CN108441561A - 一种双重甲基化荧光定量pcr法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒 - Google Patents

一种双重甲基化荧光定量pcr法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种双重甲基化荧光定量PCR法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒。所述试剂盒包括上述p16、RASSF1A两个靶基因的引物及探针；此外还包括GAPDH的正向引物及探针，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH2O。本发明采用p16、RASSF1A两个靶基因联合进行膀胱癌的检测，检测灵敏性高、特异性强。

Description

一种双重甲基化荧光定量PCR法用于膀胱癌早期筛查检测的 试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种双重甲基化荧光定量PCR法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒。
背景技术
P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994年美国冷泉实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50％肿瘤细胞株纯发现有纯合子缺失，突变，认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因。P16基因编码产物是16KD的蛋白，即P16蛋白，定位于细胞核内， P16蛋白是作用于细胞分裂周期(Cell Division Cycle)关键酶之一的CDK4的抑制因子。它的表达一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。P16基因的突变与缺失，是判断肿瘤的性质及预后的一项重要指标。P16基因已经在膀胱癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤组织中发现纯合子缺失以及无义，错义及移码突变，表明P16基因以缺失，突变方式广泛参与肿瘤形成，检测P16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。
RAS相关区域家族lA基因(RASSF1A)是新近发现的一个位于人染色体3p21.3上的抑癌基因。RASSF1A表达的缺失是人类恶性肿瘤中最常见的一个分子事件。RASSF1A基因启动子CpG岛的甲基化在许多肿瘤组织和肿瘤患者体液中检测到，而在正常组织和体液中罕见，提示它具有肿瘤标志物的特征；RASSF1A与其他一些基因组合的甲基化分析有助于膀胱癌、肾癌、肺癌等的早期诊断。首先，RASSF1A甲基化可作为恶变危险因素的监测，良性增生性病变RASSF1A甲基化的出现往往提示恶变的危险性增高。其次，应用于预后判断，因为某些恶性肿瘤RASSF1A甲基化与患者预后不良相关联。此外，RASSF1A甲基化提供了顺铂和三苯氧胺治疗是否耐药的一个标志，并可在癌症患者整个治疗过程给予监控。总之，RASSF1A甲基化作为肿瘤生物标志物在肿瘤的诊断及其他众多领域诸多的临床应用前景。研究表明，在膀胱癌组织和膀胱癌患者的尿液对RASSF1A启动子甲基化的研究中发现，在有3p21.3杂合子丢失的膀胱肿瘤细胞系中，有72.7％的RASSF1A启动子被甲基化；在50％的膀胱癌患者的尿液中探测到了RASSF1A启动子的甲基化，且它对肿瘤的检查比传统的细胞学检查更加敏感，特别是恶性较低的病例。RASSF1A甲基化能作为理想的肿瘤生物学标志有3个主要原因：首先，甲基化可发生于许多类型的肿瘤；第二，这些肿瘤中甲基化的频率通常是中到高度，因此能提供一个较高频度的诊断范围；第三，RASSF1A甲基化在正常组织罕见。
目前，尿脱落细胞学和膀胱镜检查仍然是膀胱癌诊断和监测的“金标准”。尿脱落细胞学检测虽可作为一非损伤性的诊断手段，特异性高，但敏感性较低，且由于炎症或放化疗影响会有一定的假阳性率，存在临床检出率低及准确性差等不足。最新研究表明，尿细胞学检查实际上只发现了71％的G3级肿瘤，诊断低级别肿瘤的敏感性则更低，而膀胱镜检查是有创检查，其不足之处为操作相对创伤性大，又受检查者操作经验及技巧的影响，存在患者痛苦大，医疗费用高昂等局限，作为一种膀胱癌筛查方法在临床工作中收到一定的制约，且不能进行早期诊断。因此，寻找特异度、敏感度均较高的无创检查方法具有重要的临床意义。
发明内容
本发明主要目的是提供一种特异性强、灵敏度高的双重甲基化荧光定量PCR法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明目的之一，提供一种用于膀胱癌检测的引物及探针，所述引物以p16靶基因片段为模板设计得到，序列如下：p16的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。
所述引物以RASSF1A靶基因片段为模板设计得到，序列如下：RASSF1A的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；所述荧光探针序列为SEQ IDNO.6，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。
本发明目的之二，提供一种以上所述的引物及探针在制备用于膀胱癌检测的试剂盒的应用。
本发明目的之三，提供一种试剂盒，包括上述p16、RASSF1A两个靶基因的引物及探针；此外还包括检测GAPDH的正向引物及探针，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH2O。
本发明目的之四，提供一种上述试剂盒的使用方法，步骤如下：
(1)样本中基因组DNA的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液、蛋白酶K、漂洗液和ddH2O提取，得基因组DNA溶液；
(2)DNA甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组DNA溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的DNA；
(3)将步骤(2)修饰后的DNA进行PCR扩增。
本发明目的之五，提供所述的试剂盒在制备检测早期膀胱癌试剂中的应用。
本发明取得的有益效果：
(1)本发明采用p16、RASSF1A两个靶基因联合进行膀胱癌的检测，检测灵敏性高、特异性强；所用引物专一性强，采用本发明引物进行扩增，扩增条件易于摸索，特异性强，优于其它引物。
(2)本发明试剂盒不仅可以发现膀胱癌，也可以发现癌前腺瘤，为通过摘除癌前腺瘤而预防膀胱癌提供了可能性；本发明试剂盒可以同时发现左右两侧膀胱肿瘤，减少检测盲区和漏诊。
(3)本发明检测方法完全无创，仅需50mL尿液便可完成检测，同时可使无症状人群接受度高。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
本发明目的之一，提供一种用于膀胱癌检测的引物及探针，所述引物以p16靶基因片段为模板设计得到，序列如下：p16的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。
所述引物以RASSF1A靶基因片段为模板设计得到，序列如下：RASSF1A的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；所述荧光探针序列为SEQ IDNO.6，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。
本发明目的之二，提供一种以上所述的引物在制备用于膀胱癌检测的试剂盒的应用。
本发明目的之三，提供一种试剂盒，包括上述p16、RASSF1A两个靶基因的引物及探针；此外还包括检测GAPDH的正向引物及探针，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH2O。
检测GAPDH的正向引物及探针可采用本领域内已知的引物及探针即可。
本发明目的之四，提供一种上述试剂盒的使用方法，步骤如下：
(1)样本中基因组DNA的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液、蛋白酶K、漂洗液和ddH2O提取，得基因组DNA溶液；
(2)DNA甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组DNA溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的DNA；
(3)将步骤(2)修饰后的DNA进行PCR扩增。
进一步，步骤(1)所述样本为尿沉淀细胞。
进一步，PCR反应液为：PCR Master Mix 20μL，引物及探针3μL，总量/人份233μL。
进一步，PCR反应条件为：
本发明目的之五，提供所述的试剂盒在制备检测早期膀胱癌试剂中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1用于检测膀胱癌尿沉淀细胞甲基化水平的引物和探针设计
本发明根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列p16、RASSF1A 基因序列，设计引物，引物由TAKARA(宝生物工程有限公司)合成，探针由LifeTechnologies 合成。
(1)检测p16基因片段甲基化的核酸序列(FAM荧光通道)
正向引物序列为SEQ ID NO.1(5’-AGCGGGCGGCGGGGAGTAGTA-3’)，
反向引物序列为SEQ ID NO.2(5’-AGTCGGCGGCGGGGAGTAGTATG-3’)，
荧光探针序列为SEQ ID NO.3(5’-FAM-GATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTT-MGB-3’)；
荧光探针SEQ ID NO:A3的5′端标记FAM(荧光报告基团)，3′端标记MGB(荧光淬灭基团)。
(2)检测RASSF1A基因片段甲基化的核酸序列(VIC荧光通道)
正向引物序列为SEQ ID NO.4(5’-GGATTTTGGGGGAGGCG-3’)，
反向引物序列为SEQ ID NO.5(5’-CCAACGAATACCAACTCCCG-3’)，
荧光探针序列为SEQ ID NO.6(5’-VIC-CCCGACATAACCCGATTAAACCCGTACTT-MGB -3’)；荧光探针SEQ ID NO:A6的5′端标记VIC(荧光报告基团)，3′端标记MGB(荧光淬灭基团)。
实施例2一种试剂盒
所述试剂盒包括上述p16、RASSF1A两个靶基因的引物及探针；此外还包括检测GAPDH 的正向引物及探针，PCR Master Mix，裂解液、蛋白酶K、漂洗液、亚硫酸氢盐溶液和ddH2O。
p16的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。
RASSF1A的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.6，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。
检测GAPDH的正向引物及探针可采用本领域内已知的引物及探针即可。
实施例3所述试剂盒的使用方法
(1)尿沉淀细胞基因组DNA的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液、蛋白酶K、漂洗液和ddH2O提取，得基因组DNA溶液；
具体步骤为：
吸取200μL尿液样本，置于1.5mL离心管中，加入1mL裂解液1，然后持续涡旋振荡混匀1min，然后将1.5mL离心管置于70℃水浴5min。
将1.5mL离心管从水浴锅内取出，12,000rpm离心5min，缓慢吸取300μL上清液至新的 1.5mL离心管中。
向新的1.5mL离心管中依次加入200μL裂解液2和20μL蛋白酶K，涡旋混匀。
将新的1.5mL离心管置于70℃水浴10min。
添加200μL异丙醇，涡旋混匀。
将上一步所得溶液全部加入一个吸附柱中(将吸附柱套入收集管中)，12,000rpm离心 30sec，弃废液。
向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30sec，弃废液。
12,000rpm离心2min，弃废液；将吸附柱室温静置2min，以彻底挥发吸附柱中残留的漂洗液。
将吸附柱转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL洗脱液，室温静置2min， 12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
(2)DNA甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组DNA溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的DNA；
具体步骤为：
将步骤(1)提取的DNA全部转移至0.2mL离心管中，添加150μL亚硫酸氢盐溶液；通过轻弹离心管或移液器轻柔吹打操作混匀后短暂离心。
将离心管放置于温度循环变温器中并按照以下条件设置：
①98℃10min
②64℃1.5h
③4℃(≦20h)
向吸附柱中加入500μL结合液，再将上一步的混合液转移至吸附柱中，盖上管盖并颠倒混匀，12,000rpm离心30sec，弃废液。
向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30sec，弃废液。
12,000rpm离心2min，弃废液；将吸附柱室温静置2min，以彻底挥发吸附柱中残留的漂洗液。
将吸附柱转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL洗脱液，室温静置2min， 12,000rpm离心2min后将溶液收集到离心管中。
(3)将步骤(2)修饰后的DNA进行PCR扩增。
按照下列表2配置PCR反应液：
表1
PCR反应液充分混匀后，按每管23μL体积分装于PCR八联管中，并做好标记后转移至样本处理区。
将待检BisDNA(甲基化转化后的DNA)样本，按每孔2μL的量加入到分装好的PCR八联管中，压紧管盖，并短暂离心，将管壁液体离心至管底。
将PCR八联管放置在仪器样本槽的相应位置，并记录好摆放次序。
仪器检测通道选择：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2(GAPDH)： Cy5，Quencher Dye2：none；Passive Reference：none。
对应检测孔的设定：在扩增反应开始前，将待检样本和质控品设定为“Unknown”。
按以下条件设置PCR反应，如表2所示.
表2
对20个膀胱患者(编号为1-20)和20个正常人的尿液(21-40)和5个尿道炎患者(41-5) 尿液DNA样本进行检测。膀胱癌患者样本来自于中山市人民医院泌尿科，正常人样本来自于自愿者尿液样本。对上述样本进行检测，各样本的详细检测结果的CT值见表3。
表3各样本荧光定量PCR检测结果的CT值
(2)根据表3，按照如下公式计算得到灵敏度和特异性：
灵敏度＝检测结果为阳性的膀胱癌样本数/总的膀胱癌样本数；
特异性＝检测结果为阴性的非膀胱癌样本数/总的非膀胱癌样本数；
结果如表4所示。
表4本发明试剂盒检测膀胱癌的特异性和灵敏度
P16 RASSF1A P16、RASSF1A联合
灵敏度 50％ 75％ 90％
特异性 100％ 100％ 100％
由表4检测结果中可以看出，本发明P16灵敏度为50％，特异性为100％；RASSF1A灵敏度为75％，特异性为100％；P16、RASSF1A联合检测，灵敏度可达90％，特异性为100％。
最后说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽达健医学科技有限公司
<120> 一种双重甲基化荧光定量PCR法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒
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<213> 人工序列
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agcgggcggc ggggagtagt a 21
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<400> 2
agtcggcggc ggggagtagt atg 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gattggttgg ttacggtcgc ggtt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggattttggg ggaggcg 17
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ccaacgaata ccaactcccg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccgacataa cccgattaaa cccgtactt 29

Claims (10)

1.一种用于膀胱癌检测的引物及探针，其特征在于，所述引物以p16靶基因片段为模板设计得到，序列如下：p16的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ IDNO.2所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。
2.一种用于膀胱癌检测的引物及探针，其特征在于，所述引物以RASSF1A靶基因片段为模板设计得到，序列如下：RASSF1A的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.6，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。
3.一种如权利要求2或3所述的引物及探针在制备用于膀胱癌检测的试剂盒的应用。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2、权利要求3所述的引物及探针。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测GAPDH的正向引物及探针，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH2O。
6.根据权利要求4所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：
(1)样本中基因组DNA的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液、蛋白酶K、漂洗液和ddH2O提取，得基因组DNA溶液；
(2)DNA甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组DNA溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的DNA；
(3)将步骤(2)修饰后的DNA进行PCR扩增。
7.根据权利要求5所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)所述样本为尿沉淀细胞。
8.根据权利要求5所述试剂盒的使用方法，其特征在于，PCR反应液为：PCR Master Mix20μL，引物及探针3μL，总量/人份233μL。
9.根据权利要求5所述试剂盒的使用方法，其特征在于，PCR反应条件为：
10.根据权利要求4所述的试剂盒在制备检测早期膀胱癌试剂中的应用。
CN201810374456.2A 2018-04-19 2018-04-24 一种双重甲基化荧光定量pcr法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒 Pending CN108441561A (zh)

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