沉淀细胞样本中提取基因组DNA；

(3)将步骤(2)提取的基因组DNA进行甲基化转化，将甲基化DNA的胞嘧啶转化为尿嘧啶；

(4)将步骤(3)甲基化转化后的DNA进行PCR扩增。

进一步优选地，步骤(4)中所述PCR步骤为三通道荧光定量PCR，分别检测膀胱癌标志物APC、NID2、p16片段甲基化水平，所述标志物对应的荧光定量PCR通道为FAM通道、VIC通道和ROX通道。

进一步优选地，步骤(4)中所述PCR反应液由20μL PCR Master Mix和3μL荧光定量反应液组成。

进一步优选地，步骤(4)中所述PCR步骤具体为：

1)将权利要求6所述的PCR反应液混合，按每管23μL/人份体积分装于PCR八联管中；

2)将待检甲基化转化后的DNA样本按每孔2μL的量加入到分装好的PCR八联管中，短暂离心；

3)PCR扩增：将PCR八联管放置在仪器样本槽的相应位置，仪器检测通道选择：Reporter Dye1(三基因)：FAM、VIC、ROX，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2(GAPDH基因)：Cy5，Quencher Dye2：none；Passive Reference：none。

进一步优选地，步骤(4)中所述PCR扩增荧光程序为：

4)结果的判定：

在样本的检测过程中，基线的确定为：取3～15个循环的荧光信号；阈值设定：使阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值为Undet。根据所报告的CT值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)判读样本的阳性或阴性结果。

一种多基因联合用于膀胱癌早期筛查的无创检测方法及其试剂盒的原理为：通过检测尿沉淀中的脱落肿瘤细胞成分，来判断受检者是否有可能患有膀胱癌的分子诊断技术，最常检测的肿瘤细胞成分为发生了突变或者甲基化的人类基因。膀胱一般发生在膀胱上皮组织中，先向膀胱内生长，在其生长过程中，不断地有肿瘤细胞脱落至膀胱内并随着尿液排出，因此检测尿沉渣中的肿瘤细胞成分就可以提供一种无创的膀胱癌筛查诊断方法。肿瘤发生相关基因的突变是肿瘤特有的，而基因启动子区域的甲基化水平则在肿瘤细胞中比在正常细胞中明显提高，所以这种基因的改变可以作为肿瘤标志物用于筛查或者诊断膀胱癌。本发明采用多基因联合用于膀胱癌的早期筛查，相关的基因包括APC、NID2、p16采用甲基化特异性qPCR法分别检测APC、NID2、p16三个靶基因片段甲基化的核酸序列，实现对膀胱癌的早期筛查和辅助诊断。分别通过三通道荧光定量PCR法分析尿沉渣中APC、NID2、p16三个基因标志物的甲基化水平，并根据所报告的CT值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)判读样本的阳性或阴性结果。

有益效果：

与传统的膀胱肠镜检筛查膀胱癌比较，及常规的尿细胞学检测比较，本试剂盒采用多基因联合筛查，同时结合多重荧光定量PCR技术通过检测尿沉淀细胞DNA筛查膀胱癌具有以下优势：

1、完全无创，仅需50mL尿液，无症状人群接受度高；

2、准确性高，本发明试剂盒采用3种靶基因联合检测，极大地提高了检测的灵敏度和特异性，在临床前研究中可以检测出绝对多数的膀胱癌和大部分的癌前腺瘤；能检测到90％的早期膀胱癌，64％的癌前腺瘤(≥1厘米)，特异性达到100％，远远超过现有的检测手段；

3、可以同时发现左右两侧膀胱肿瘤，减少检测盲区和漏诊；

4、本发明采用多个生物标志物基因联合检测，在每个标志物的特异性都比较高的前提下，使用多个标志物联用的方式来提高检测的敏感性和特异性。

5、不仅可以发现膀胱癌，也可以发现癌前腺瘤，为通过摘除癌前腺瘤而预防膀胱癌提供了可能性；

6、操作方便，在获得样本采集包后，用户可以居家完成样本的收集工作，之后快递寄出由专业人员进行检测。

附图说明

图1为部分阳性样本(3、12、13、18)的FQ-PCR图；

图2为部分阴性样本(23、36、40)的FQ-PCR图(仅内参对照有扩增曲线)。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：

本申请样本收集自中山大学附属肿瘤医院泌尿科收集20例2017年3月～2017年12月临床病理诊断为膀胱癌的患者尿液标本(10男，10女)及20例正常人尿液标本(10男，10女)，每例标本各50～100mL，膀胱癌患者的临床分期、病理分型按照国际TMN标准进行。

本发明试剂盒用于检测膀胱癌相关的尿沉淀细胞多基因甲基化水平的引物和探针是根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列，使用PrimerPremier 5设计，引物由TAKARA(宝生物工程有限公司)合成，探针由Life Technologies合成。

实施例1用于检测膀胱癌相关的尿沉淀细胞多基因甲基化水平的引物和探针设计及其试剂盒。

本发明针对膀胱癌相关的APC、NID2、p16三个靶基因片段甲基化的核酸序列同时设计并验证了多处引物和探针组合序列，优选了以下三组引物探针序列：

(1)检测APC基因片段甲基化的核酸序列(FAM荧光通道)

正向引物序列为SEQ ID NO:1，

反向引物序列为SEQ ID NO:2，

荧光探针序列为SEQ ID NO:3；

荧光探针SEQ ID NO:3；荧光探针SEQ ID NO:3的5′端标记FAM(荧光报告基团)，3′端标记MGB(荧光淬灭基团)。

(2)检测NID2基因片段甲基化的核酸序列(VIC荧光通道)

正向引物序列为SEQ ID NO:4，

反向引物序列为SEQ ID NO:5，

荧光探针序列为SEQ ID NO:6；荧光探针SEQ ID NO:A6的5′端标记VIC(荧光报告基团)，3′端标记MGB(荧光淬灭基团)。

(3)检测p16基因片段甲基化的核酸序列(ROX荧光通道)

正向引物序列为SEQ ID NO:7，

反向引物序列为SEQ ID NO:8，

荧光探针序列为SEQ ID NO:9；荧光探针SEQ ID NO:A9的5′端标记ROX(荧光报告基团)，3′端标记MGB(荧光淬灭基团)。

本发明试剂盒除了包括检测以上3种基因的引物探针之外，还包括了检测内对照-人类管家基因(GAPDH)的引物和探针序列，用于监控每个样本的提取及PCR反应管的扩增情况；此外，本发明试剂盒还包括有PCR Mix(内含Taq聚合酶、dNTP、PCR Buffer等)、裂解液、蛋白酶K、漂洗液、亚硫酸氢盐溶液。

采用上述试剂盒进行膀胱癌检测时，具体步骤如下：

2.1收集样本。

2.2从步骤(1)中收取的尿沉淀细胞样本中提取基因组DNA，具体步骤为：

A、裂解

1)吸取200μL尿液样本，置于1.5mL离心管中，加入1mL裂解液，然后持续涡旋振荡混匀1min，使管底尿液和试剂充分混匀，然后将1.5mL离心管置于70℃水浴5min。

2)将1.5mL离心管从水浴锅内取出，12,000rpm离心5min，缓慢吸取300μL上清液至新的1.5mL离心管中。

3)向新的1.5mL离心管中依次加入200μL裂解液2和20μL蛋白酶K，涡旋混匀。

4)将新的1.5mL离心管置于70℃水浴10min。

B、DNA结合

1)添加200μL异丙醇，涡旋混匀。

2)将上一步所得溶液全部加入一个吸附柱中(将吸附柱套入收集管中)，12,000rpm离心30s，弃废液。

C、DNA洗涤

1)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30s，弃废液。

2)12,000rpm离心2min，弃废液；将吸附柱室温静置2min，以彻底挥发吸附柱中残留的漂洗液。

3)将吸附柱转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL洗脱液，室温静置2min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

2.3将步骤(2)提取的基因组DNA进行甲基化转化，将甲基化DNA的胞嘧啶转化为尿嘧啶，具体步骤为：

1)将步骤(2)提取的DNA全部转移至0.2mL离心管中，添加150μL亚硫酸氢盐溶液；通过轻弹离心管或移液器轻柔吹打操作混匀后短暂离心。

2)将离心管放置于温度循环变温器中并按照以下条件设置：

①98℃10min

②64℃1.5h

③4℃(≦20h)

3)向吸附柱中加入500μL结合液，再将上一步的混合液转移至吸附柱中，盖上管盖并颠倒混匀，12,000rpm离心30sec，弃废液。

4)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30sec，弃废液。

5)12,000rpm离心2min，弃废液；将吸附柱室温静置2min，以彻底挥发吸附柱中残留的漂洗液。

6)将吸附柱转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL洗脱液，室温静置2min，12,000rpm离心2min后将溶液收集到离心管中。

(4)将步骤(3)甲基化转化后的DNA进行PCR扩增。

1)按照下列表格配置PCR反应液：

2)PCR反应液充分混匀后，按每管23μL体积分装于PCR八联管中，并做好标记后转移至样本处理区。

3)将待甲基化转化后的DNA样本，按每孔2μL的量加入到分装好的PCR八联管中，压紧管盖，并短暂离心，将管壁液体离心至管底。

4)将PCR八联管放置在仪器样本槽的相应位置，并记录好摆放次序。

仪器检测通道选择：Reporter Dye1(三基因)：FAM、VIC、ROX，Quencher Dye1：none；

Reporter Dye2(GAPDH基因)：Cy5，Quencher Dye2：none；Passive Reference：none。

对应检测孔的设定：在扩增反应开始前，将待检样本和质控品设定为“Unknown”。

按以下条件设置PCR反应

4)结果的判定：

结论：(1)编号分别为3、12、13、18的阳性样本对应检测孔有扩增曲线，检测结果为阳性，与病理诊断结果一致，荧光定量PCR检测扩增结果如图1所示；编号分别为23、36、40的阴性样本对应检测孔只有对照的内参基因有扩增曲线，检测结果为阴性，与病理诊断结果一致，荧光定量PCR检测扩增结果如图2所示，表明本试剂盒的检测结果具有极高的特异性和可靠性。

本发明各样本的详细检测结果的CT值见表1。

由表1样本的荧光定量PCR检测结果中可以看出，各样本的APC、NID2、p16三个靶基因在膀胱癌样本中高度扩增，而正常样本中扩增极少，由此证明本发明试剂盒能快速、准确的检测膀胱癌尿沉淀细胞中突变基因和正常基因。由此看出本发明试剂盒不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果可靠、特异的。

表1各样本荧光定量PCR检测结果的CT值

(2)综合3个标志物的检测结果，按照如下公式计算得到灵敏度和特异性：

灵敏度＝检测结果为阳性的膀胱癌样本数/总的膀胱癌样本数；

特异性＝检测结果为阴性的非膀胱癌样本数/总的非膀胱癌样本数；

结果如表2所示在20个膀胱癌患者、20个正常人尿液样本中特异性100％，灵敏度100％。

表2 3个biomarker的特异性和灵敏度

	APC	NID2	p16	3个marker总数
					灵敏度	30％	35％	35％	100％
特异性	100％	100％	100％	100％

由表2可以看出，在本发明中选择3个基因的甲基化区域作为生物标记物，进行早期膀胱癌检测，特异性可达100％，灵敏度可高达100％以；在每个标志物的特异性都比较高的前提下，本发明通过标志物联用的方式来提高检测的敏感性。

为了验证本发明引物的特异性和灵敏度，本发明通过其他引物作对照。

对比例1：

本发明选用的APC正向引物序列为SEQ ID NO：10，反向引物序列为SEQ ID NO：11，荧光探针序列为SEQ ID NO:3，对本申请样本进行荧光定量PCR，来验证本发明APC引物的灵敏度特特异性。与实施例1的区别在于引物不同，其它均与实施例1相同。

对比例2：

本发明选用的NID2-I正向引物序列为SEQ ID NO：12，反向引物序列为SEQ ID NO：13，荧光探针序列为SEQ ID NO:6，对本申请样本进行荧光定量PCR，来验证本发明NID2引物的灵敏度特特异性。与实施例1的区别在于引物不同，其它均与实施例1相同。

对比例3

本发明选用的P16正向引物序列为SEQ ID NO：14，反向引物序列为SEQ ID NO：15，荧光探针序列为SEQ ID NO:9，对本申请样本进行荧光定量PCR，来验证本发明P16引物的灵敏度特特异性。与实施例1的区别在于引物不同，其它均与实施例1相同。

表3 3个biomarker的特异性和灵敏度

通过比较发现，本申请引物的灵敏度比其他引物灵敏度高，同时NID2和p16基因的特异性比对比例中的引物特异性高。

最后说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽达健医学科技有限公司

<120> 一种多基因联合用于膀胱癌早期筛查的无创检测方法及其试剂盒

<130> 2010

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtaggttgtg cggttgggc 19

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

caatacaacc acatatcgat cacg 24

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgcggatta gggcgtt 17

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tgtttatggt ggatggggtt tt 22

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cgcgaccacg aaaacga 17

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cgtagttggt ttcgaggttg tgcggt 26

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ggcggcgggg agtagta 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aaccgcgacc gtaaccaa 18

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

catactactc cccgccgccg actc 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tgttttattg cggagtgc 18

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

aaccacatat cgatcacgta c 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gcggttttta aggagtttta ttttc 25

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

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<212> DNA

<213> 人工合成

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Claims

1.早期筛查膀胱癌的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针分别为检测膀胱癌标志物APC基因片段甲基化的正、反引物和荧光标记的探针，具体为：正向引物序列为SEQ IDNO:1，反向引物序列为SEQ ID NO:2，荧光探针序列为SEQ ID NO:3，其中荧光探针5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记MGB荧光淬灭基团；

检测膀胱癌标志物NID2基因片段甲基化的正、反引物和荧光标记的探针，具体为：正向引物序列为SEQ ID NO:4，反向引物序列为SEQ ID NO:5，荧光探针序列为SEQ ID NO:6；其中荧光探针5′端标记VIC荧光报告基团，3′端标记MGB荧光淬灭基团；

和检测膀胱癌标志物p16基因片段甲基化的正、反引物和荧光标记的探针，具体为：正向引物序列为SEQ ID NO:7，反向引物序列为SEQ ID NO:8，荧光探针序列为SEQ ID NO:9；其中荧光探针5′端标记ROX荧光报告基团，3′端标记MGB荧光淬灭基团。

2.一种早期筛查膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1中的3种基因的组引物和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含内标基因的引物及探针，所述内标记基因为人类管家基因GAPDH。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR Master Mix包含Taq聚合酶、dNTP、PCR Buffer。

6.权利要求2-5任一项所述试剂盒在早期筛查膀胱癌检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测包括步骤(4)：采用三通道荧光定量PCR分别检测膀胱癌标志物APC、NID2、p16片段甲基化水平，所述标志物APC、NID2、p16分别对应的荧光定量PCR通道为FAM通道、VIC通道和ROX通道。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR反应液为：20μL PCRMaster Mix和3μL引物探针。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，三通道荧光定量PCR具体方法为：

1)将权利要求8所述的PCR反应液混合，按每管23μL/人份体积分装于PCR八联管中；

3)PCR扩增：将PCR八联管放置在仪器样本槽的相应位置进行PCR；

步骤(4)前还包括：步骤(1)收集一定数量人膀胱癌样本和正常样本；步骤(2)从步骤(1)中收取的尿沉淀细胞样本中提取基因组DNA；步骤(3)将步骤(2)提取的基因组DNA进行甲基化转化，将甲基化DNA的胞嘧啶转化为尿嘧啶。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR扩增荧光程序为：第一步为温度95℃，时间30s，循环1次，荧光信号收集为否；第二步为温度95℃，时间5s，荧光收集为否，温度60℃，时间30s，荧光收集为否，循环20次；第三步为温度95℃，时间5s，荧光收集为否，温度56℃，时间32s，荧光收集为否，循环25次。