CN107988365A - 一种前列腺癌筛查与淋巴结转移预测试剂盒 - Google Patents

一种前列腺癌筛查与淋巴结转移预测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明为分子诊断领域，一种采用尿液无创检测前列腺癌及其淋巴转移的分子诊断方法与试剂，包括如下步骤：1.尿液核酸提取及纯化2.DNA亚硫酸氢盐转化反应及后续的纯化3.甲基化特异的实时荧光PCR检测多个基因启动子区域4.多基因结果分析。上述步骤1及2可以合并为一步。多基因包括以下基因的启动子区域：CRMP4、PITX2、RASSF1A、SOSTDC、CYBA、EFEMP1、KDM5D、GSTP1、WFDC2、TACSTD2等，组合使用这些基因的检测结果可以获得前列腺癌的诊断并可预测其淋巴转移。

Description

一种前列腺癌筛查与淋巴结转移预测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学领域，尤其是无创肿瘤筛查相关的分子诊断领域，方法学属于表观遗传学研究范畴，该领域达成共识：特定基因启动子区域CpG岛的甲基化状态与肿瘤发生及发展相关，包括检测、预后、淋巴结转移等。
背景技术
前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二。在中国，由于生活方式的改变以及人口老龄化比例的下降，前列腺癌(PCa)的增长比其他恶性肿瘤更快。目前，前列腺癌的临床诊断方式主要有血清前列腺特异性抗原(PSA)检测、直肠指检、直肠超声波检测、活组织病理检查等。前列腺特异性抗原(PSA)被广泛用作临床诊断的分子标记物，但在一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去，导致血清PSA水平预测前列腺癌具有一定的假阳性。此外，受前列腺增生、炎症、年龄、药物等相关因素的影响，PSA的特异性和灵敏性也存在争议。所以寻找其他高度特异性的诊断标记物对于前列腺癌的早期诊断和预防是非常必要的。
当前前列腺癌发病率及死亡率快速增长，其重要原因是，缺乏方便有效的筛查检测手段。现有诊断方法主要是取前列腺组织活检，而前列腺组织来源有限，取样痛苦，不能频繁取样，导致前列腺癌不能及时发现，恶化转移得不到及时治疗。国家食品药品监督管理总局(CFDA) 批准的前列腺癌筛查试剂主要是检测病人血液或尿液里总前列腺特异性抗原(total PSA)或游离前列腺特异性抗原(free PSA)，但前列腺特异性抗原不是前列腺癌的特异标志物而是前列腺组织特异性抗原，故这些检测均缺乏特异性和准确性。国际上，美国食品药品监督管理局(FDA)批准过一个前列腺癌分子诊断产品：即Hologic公司的“Progensa PCA3Assay”，该产品通过尿液中脱落细胞的长链非编码RNA前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3， PCA3)m RNA及PSA mRNA的比值，来判定患者是否为前列腺癌。该产品仅在欧美几个国家中销售，其特异性与灵敏度并不理想，PPV为33.6％，NPV为90％。国内来看，尚无一种前列腺癌分子诊断试剂获得批准，市场上没有一种商业化前列腺癌分子诊断试剂。因此，发掘一种简单快捷筛查前列腺癌的新型诊断方法与试剂迫在眉睫。
DNA甲基化研究是表观遗传学最主要的内容，近年来学者陆续肯定了多种肿瘤发生、进展与特定基因启动子区域的甲基化相关，且有产品问世，例如FDA批准粪便DNA甲基化检测产品“Cologuard”用于结直肠癌筛查，CFDA批准的博尔诚科技以外周血血浆为标本的结直肠癌筛查产品“Septin9基因甲基化检测试剂”，另有康立明生物以粪便为标本的结直肠癌筛查产品“长安心”，诺辉健康的同类产品“常卫清”等。关于DNA甲基化与前列腺癌的关系也有不少报道，一般通过甲基化芯片筛查肿瘤组与对照组的差异位点，再扩大标本数来验证。然而，此类科研报道的甲基化位点不够特异，不能区分其他肿瘤如膀胱癌，也不足以区分前列腺增生及前列腺炎，所以迄今为止尚无成形产品。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种采用尿液无创检测前列腺癌的分子诊断方法与试剂，特点是快速、简捷、可自动化、标准化的实验室用产品。
为实现前列腺癌的早期诊断及预后评估，本发明通过长期研究PCa样本中多个基因启动子附近CpG的甲基化位点和PCa之间的关系，并经过上百例试验组与对照组多位点结果分析，筛选出具有明显差异的保守性好的甲基化位点，最后选用荧光PCR技术测评特定甲基化保守位点在PCa患者中的诊断功能。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：离心尿液收集脱落细胞并提取其核酸，并包括了亚硫酸氢盐转化及核酸纯化，选取多个特定基因启动子区域CpG岛进行甲基化特异 PCR、MGB TaqMan探针检测，含有人类基因组DNA数量的内参引物探针用作归一化处理，判读特定基因启动子区域CpG岛甲基化程度，超过给定阈值的为高度甲基化，判为阳性，即为前列腺癌高度风险。根据不同靶基因的组合，其阳性信号的合适组合可分别用作诊断前列腺癌和前列腺癌淋巴转移风险的指标。
一种采用尿液无创检测前列腺癌的分子诊断方法与试剂，根据采用经典二步纯化还是一步纯化甲基化DNA有两种方案，包括以下步骤：
1.取5-50ml尿液3000rpm×10min,弃上清
2.沉淀中加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)混合，加入裂解液0.5ml-5ml,吹打混匀
3.转移0.6ml裂解产物到深孔板的裂解结合位，装载入磁珠法自动核酸提取仪，经裂解与磁珠结合、洗涤A、洗涤B洗涤、最后纯化后的核酸释放于洗脱液中
1.取20μl洗脱产物至PCR管中，加入85μl Qiagen的Bisulfite solution,吸打混匀，加入35μl DNA Protect buffer,吸打混匀，至溶液呈均匀蓝色
5.盖上盖子，上PCR仪，程序为：95℃5min、60℃10min，95℃5min、60℃10min,取出PCR 管，转移转化后核酸至离心管中
6.加入310μl buffer BL,混匀，加入250μl无水乙醇，混匀,转移上液至MinElute柱子， 6000g×1min
7.加入500μl buffer BW，6000g×1min；加入500μl buffer BD，室温放置15min，6000g ×1min
8.加入500μl buffer BW，6000g×1min；加入500μl buffer BW，6000g×1min
9.加入250μl无水乙醇，6000g×1min,取出柱子，放置入新的套管，高速离心1分钟，使柱膜上不残留任何液体
10.取出柱子，放置入新的采集管，加入15μl buffer EB,室温1分钟，使液体充分浸润膜， 6000g×1min，采集管中的液体即为纯化后的转化核酸
取上述核酸模板2-10μl，经CRMP4、PITX2、RASSF1A、SOSTDC、CYBA、EFEMP1、KDM5D、GSTP1、 WFDC2、TACSTD2等基因的甲基化特异化荧光QPCR检测，根据阳性信号的组合即可判断为前列腺癌及其淋巴结转移风险
一步法纯化甲基化DNA包括以下步骤：
1.取5-50ml尿液3000rpm×10min,弃上清
2.沉淀中加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)混合，加入裂解液0.5ml-5ml,吹打混匀
3.转移0.5ml裂解产物到深孔板的裂解结合位，再加入80μl亚硫酸氢钠、20μl DNA保护剂，吸打混匀。再加入乙醇300μl，吸打混匀。最后将深孔板装载入磁珠法自动核酸提取仪，经裂解与亚硫酸氢盐的转化反应、转移磁珠结合、洗涤A、洗涤B、洗涤B洗涤、最后纯化的转化DNA释放于洗脱液中
注：深孔板的第1列为空位、第2列加有300μl磁珠、第3列加有900μl洗涤液A、第4列加有900μl洗涤液B、第5列加有900μl洗涤液B、第6列有100μl洗脱液。
4.取上述核酸模板2-10μl，经CRMP4、PITX2、RASSF1A、SOSTDC、CYBA、EFEMP1、KDM5D、 GSTP1、WFDC2、TACSTD2等基因的甲基化特异荧光PCR，根据阳性信号的组合即可判断为前列腺癌及淋巴结转移风险。
与现有技术比，本发明的方法与试剂具有快速简捷、可标准化、可自动化操作、检测结果准确可靠，具有较高的临床阳性预示值和阴性预示值。
附图说明：
图1-1是本发明对上海第十人民医院泌尿科的住院病人标本50例尿液(不低于10ml)，含25位膀胱癌患者、11例前列腺患者、其余为泌尿系统非肿瘤患者如前列腺增生、前列腺炎、尿道炎等患者对KDM5D基因位点的荧光PCR法检测结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图1-2是本发明对上海第十人民医院泌尿科的住院病人标本50例尿液(不低于10ml)，含25位膀胱癌患者、11例前列腺患者、其余为泌尿系统非肿瘤患者如前列腺增生、前列腺炎、尿道炎等患者对EFEMP1基因位点的荧光PCR法检测结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图1-3是本发明对上海第十人民医院泌尿科的住院病人标本50例尿液(不低于10ml)，含25位膀胱癌患者、11例前列腺患者、其余为泌尿系统非肿瘤患者如前列腺增生、前列腺炎、尿道炎等患者对PITX2基因位点的荧光PCR法检测结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图1-4是本发明对上海第十人民医院泌尿科的住院病人标本50例尿液(不低于10ml)，含25位膀胱癌患者、11例前列腺患者、其余为泌尿系统非肿瘤患者如前列腺增生、前列腺炎、尿道炎等患者对GSTP1基因位点的荧光PCR法检测结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图1-5是本发明对上海第十人民医院泌尿科的住院病人标本50例尿液(不低于10ml)，含25位膀胱癌患者、11例前列腺患者、其余为泌尿系统非肿瘤患者如前列腺增生、前列腺炎、尿道炎等患者对RASSF1基因位点的荧光PCR法检测结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图2-1是本发明对上海浦东医院泌尿科的病人标本38例尿液(不低于10ml)，含9例膀胱癌患者、20例前列腺患者、其余泌尿系统非肿瘤患者9例对CRMP4基因位点的荧光PCR法检测结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图2-2是本发明对上海浦东医院泌尿科的病人标本38例尿液(不低于10ml)，含9例膀胱癌患者、20例前列腺患者、其余泌尿系统非肿瘤患者9例对WFDC2基因位点的荧光PCR法检测结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图2-3是本发明对上海浦东医院泌尿科的病人标本38例尿液(不低于10ml)，含9例膀胱癌患者、20例前列腺患者、其余泌尿系统非肿瘤患者9例对TACSTD2基因位点的荧光PCR法检测结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
图2-4是本发明对上海浦东医院泌尿科的病人标本38例尿液(不低于10ml)，含9例膀胱癌患者、20例前列腺患者、其余泌尿系统非肿瘤患者9例对CYBA基因位点的荧光PCR 法检测结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整地描述，显而易见，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，均属于本发明保护的范围。
实施案例1：来自上海第十人民医院泌尿科的住院病人50例尿液(不低于10ml)，含25位膀胱癌患者、11例前列腺患者、其余为泌尿系统非肿瘤患者如前列腺增生、前列腺炎、尿道炎等患者。经本发明的技术方案，使用下述引物探针组合检测：KDM5D(FAM荧光)、EFEMP1(VIC荧光)、PITX2(ROX荧光)、RASSF1(CY5荧光)、GSTP1(NED荧光)，均采用高杂交分辨率的MGB探针，在ABI7500上运行程序：50℃2min、95℃5min，95℃10sec、 60℃40sec，循环40-45次，5色荧光检测。另外，分管单色荧光(均用FAM标记)检测可获得同样效果，但核酸模板要分几管检测，略为繁琐。序列如下：
KDM5D
KF:CATCTTAACCTCCGAACCCTACA
KR:ATAGCGTCGGAAAAATCGATTC
KP:FAM-ATACGAACCGTCTCACTC-MGB
EFEMP1
EF：GCGCCCCCTACTCCAAA
ER：GGGAAACGAGGAGTTGGTAAGG
EP:FAM-CCCTCTTTACCGCCCC-MGB
PITX2
PF：CCGCAAATCGCCAAACC
PR：TTATTGTTATAGCGCGTTTAGTTTGTC
PP:FAM-AACTTACTTTTTCTATCTACCC-MGB
RASSF1
RF：GTCCGTAACCGCCAACCA
RR：TTGCGGCGCGGTTTT
RP：ACGCGTATCAATATAC
GSTP1
GF：GCCGAAACATCGCGAAAA
GR：TTGTGAAGCGGGTGTGTAAGTT
GP：CCGCTACGATCCCG
检测结果如图1-1至图1-5：11例前列腺癌患者有10例为阳性、1例为阴性，25例膀胱癌患者中24例阴性、1例为阳性，其他14例非肿瘤患者中检出1例阳性。阳性预示值为83.3％，阴性预示值为97.4％。
实施案例2：来自上海浦东医院泌尿科的病人标本38例尿液(不低于10ml)，含9例膀胱癌患者、20例前列腺患者、其余泌尿系统非肿瘤患者9例。经本发明的技术方案，使用下列引物探针组合检测，CRMP4(FAM)、WFDC2(VIC)、TACSTD2(NED)、CYBA(CY5)，均采用高杂交分辨率的MGB探针，在ABI7500上运行程序：50℃2min、95℃5min，95℃10sec、60℃40sec，循环40-45次，4色荧光检测。
检测结果如图2-1至图2-4：20例前列腺患者中有18例检出为阳性，而9例膀胱癌患者及 9例非肿瘤患者均为阴性。阳性预示值为100％，阴性预示值为90％。另外根据CRMP4检出阳性来预判淋巴结转移：18例中有8例淋巴结转移，临床实际上为6例转移。
CRMP4
CF：TCTACAACACCTCTTTACCGATAACG
CR：GGGTTAAGGTCGGGAAGAGAGT
CP：AACGAACGCGAACTC
WFDC2
WF：CGAAATATCCGCGTTCAACA
WR：GGAGGTGGAGAGATTATTGATGGT
WP：ATCCTCCCAAATTAC
TACSTD2
TF：CCTACCCCGCCGAATACC
TR：TAAGAAGGTGGAGATTAAGGAATTGG
TP：ACAAACTCGATTCCTTTCT
CYBA
F：CCAAACTTCAACTCTCAAACACTAACA
R：TAGACGTTTGGTTGATACGGGATT
P：CCCTACCCAATACTC。
KDM5D
KF: CATCTTAACCTCCGAACCCTACA
KR: ATAGCGTCGGAAAAATCGATTC
KP: FAM-ATACGAACCGTCTCACTC-MGB
EFEMP1
EF：GCGCCCCCTACTCCAAA
ER：GGGAAACGAGGAGTTGGTAAGG
EP: FAM-CCCTCTTTACCGCCCC-MGB
PITX2
PF：CCGCAAATCGCCAAACC
PR：TTATTGTTATAGCGCGTTTAGTTTGTC
PP: FAM-AACTTACTTTTTCTATCTACCC-MGB
RASSF1
RF：GTCCGTAACCGCCAACCA
RR：TTGCGGCGCGGTTTT
RP：ACGCGTATCAATATAC
GSTP1
GF：GCCGAAACATCGCGAAAA
GR：TTGTGAAGCGGGTGTGTAAGTT
GP：CCGCTACGATCCCG
CRMP4
CF：TCTACAACACCTCTTTACCGATAACG
CR：GGGTTAAGGTCGGGAAGAGAGT
CP：AACGAACGCGAACTC
WFDC2
WF：CGAAATATCCGCGTTCAACA
WR：GGAGGTGGAGAGATTATTGATGGT
WP：ATCCTCCCAAATTAC
TACSTD2
TF：CCTACCCCGCCGAATACC
TR：TAAGAAGGTGGAGATTAAGGAATTGG
TP：ACAAACTCGATTCCTTTCT
CYBA
F：CCAAACTTCAACTCTCAAACACTAACA
R：TAGACGTTTGGTTGATACGGGATT
P：CCCTACCCAATACTC

Claims (3)

1.一种尿液无创检测前列腺癌及其淋巴转移的分子诊断方法与试剂，包括尿液核酸提取纯化及亚硫酸氢盐转化及后续的核酸纯化，多基因启动子甲基化特异荧光PCR检测：CRMP4、PITX2、RASSF1A、SOSTDC、CYBA、EFEMP1、KDM5D、GSTP1、WFDC2、TACSTD2等。
2.所述的甲基化特异荧光PCR，特征是采用TaqMan MGB探针和甲基化特异引物，对正常人及肿瘤患者的基因组DNA无扩增检测信号，经内参标化后，对亚硫酸氢盐转化后的正常人基因组DNA也无扩增检测信号，只对亚硫酸氢盐转化后的肿瘤患者基因组DNA有反应性，检出阳性信号。
3.所述核酸提取纯化方法为自动化磁珠法，所述的试剂特征为核酸提取与亚硫酸氢盐转化既可同步也可分步完成。所述的甲基化特异荧光PCR扩增检测试剂，可以是3-5种靶基因组合，也可以是更多基因组合。组合中含有用作标化细胞浓度或甲基化水平的内控基因。
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