CN101519686B - 用于胃癌和胃癌组织转移的分子检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术和医学领域，公开了一种胃癌标志基因S100A2及其用途，其可作为检测胃癌或胃癌组织转移的标志物。本发明还公开了检测胃癌标志基因的试剂或试剂盒及其用途。本发明首次发现并证实S100A2基因与胃癌或胃癌组织转移的密切相关性，并开发了可用于临床的试剂和试剂盒，从而为胃癌或胃癌组织转移的诊断或治疗提供了新的途径。

Description

用于胃癌和胃癌组织转移的分子检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域；更具体的，本发明涉及一种胃癌标志基因及其用途，检测胃癌标志基因的试剂或试剂盒及其用途。

背景技术

在所有恶性肿瘤中，每年全世界胃癌死亡人数约650,000人，致死率仅次于肺癌，居于恶性肿瘤第二位。在中国，胃癌发病率和死亡率均居消化系统恶性肿瘤的首位，每年死于胃癌者约36万人，占世界同期胃癌死亡人数的40％，五年生存率仅5％-15％。

目前中国临床诊断中多为症状性筛选，即出现腹部不适、隐痛、泛酸、嗳气或消瘦、黑便等症状后进行内镜、胃钡餐等检查，最终检出的胃癌绝大部分为进展期胃癌。现有的诊断方法如血清学免疫检测通常使用的标志物如CEA、CA系列抗原，普遍存在灵敏度低、特异性差，尤其是对早期胃癌检出率、有效性都很低。常用的细胞学检测虽然低廉简便，灵敏度同样偏低，而影像学检测仅对有较大占位的恶变肿瘤有很高的诊断率。中国是发展中的人口大国，经济条件欠发达，开展全民性的胃癌普查筛选困难重重。

目前临床最有效的诊断方法是胃镜结合病理的方法，具有较高的胃癌诊断率。但由于绝大多数胃癌患者早期并无明显症状，约70％的病人就诊初期往往只有胃炎症状而被接受质子泵抑制剂的抑酸疗法，这种疗法容易使病变边缘正常细胞增生并掩盖恶变细胞，导致胃镜和胃镜取样组织后病理的观察存在较大的误诊/漏诊率。日本等国因此规定：胃镜下活检病理报告为中度不典型增生及以上患者，需重复多次胃镜及活检为免延误诊断。这种方法既费人力、财力又增加患者的痛苦，难以在中国推广。更重要的是，目前常规的胃镜检查和病理学诊断均基于形态学的判断，对于操作人员的经验技术有较高的要求。在实际应用中，这种非客观、非标准化的检测发生漏诊和误诊的现象不是少数，而且对有不典型增生、早期胃癌、胃癌进展期等组织学特征进行的区分，目前尚难以有明确的界限。对于早期胃癌的判断标准，临床上还是以手术切除后进行病理检查发现癌细胞为标准，缺乏在手术前的依据，这在很大程度上依赖与胃镜检查的医生的经验，难以做到标准化。客观上需要有在胃镜下取材进行病理学检查时的辅助手段或指标，能够帮助医生进行胃癌尤其是早期胃癌的判断，提高诊断的准确率，减少漏诊。其次，由于多数癌症患者临床确诊时已属中晚期，如何用分子诊断方法进行手术后病人预后的监测和有效治疗方法的选择，是改善预后的有效方法。

发展具有高灵敏性、特异性强的胃癌分子诊断技术和产品，是提高中国胃癌早期检出率、改善患者预后的关键之一。S100A2是EF-手性钙结合蛋白S100超家族成员。S100蛋白是一组分子量10～12kD的钙结合蛋白，氨基酸序列在脊椎动物中高度保守，目前共发现有20种结构与功能相似、存在于不同部位的可以调节细胞内和细胞外Ca²⁺的S100蛋白。S100蛋白家族成员具有广泛的生物学活性，通过钙离子信号转导、影响激素分泌和抑制微管蛋白的组装及抑制蛋白激酶C介导的磷酸化等途径，在细胞增殖、分化、肌肉收缩、基因表达、分泌、及细胞凋亡中发挥重要作用。多个S100家族成员被发现和人类癌症的发生发展相关，其中S100A2在肿瘤中的作用和临床意义仍然存在一些争议。在乳腺癌S100A2通常下调表达，以致被描述为潜在的肿瘤抑制基因。也有报道认为肺癌中S100A2下调或检测不到，而其它一些研究认为肺癌中S100A2 mRNA和蛋白水平均呈现过表达，且和预后相关。多项研究发现在宫颈癌、黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌及皮肤上皮瘤中S100A2过表达。S100A2在胰腺癌中过表达已发现和肿瘤进展、预后不良密切相关。

综上，尽管已知然S100A2在某些肿瘤中有异常表达，然而本领域目前对于S100A2在肿瘤中的作用仍然存在争议，且其在不同种类肿瘤中的作用也应该是不同的，因此本领域迫切需要深入细致地研究和大规模验证S100A2与特定肿瘤的相关性，并开发出可临床应用的检测试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种S100A2基因的用途，其可作为胃癌和胃癌组织转移的标志基因。

本发明的另一目的在于提供检测胃癌标志基因的试剂或试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种S100A2基因的用途，用于制备检测胃癌或胃癌组织转移的试剂或试剂盒。

一种用于检测胃癌或胃癌组织转移的试剂(或材料)，所述的试剂选自下组：

(1)S100A2基因或转录本的特异性引物；和/或

(2)S100A2基因或转录本的特异性识别探针或表面固定有所述探针的芯片。

在另一优选例中，所述的试剂是引物，所述的引物是针对S100A2外显子的引物。

在另一优选例中，所述的引物是针对S100A2基因的外显子2(Exon2)和外显子3(Exon3)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子2和外显子3)；或

所述的引物是针对S100A2基因的外显子1(Exon1)和外显子2(Exon2)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子1和外显子2)；或

所述的引物是针对S100A2基因的外显子1(Exon1)和外显子3(Exon3)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子1和外显子3)。

优选的，所述的引物是针对S100A2基因的外显子2和外显子3的特异性引物。

在另一优选例中，所述的特异性引物是具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列的引物对。

在本发明的第二方面，提供前面任一所述的试剂(或材料)的用途，用于制备检测胃癌或胃癌组织转移的试剂盒。

在本发明的第三方面，提供一种检测胃癌或胃癌组织转移的试剂盒，所述的试剂盒中含有：前面任一所述的试剂。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：正常组织表达的S100A2基因或转录本(优选mRNA)的参照品。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：

核酸提取试剂；

聚合酶联反应(PCR)试剂；或

描述检测胃癌或胃癌组织转移的方法的说明书。

在另一优选例中，所述的试剂装于容器中。

在本发明的第四方面，提供一种检测受试者(优选体外检测)是否存在胃癌或胃癌组织转移的方法，所述方法包括：检测受试者组织样品中S100A2基因或转录本(优选mRNA)的表达，若表达量在统计学上高于(如高2倍以上，优选高5倍以上，更优选高10倍以上，最优选高30倍以上)正常水平，则该受试者存在胃癌或胃癌组织转移。

在另一优选例中，所述的组织样品选自：外周血、骨髓、淋巴结、腹腔清洗液、胃壁细胞或胃液。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了生物标记基因S100A2的序列，该基因包括三个外显子(Exon)，分别称为Exon1、Exon2和Exon3。

图2显示了S100A2在人体正常组织中的表达情况。所述组织包括除去红细胞和血小板的外周血细胞、胃粘膜、心脏、肺、前列腺、脾、肾、肝、乳腺、子宫内膜、膀胱和骨髓。

图3显示了通过Real-time PCR技术评估S100A2基因在胃癌/癌旁组织中mRNA表达比值。

图4显示了通过Real-time PCR技术诊断胃镜下标本的胃癌或胃炎/正常粘膜mRNA表达比值。

图5显示了通过Real-time PCR检测胃癌在阳性淋巴结和阴性淋巴结中表达差异。

图6显示了通过Real-time PCR检测外周血中游离胃癌细胞的准确度与细胞学检测的对比。

图7显示了通过Real-time PCR方法检测胃癌骨髓转移的准确度与细胞学检测的对比。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次发现S100A2基因表达水平的改变与胃癌或胃癌组织转移密切相关。具体地，S100A2基因表达的上调与胃癌或胃癌组织转移密切相关。因此可以通过检测S100A2基因表达(特别是S100A2 mRNA表达)来诊断胃癌或胃癌组织转移。

S100A2基因属于EF-手性钙结合蛋白S100超家族成员，其含有三个外显子(图1)：Exon1(SEQ ID NO：5)，Exon2(SEQ ID NO：6)，Exon3(SEQ ID NO：7)。

本发明人通过对大量的胃癌或胃癌组织转移患者的组织进行研究，并与胃炎患者的组织或正常对照等进行比较，从而有力地证实了S100A2基因与胃癌或胃癌组织转移的相关性。在本发明的实施例中，首先，本发明人比较了人体不同组织中S100A2 mRNA的表达，发现除肾组织以外的人体正常组织中S100A2均低度表达，因此对于S100A2用于病理条件下检测极为有利。然后，本发明分别比较了胃癌与癌旁组织、胃癌与胃炎、胃癌转移阳性淋巴结与阴性淋巴结中S100A2 mRNA的差异表达，结果发现胃癌中S100A2的表达比癌旁组织、胃炎显著增高，转移阳性淋巴结也比阴性淋巴结显著增高。因此，S100A2在恶性胃组织中异常高表达而在正常组织和胃炎组织不表达或很低表达。以S100A2作为诊断标志物，灵敏度高(可高于95％)且特异性良好(可达到100％)。

因此，基于本发明人的新发现，可以利用S100A2基因：(i)进行胃癌或胃癌组织转移的鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的胃癌或胃癌组织转移治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群胃癌或胃癌组织转移患病风险，早期监测早期预防。

本发明还提供了用于检测胃癌或胃癌组织转移的试剂。所述的试剂可以是：S100A2基因或转录本的特异性(与人体其它基因没有序列重复或互补)引物；或S100A2基因或转录本的特异性(不识别人体其它基因)识别探针；或表面固定有所述探针的芯片。

作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，所述的引物是针对S100A2基因外显子的引物，更佳的是针对S100A2的外显子2(Exon2)和外显子3(Exon3)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子2和外显子3)；或是针对S100A2基因的外显子1(Exon1)和外显子2(Exon2)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子1和外显子2)；或是针对S100A2基因的外显子1(Exon1)和外显子3(Exon3)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子1和外显子3)。

作为本发明的更优选的方式，所述的引物是针对S100A2基因的外显子2和外显子3的特异性引物，跨越外显子2和外显子3的引物对于PCR扩增是有利的。更优选的，所述的特异性引物是具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列的引物对，所述引物特异性好，扩增效果良好。

本发明还提供一种检测胃癌或胃癌组织转移的试剂盒，所述的试剂盒比已有胃癌检测试剂盒具有更好的特异性和选择性。所述的试剂盒中含有：用于检测胃癌或胃癌组织转移的试剂。所述的试剂可以是：S100A2基因或转录本的特异性引物；或S100A2基因或转录本的特异性识别探针；或同时包括引物和探针。通常，所述的试剂存在于适当的容器中。可使用稀释剂如去离子水将每种所述引物或探针调整到至少一种需要量的浓度，分装于容器中。

为了便于进行分析和比对，作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还含有：正常组织表达的S100A2基因或转录本(优选mRNA)的参照品。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。

此外，所述的试剂盒中还可包括描述检测胃癌或胃癌组织转移的方法的说明书和/或芯片图像分析软件等。

本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于S100A2基因或转录本的检测来判断胃癌及转移的产品均包含在本发明范围内。

所述的检测试剂也可以是S100A2基因或转录本的特异性识别探针或表面固定有所述探针的芯片。探针或芯片的制备方法是本领域的常规技术，制备方法例如可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expressionon a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人、蒋中华主编，《生物芯片》，北京：化学工业出版社，2000，1-130。

本发明还提供一种检测受试者是否存在胃癌或胃癌组织转移的方法，所述方法准确性良好，对于早期胃癌也可准确地诊断。所述方法包括：利用所述的检测胃癌或胃癌组织转移的试剂检测受试者组织样品中S100A2基因或转录本(优选mRNA)的表达，若表达量在统计学上高于正常水平，则该受试者存在胃癌或胃癌组织转移。

优选的，还设置检测对照，所述的对照可以是人正常胃粘膜组织的总mRNA，优选多人份正常胃粘膜组织混合的mRNA样品。

检测受试者组织样品中S100A2基因或转录本的表达的方法优选Real timePCR方法。

一种检测方法是：获得组织样品，从所述样品分离RNA；使用S100A2的特异性引物从RNA样品中扩增cDNA拷贝，量化扩增的cDNA拷贝，使用量化的扩增的cDNA拷贝来评估胃癌疾病进展或治疗效果。

检测S100A2 mRNA表达的方法还有很多种，包括可以用名为基于核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplification，NASBA)的体外RNA扩增技术。当然，RNA体外扩增技术不限于NASBA，其它已知的RNA扩增方法和即刻的方法和试剂盒也是可用的。非限制性例子有多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，转录酶介导的扩增(transcriptase mediated amplification，TMA)，连接酶链反应(ligase chain reaction，LCR)。扩增产物通过Beacon方法用荧光探针在均匀相中被检测，或产物可通过荧光或测热法(fluorescent orcalorimetric method)在固相中检测。根据当前发明检测和/或定量靶基因RNA，多种荧光、测热或酶法可以被应用。最佳的是，基于特殊荧光探针的实时PCR技术，其中荧光探针可以是标记了荧光的特异互补于S100A2的序列，也可以是非特异性的双核苷酸染料如SYBR Green。

组织样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。所述的组织样品可以是(但不限于)：外周血、骨髓、淋巴结、腹腔清洗液、胃壁细胞或胃液。

此外，还可应用多变量统计学分析，将待测样品的数据与多种储液的对照数据比较，作出关于胃癌的诊断、进展或治疗效果的判断。

本发明的方法准确性高，可以在胃镜下或擦拭获取的看似正常的胃粘膜组织样品中检测编码S100A2的mRNA以诊断胃癌；可以确诊胃癌病人非胃组织中胃癌细胞转移尤其是微转移。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现并证实S100A2基因与胃癌或胃癌组织转移的密切相关性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为胃癌或胃癌组织转移的诊断与治疗提供了新的途径。

(2)开发出了适合于进行胃癌或胃癌组织转移检测的试剂或试剂盒，检测灵敏度良好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1.胃癌及转移组织的准备

实施例中所用标本均与病人签署知情同意书后按医院规定途径获取。

胃镜下获取的病理部位标本和非病理部位样本作为对比，也可是非胃镜方式如手术或胃壁擦拭法获取的细胞、手术中获取的淋巴结等样本应立即存放于含液氮或RANlater(ambion公司产品)中储存。

外周血、骨髓或腹腔灌洗液的样本首先通过离心机1000-2000rpm/分钟进行10分钟离心，收取离心后的细胞沉淀物，置于液氮或RNAlater中储存。

实施例2.样本中RNA抽提、逆转录和扩增

上述样本用商业化的核酸抽提方法进行，一个常用的非限制性例子是酚/氯仿抽提方法，如用Invitrogen公司生产的Trizol方法抽提总RNA，并进行RNA质量鉴定，相关方法可参照《分子生物学实验》等参考书描述。mRNA的逆转录过程采用商业化逆转录试剂盒并按操作说明书进行，所得cDNA按比例稀释成需要的工作浓度。所用特异性引物经优化设计，上下游引物分别设计为可扩增跨越S100A2基因Exon2和Exon3部分序列的引物，见图1。采用基于SYBR Green的荧光染料的Real-time PCR法进行靶基因S100A2的mRNA扩增。

针对S100A2基因的引物如下：

上游引物：GGAACTTCTGCACAAGGAGCTG(SEQ ID NO：1)；

下游引物：CACCTGCTGGTCACTGTTCTCA(SEQ ID NO：2)；扩增长度为106bp。

以β-actin为对照基因，引物如下：

上游引物：CCATCATGAAGTGTGTGACGTGG(SEQ ID NO：3)；

下游引物：TCTGCATCCTGTCGGCAAT(SEQ ID NO：4)；扩增长度为102bp。

相对基因丰度用公式2^(Rt-Et)/2^(Rn-En)计算，其中，Rt是胃癌组织或转移组织中β-actin的Ct(threshold cycle number)，Et是胃癌组织或转移组织中S100A2的Ct；Rn是正常对照组织中β-actin的Ct，En是正常对照组织中S100A2的Ct。

实施例3.人体不同组织中S100A2 mRNA表达差异

所用人体组织标本除正常胃粘膜组织为发明人从合作医院收集外，其它各组织均从商业化机构购买。采用Affymetrix的核苷酸芯片HG-U95Av进行各正常组织S100A2mRNA表达比较，操作过程参照产品说明书。本试验的信号值是通过管家基因β-actin荧光值进行归一化处理后的标准化信号值，信号值10上下表示信号很弱，mRNA含量极低。100左右信号值表示信号中等，mRNA表达量中等。如＞1000表示信号相对比较强，mRNA表达丰度较高。

结果如图2所示，除肾组织低度表达S100A2外，其它组织S100A2表达量极低，说明S100A2 mRNA表达在正常背景值相当低，这对S100A2用于病理条件下检测极为有利。

实施例4.手术胃癌及癌旁组织样本20对S100A2的表达差异

通过手术取样的样本均经病理验证后才进行RNA抽提和逆转录cDNA，Real-time PCR法鉴定S100A10在胃癌和癌旁组织中的表达差异，所用材料和方法同上，测试样本数为20个(G1-G20)。

图3的结果表明，胃恶性病理条件下特异性高表达S100A2 mRNA，而癌旁的正常组织低表达，差异倍数的中间值(media)达30-50倍，提示S100A2 mRNA可作为良好的胃癌分子标记物。

实施例5.胃镜下取样的胃癌、胃炎中S100A2表达差异

胃镜下取样与手术获取的样本具有较大的差别，主要表现在取样组织中胃癌细胞的比例变动很大，有时可能只占取到整块组织的很小一部分，为此本发明人专门评估了S100A2是否具有足够的灵敏度用于胃镜样本的辅助诊断。上述标本均通过病理证明。

先取了胃癌细胞从约1％到50％比例胃癌24例、胃炎10例组织用于本次评估实验，方法同样采用Real-time PCR相对定量方法，对照基因为β-actin，以本病人的非病变部位中S100A2 mRNA表达作为参照计算荧光相对强度。

图4的结果表明，S100A2具有很高的灵敏度(95.8％)和100％的特异性用于在胃镜取样下胃癌的辅助诊断，可提高胃癌病理诊断的客观性和准确率。

实施例6.S100A2 mRNA在胃癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中的表达差异

手术中获得的经病理证明为胃癌转移阳性的淋巴结9枚，且转移灶大小不等。病理阴性淋巴结8枚主要取自早期胃癌病人，原因是尽可能减少病理诊断阴性但实际有微转移存在的淋巴结，以避免实验误差。实验采取Real-time PCR检测方法，具体材料和过程同实施例2。

图5的结果表明，S100A2 mRNA在转移阳性淋巴结中高表达，而在阴性淋巴结中只有很低表达。病理阴性淋巴结中有两例检测出S100A2阳性的淋巴结，经病理医师连续切片细致观察，鉴定有微转移的存在。因此，从S100A2 mRNA表达程度划分不仅100％区分了细胞学检测结果，而且能检测细胞学不能检出的有微转移存在的淋巴结，相比细胞学检测该检测方法具有更高的灵敏度。

实施例7.定量PCR检测外周血中游离胃癌细胞的准确度与细胞学检测的对比

除去红细胞和血小板的外周血细胞抽取RNA，经Real-time PCR方法定量检测S100A2 mRNA表达水平，通过和胃炎病人和正常人表达量的对比，判断胃癌患者的外周血细胞中是否有游离胃癌细胞的存在，并和细胞学检测比对。

图6的结果表明，本发明的检测方法100％确认细胞学鉴定的阳性结果，同时可检测出细胞学鉴定为阴性的病例中有部分转移病例，说明该方法比细胞学检测具有更高的灵敏度，能检测到细胞学无法检测的微转移存在。

实施例8.定量PCR方法检测胃癌骨髓转移与细胞学检查结果的对比

穿刺等方法获得的胃癌患者骨髓经Real-time PCR方法定量检测S100A2 mRNA表达水平，通过和正常骨髓的比较判断S100A2 mRNA是否高表达，确认骨髓是否存在转移和微转移，并与细胞学结果进行比较。

图7的结果表明，本发明的检测方法能95％确认细胞学阳性的结果，同时阳性率高于细胞学结果，表明敏感性比细胞学检测方法高。

实施例9.检测试剂盒

制备一试剂盒，所述的试剂盒中含有：

(1)引物对，包括：

上游引物：GGAACTTCTGCACAAGGAGCTG(SEQ ID NO：1)；

下游引物：CACCTGCTGGTCACTGTTCTCA(SEQ ID NO：2)。

(2)常规的核酸抽提液、dNTPs、Taq酶、无RNA酶的H₂O(RNAase-free H₂O)、对照mRNA、逆转录酶、SYBR Green。

(3)使用说明书。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                    序列表

Claims (5)

1.一种S100A2基因的用途，其特征在于，用于制备检测胃癌组织转移的试剂或试剂盒。

2.一种用于检测胃癌组织转移的试剂，其特征在于，所述的试剂是针对S100A2基因的外显子2和外显子3的特异性引物，所述的特异性引物是SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的序列的引物对。

3.权利要求2所述的试剂的用途，其特征在于，用于制备检测胃癌组织转移的试剂盒。

4.一种检测胃癌组织转移的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：权利要求2所述的试剂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：

核酸提取试剂；

聚合酶联反应试剂；

正常组织表达的S100A2基因或转录本的参照品；或

描述检测胃癌组织转移的方法的说明书。

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