CN101353695A - 尿沉淀dna甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒 - Google Patents

尿沉淀dna甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN101353695A
CN101353695A CNA2007100441061A CN200710044106A CN101353695A CN 101353695 A CN101353695 A CN 101353695A CN A2007100441061 A CNA2007100441061 A CN A2007100441061A CN 200710044106 A CN200710044106 A CN 200710044106A CN 101353695 A CN101353695 A CN 101353695A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
methylation
bladder cancer
methylates
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2007100441061A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101353695B (zh
Inventor
朱景德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Cancer Institute
Original Assignee
Shanghai Cancer Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Cancer Institute filed Critical Shanghai Cancer Institute
Priority to CN200710044106.1A priority Critical patent/CN101353695B/zh
Priority to US12/670,491 priority patent/US20100317000A1/en
Priority to PCT/CN2008/071725 priority patent/WO2009012708A1/zh
Publication of CN101353695A publication Critical patent/CN101353695A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101353695B publication Critical patent/CN101353695B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/60—Complex ways of combining multiple protein biomarkers for diagnosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于检测受检对象是否患有膀胱癌的方法，包括以下步骤：(a)由受检对象提供尿沉淀样品；(b)测定样品中一或多个基因启动子区CpG岛中特定序列(以下称基因)的甲基化谱式；(c)将受检与正常对象的甲基化谱式进行比较，如果有一或多个基因处于高甲基化状态则说明受检对象患有膀胱癌。这项发明还提供了诊断膀胱癌的一套试剂盒。

Description

尿沉淀DNA甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及通过检测从正常(亦可非膀胱癌者)和膀胱癌(包括癌前阶段)个体的尿沉淀中基因的启动子区CpG岛中特定序列的甲基化谱式的差异来诊断膀胱癌的试剂盒和方法。
背景技术
人类和越来越多的模式生物基因组全测序的完成使对发育和疾病过程中基因组成和功能阐明进入了新的以对非DNA序列的为基础的表观遗传学信息层面的分析和诠释为中心的时代。表观遗传由DNA甲基化(胞嘧啶[CpG]甲基化)，非编码RAN，组蛋白修饰和染色质重塑所组成。该信息界面介于存储的遗传蓝图基因组DNA序列和表达模式决定的表型性之间。与遗传物质相比，它更容易受到环境的影响[1]。5’-CpG-3’序列中的胞嘧啶环(图1)上的甲基的添加是由三种DNA甲基转移酶(DNMT1，DNMT3a，和DNMT3b)中的一种以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体来实现的。亲本细胞中的甲基化谱式可以一种类似遗传信息的半保留复制机制的形式被如实地复制并且分配到子细胞中。甲基化是决定转录层面的记忆的关键机制。在早期胚胎细胞发育和生殖细胞成熟过程中(表观遗传的改编过程)两次重大变化期之间，DNA甲基化谱式的变化持续发生在整个个体生命过程中持续发生。表观遗传状态的稳控机制的异常会导至表观遗传损伤的积累，最终将导致包括癌症在内多种疾病[2]。
癌症是一受累于广泛的表观遗传缺陷和遗传缺陷的复杂疾病。这些缺陷模式随疾病和患病个体的不同而迥异[3]。DNA甲基化是建立在酶促反应的基础上在5’-CpG-3’二核苷酸回文序列内的胞嘧啶的五号碳原子上加上甲基(DNA甲基化)(图1)，是研究的最为清楚且是癌症表观遗传研究的焦点。
85％以上的CpG二核苷酸散布位于具有转录依赖性的转座潜能的重复序列中。在正常细胞中，它们处于高度甲基化/转录沉默的状态，是基因组的完整性所必须。肿瘤细胞基因组的广泛低甲基化的状态，导致重复序列的转录、转座活动上扬[2，4]，继而基因组的非稳定性和原癌基因转录增强[5，6]。其余的CpG成簇的分布于短的DNA区域(长度大约在0.2到1kb)，被称为“CpG岛”。约40-50％的基因在启动子区域或其附近有CpG岛，提示该类基因的转录可受着DNA甲基化介导的机制的调控。在正常细胞中它们多处于未甲基化的状态，但是，在肿瘤细胞中处于高度甲基化的状态导致的抑癌基因，DNA修复基因，细胞周期控制基因，抗凋亡基因等的转录沉默。
在癌症发生早期表观遗传异常的重要作用可表现为遗传印记丢失(LOI)。如，遗传印记基因IGF2基因的过表达则会促进细胞增殖，它的LOI可见之于结肠癌患者的正常的结肠上皮细胞，若其在循环的白细胞发生是患结肠癌的易感者的重要特征[7]。抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化/转录沉默是一很常见的癌前病变的现象[8，9]。例如，在肺癌被诊断前的35周时，在痰中的DNA中可以检测到的p16ink4A(抑癌基因)和MGMT(DNA修复基因)高度甲基化[8]。表观遗传状态异常也可导致干细胞的不正常增殖，继而促进癌症形成。H.pyrio感染和一些特定基因的异常甲基化之间有关系提示DNA甲基化状态的检测有一定的预警作用[10]。因此，对高危人群的外周DNA(血清，大便，痰和尿沉淀作为样品源)甲基化分析的肿瘤预警价值已被提到议事日程。最后，DNA甲基化谱式的异常可发生在癌症的任一阶段(异性增生，良性，局部和转移灶等)，可用于肿瘤分子分期和分型。
膀胱癌是美国在男性中发病率第四，女性中发病率第八的癌症http://www.cancer.gov/cancertopics/types/bladder)[11]。在迅速工业化的中国，膀胱癌发病率急速上升[12]。尽管70％以上的潜表病变可经手术治愈，其中50-70％的患者会患有更为严重的病患接受治疗，其预后凶险[13，14]。另外，病理分期和分型相似的膀胱癌的临床行为迥异[15]，显示现有系统的明显不足。膀胱癌诊断的金标准是膀胱镜镜检，附以病理检查。但其误诊率人高达10-40％[16-18]。尿沉淀细胞学分析是高特异，无损性检测手段，但无法有效地捡出处于Ta，G1，和T1期的膀胱癌[19]。对尿沉淀细胞DNA的遗传性检测来诊断膀胱癌的尝试已涉及导TP53基因的突变，杂合性的丢失，微卫星的不稳定和E-cadherin启动子的多态性[20，21]。尿沉淀细胞原位杂交来寻找染色体异常的方法可以特异性77.7％，检出68.6％的膀胱癌(http://www.urovysion.com)。对蛋白性标志物的尝试已有很多[22，23]。对尿液中MNP22蛋白定量虽比尿沉淀细胞学更灵敏，但有在患有良性泌尿生殖系统疾病(血尿症，膀胱炎，肾结石或者泌尿管感染)的患者的尿中水平亦很高的严重不足[24]。因此，仍然需要一种更灵敏更特异性的检测膀胱癌和其他类型的泌尿生殖系统癌症的方法，尤其是患病的早期检测。
DNA甲基化分析方法通常依赖于在任何放大步骤之前的原始基因组DNA的甲基化修饰，包含使用甲基化敏感的限制性内切酶消化和bisuphite处理[25]。后者研究了胞嘧啶和甲基化的胞嘧啶残基之间对于bisuphite调控的脱氨基作用(从C到U)的敏感性的巨大差别，从而可以104个正常细胞中检测出少至1-10个的肿瘤细胞[25]。检测包括支气管灌洗液，粪便，血清或血浆和尿沉淀等体液中的基因甲基化模式来在体外检测癌症努力已有很多。其他检测DNA甲基化谱式的方法包括甲基化的特异性酶消化，甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)[26]，限制酶界标基因组扫描(RLGS)[27]，差异性甲基化杂交(DMH)[28]，BeadArray平台技术(Illumina，USA)[29]，和碱基特异性切割/质谱分析(Sequenom，USA)[30]而测定的，以及还在或将开发出的新方法。
发明内容
发明者通过系统的研究，发现膀胱癌患者与非膀胱癌者之间的DNA甲基化模式差异，检测其可判定受检对象是否患有膀胱癌。该方法包括以下步骤：
1.提供受检对象尿沉淀的样本。
2.测定此尿沉淀中一或多个基因的甲基化的模式。所述基因选自下组：ABCC13，ABCC6，ABCC8，ALX4，APC，BCAR3，BCL2，BMP3B，BNIP3，BRCA1，BRCA2，CBR1，CBR3，CCNA1，CDH1，CDH13，CDKN1C，CFTR，COX2，DAPK1，DRG1，DRM，EDNRB，FADD，GALC，GSTP1，HNF3B，HPP1，HTERT，ICAM1，ITGA4，LAMA3，LITAF，MAGEA1，MDR1，MGMT，MINT1，MINT2，MT1GMT，MINT1，MINT2，MT1A，MTSS1，MYOD1，OCLN，p14ARF，p16INK4a RASSF1A，RPRM，RUNX3，SALL3，SERPINB5，SLC29A1，STAT1，TMS1，TNFRSF10A，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF21和WWOX。
3.将受检对象与正常研究对象的尿沉淀样品中所述基因的甲基化谱式进行比较，如果有一或多个基因处于高甲基化状态则说明上述受检对象患有膀胱癌。
本发明还提供了甲基化谱式分析和判定受检对象是否患膀胱癌的程序和标准。此方法和准则将被用于复发的诊断，预测和监控；以及决定肿瘤是否已经在外科手术中被移除。此发明的其他优点和特性已在下文结合附图的具体介绍中进一步阐明。
附图说明
图1是胞嘧啶(CpG)甲基化过程的示意图。在图1A中，由S腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体，DNA甲基转移酶(DNMT)1，3a或者3b催化加一个甲基(于图中圈出)到胞嘧啶核苷酸嘧啶环的5号位上。在图1B中，胞嘧啶的磺化(1，胞嘧啶变为胞嘧啶磺酸)，然后水解脱氨作用(2，胞嘧啶磺酸变为尿嘧啶磺酸)，最后碱的脱磺酸基作用(3，尿嘧啶磺酸变为尿嘧啶)促使了C到T的转变。甲基化的胞嘧啶不受此化学处理作用，因此，相对于未甲基化的CpG，甲基化的CpG可以在接下来的聚合酶链式反应(PCR)，包括甲基化特异性的PCR中被检测出来。
图2示出了20个基因的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)分析结果及其测序验证。
该图显示了在尿沉淀和细胞系中代表性的甲基化状态的MSP数据的电泳图谱及其序列验证。(泳道上方的数字为病人识别号码)，细胞系(5637，T24和SCaBER)。MSss1，表示以试管内甲基化修饰了的正常肝脏组织DNA作为阳性对照的结果。分图上方为基因名字。野生型(wild-type)的序列和由T载体克隆的代表性的PCR产物的序列并排。
图3显示11个有价值的基因在15例肿瘤组织和9例尿沉淀中的MSP分析结果。图3A显示了MSP结果的电泳图，所涉及的基因在每个图的左上角示出。作为上样量的参照，CFTR基因的非甲基化的MSP产物的电泳图(标志为CFTRu)示出。
注释：Ur：尿沉淀，和T：肿瘤组织；G XX：临床样品的编号，BJ，亚硫酸氢盐处理的源于一株正常纤维母细胞系DNA，用作为非甲基化DNA模版的对照。H2O：无DNA模版对照.M.Sss I：用M.Sss I在试管内甲基化的源于正常肝组织DNA的甲基化模版的阳性对照。
图3B显示了9对匹配的肿瘤组织和尿沉淀的MSP分析结果的小结。黑框示甲基化靶点，白框示去甲基化的靶点。
图3C以绘图的方式显示了肿瘤组织和匹配的尿沉淀中DNA甲基化谱式匹配情况。
Y坐标：亚组中甲基化靶点的百分率 T/Ur：组织和尿沉淀共有的；仅有T：组织仅有的；和仅有Ur：尿沉淀仅有的。在图柱顶部的是件数和(百分比)。
图4显示了膀胱癌中以及非癌性的泌尿系统病变对照的尿沉淀DNA中基因甲基化状态。图中绘出了在膀胱癌患者的尿沉淀中(栏2)和非肿瘤泌尿病变病例中(栏3，图4A)的每个基因(x轴)的甲基化频率(y轴，％)。Cl(ConfidentialIndex)，每个基因的置信度为95％的值在图上用垂直线表示出。图中也示出其甲基化状态可作为膀胱癌标记的基因的p值＜0.01和＜0.05的位置。
图5显示了有价值的膀胱癌检测的基因群(1到11个基因)敏感性和特异性的综合值(RECEIVER OPERATING CHARACTERISTICS(ROC)。每个基因组设置的灵敏性(％，栏4，图5A)和特异性(％，栏5，图5A)都已计算并制图。
具体实施方式
在一方面，此发明提供了一种检测试验者是否患有膀胱癌的方法，包括以下步骤：
1.提供受检对象的尿沉淀的样本。
2.测定尿沉淀中一或多个基因的甲基化的模式的方法。所述基因有：ABCC13，ABCC6，ABCC8，ALX4，APC，BCAR3，BCL2，BMP3B，BNIP3，BRCA1，BRCA2，CBR1，CBR3，CCNA1，CDH1，CDH13，CDKN1C，CFTR，COX2，DAPK1，DRG1，DRM，EDNRB，FADD，GALC，GSTP1，HNF3B，HPP1，HTERT，ICAM1，ITGA4，LAMA3，LITAF，MAGEA1，MDR1，MGMT，MINT1，MINT2，MT1GMT，MINT1，MINT2，MT1A，MTSS1，MYOD1，OCLN，p14ARF，p16INK4a，PTCHD2，RASSF1A，RPRM，RUNX3，SALL3，SERPINB5，SLC29A1，STAT1，TIMP3，TMS1，TNFRSF10A，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF21和WWOX。
3.将受检与正常对象的尿沉淀样品中所述基因的甲基化谱式进行比较，如果在其中存在一或多个基因处于高甲基化状态则说明受检对象患有膀胱癌。
“样本”或“样品”一词在此发明中被定义为包括从任何个体(如有泌尿系统症状受检者的样本)中获得的适合于DNA甲基化状态的检测。“尿沉淀”这个术语对行内的人士是熟知的，其包括从尿道脱落的上皮细胞等。尿沉淀的细胞学分析已用于对膀胱癌的临床诊断，因为膀胱肿瘤细胞会脱落而存在于尿液中。
在此发明中用到的样本也可是膀胱癌细胞系，比如T24(ATCC序号：HTB-4)，SCaBER(HTB-3)以及5637(HTB-9)。
此方法可适用于对泌尿生殖系统肿瘤检测。所指的泌尿生殖系统的癌症包括比如膀胱癌，前列腺癌和肾癌。同样，本发明的方法还可以检测出凡其肿瘤细胞可进入尿液的那些癌症。因此，所谓的“泌尿生殖系统癌症”也被包括在本发明的范围之内。
术语“受检对象”包括的范围不仅仅局限在哺乳动物(例如人类)。
“甲基化”和“高(度)甲基化”在此多为同意使用，定义为在一个基因序列中(通常在启动子中)CpG存在和高度甲基化。以MSP分析手段而言，以甲基化特异性引物所进行的PCR反应可获得阳性的PCR结果即可认为该受试的DNA(基因)区处于高甲基化状态。以实时定量甲基化特异性PCR而言，高甲基化状态的判定可随其对照样品的甲基化状态的相对值的统计学差异。
本发明的依据是CpG序列(例如在肿瘤相关基因启动子CpG岛区域中，下称基因)的甲基化状态在患膀胱癌者与正常或非膀胱癌者的不同。因此，下列基因中一或多个处于甲基化状态可提示受检对象可患膀胱癌症。所涉及的基因可为：ABCC13，ABCC6，ABCC8，ALX4，APC，BCAR3，BCL2，BMP3B，BNIP3，BRCA1，BRCA2，CBR1，CBR3，CCNA1，CDH1，CDH13，CDKN1C，CFTR，COX2，DAPK1，DRG1，DRM，EDNRB，FADD，GALC，GSTP1，HNF3B，HPP1，HTERT，ICAM1，ITGA4，PTCHD2，LAMA3，LITAF，MAGEA1，MDR1，MGMT，MINT1，MINT2，MT1A，MTSS1，MYOD1，OCLN，p14ARF，p16INK4a PTCHD2，RASSF1A，RPRM，RUNX3，SALL3，SERPINB5，SLC29A1，STAT1，TIMP3，TMS1，TNFRSF10A，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF21和WWOX。
更明确而言，SALL3，CFTR，ABCC6，HPR1，RASSF1A，MT1A，RUNX3，ITGA4，BCL2，ALX4，MYOD1，DRM，CDH13，BMP3B，CCNA1，RPRM，MINT1，和BRCA1中任一基因在尿沉淀中表现出高度甲基化状态则说明受检对象患有膀胱癌。
测定尿沉淀细胞DNA的甲基化谱式可通过已有的技术(如甲基化特异性PCR(MSP)和实时定量甲基化特异性PCR，Methylite)，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。在用亚硫酸氢盐处理之后，没有甲基化的胞嘧啶核苷酸将会被转变为尿嘧啶核苷酸，而甲基化的胞嘧啶核苷酸则保持不变。继而用能区分甲基化和未甲基化的DNA的引物对亚硫酸氢盐处理过的DNA来扩增，从而可决定受试DNA的DNA甲基化状态(30)。这种所谓MSP的PCR方法可以从临床含由大量源于正常细胞的DNA和少量肿瘤细胞的样品中检出肿瘤细胞，其前提示正常和肿瘤细胞的所示DNA区域(基因)的甲基化状态完全相反。使用MSP有可能从10000个正常细胞中检出1个肿瘤细胞。
检测甲基化水平时更倾向于使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)的方法。这种方法是基于一种荧光PCR的持续性的光学监控，其较MSP方法更为敏感(31)。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。如何设计引物和探针对行内人士是显而易见的。
其他可用的技术还有：通过甲基化特异性限制性内切酶消化，亚硫酸氢盐(bisulphite)DNA测序，甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)[26]，限制酶界标基因组扫描(RLGS)[27]，差异性甲基化杂交(DMH)[28]，BeadArray平台技术(Illumina，USA)[29]，和碱基特异性切割/质谱分析(Sequenom，USA)[30]等方法。
对大样品分析(包括与正常和/或非肿瘤对象的比较)将会获得肿瘤相关性多基因的甲基化模式，即可通过检测该套基因的甲基化状态来判断受检对象是否患有膀胱癌或它种泌尿生殖系统肿瘤(前列腺癌和肾癌等)。
本发明还提供了检测膀胱癌试剂盒，包括：
(a)测量一或多个在尿沉淀的基因甲基化谱式的方法，所述目标基因选自下组：ABCC13，ABCC6，ABCC8，ALX4，APC，BCAR3，BCL2，BMP3B，BNIP3，BRCA1，BRCA2，CBR1，CBR3，CCNA1，CDH1，CDH13，CDKN1C，CFTR，COX2，DAPK1，DRG1，DRM，EDNRB，FADD，GALC，GSTP1，HNF3B，HPP1，HTERT，ICAM1，ITGA4，LAMA3，LITAF，MAGEA1，MDR1，MGMT，MINT1，MINT2，MT1GMT，MINT1，MINT2，MT1A，MTSS1，MYOD1，OCLN，p14ARF，p16INK4a，PTCHD2，RASSF1A，RPRM，RUNX3，SALL3，SERPINB5，SLC29A1，STAT1，TIMP3，TMS1，TNFRSF10A，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF21和WWOX；
(b)提供判定一或多个受试基因的甲基化状态用于判定受检者是否患有泌尿生殖癌(如膀胱癌)的标准(特异性和敏感性)。
术语“测量一或多个在尿沉淀的基因甲基化样式的方法”包括任何可能对测量一或多个在尿沉淀的基因甲基化样式有用的实质技术测量，器材，设备和反应物。具体的方法要取决于采取的方案。
目前首选的检测基因甲基化状态方法是MSP和/或QMSP。本发明的MSP和/或QMSP试剂盒中，包括的试剂对行内人士显而易见：分离DNA的试剂和材料，PCR反应的聚合酶(比如Taq聚合酶)，亚硫酸氢酸钠盐，MSP/QMSP特异性缓冲液和相应的引物等。所有有关的试剂(引物等)都包括在现在发明的范围内。引物应该包含DNA或RNA和合成等价物取决于应用何种扩增技术。例如，对于标准PCR一个短的单链DNA引物对会被使用，两个引物在将被扩增的目标基因的两侧(包含CpG序列在内，与其中CpG互补为针对原为甲基化，而与其中TpG互补为针对原为取甲基化的基因区)。在核酸扩增技术中对业内人士示显而易见的。
本发明提供了已验证过的基因引物表(表2)作为例子。然而，本发明的范围并不局限于这些例子。
本发明也包括从基因在正常和/或非肿瘤对象尿沉淀(乃至组织)中的甲基化状态的信息。
下面提到的例子有助于对发明的理解。应该明确这些描述仅仅是作为例子。本发明的范围并不局限于这些例子。除非另有规定，这些技术对于有基本分子生化和相关领域的人而言是显而易见的。
例子
方法
组织，尿沉淀的采集和DNA的分离
在伦理委员会的同意和批准的前提下，在中国广西采集了15个膀胱癌组织(TNM分期I：7和II：8例)。从健康捐献器官者中获得3个正常的膀胱组织。从组织和尿沉淀制作DNA样品如下所述，从广西医院(40例)和中国上海中山医院(92例)的通过它法确诊的膀胱癌患者中采集50ml晨尿。在上海中山医院同时采集了79例手术后尿样。对照组包括23例非癌症泌尿疾病的患者作为对照(膀胱炎：8，前列腺增生：4，膀胱结石：3，肾结石：5，肾上腺结块：3)，6例神经病患者和7个健康志愿者。尿样细胞学分析和肿瘤结转移(TNM)演示和分类是依照WHO分类法和American Joint Committee on Cancer的指标。
重亚硫酸盐(bisulphite)处理和甲基化特异性PCR分析
对于甲基化或非甲基化的59个等位基因PCR检测引物对的来源：1，从已经发表的信息里面直接获得，和2，用软件设计以识别CpG岛。(http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html)和引物设计软件(http://micro-gen.ouhsc.edu/cgi-bin/primer3_www.cgi)(表.2)。
重亚硫酸盐处理后的DNA样品的脱盐是通过自制的琼脂糖在凝胶过滤系统进行的[31，32]。PCR产物通过测序被克隆或检验(图2示出20个基因为例子)。通过M.Sss I对正常肝脏组织DNA的体外甲基化作为阳性对照。
数据的统计学分析
基因的甲基化状态和每个临床病理学参数的关联性的显著性分析通过相关软件(http://www.Rproject.org)进行分析。每个基因的甲基化状态的膀胱癌特异性标记的显著性以95％的置信区间的方式表示(R package Hmischttp://cran.r-project.org/src/contrib/Descriptions/Hmisc.html)。通过2×2 fisher exact计算来判定膀胱癌(132例)尿沉淀的每个基因为甲基化频率与非癌症泌尿系统疾患(23例)的对比显著性。有价值的膀胱癌检测的基因群(1到11个基因)敏感性和特异性的综合值(RECEIVER OPERATING CHARACTERISTICS(RO得以计算并作图。
结果
寻找呈膀胱癌特异性甲基化状态的基因
59个基因(表.2)受检基因包括1，象CDKN2A，ARF，MGMT，GSTP1，BCL2，DAPK和HTERT等已有前人在膀胱癌或它种泌尿生殖系统肿瘤研究过，2，由我们自身的工作表明其在它类肿瘤中呈高甲基化状态的基因[31-43])，和3，生物信息学分析提示其功能上与肿瘤发生有关。图2A，显示11个有诊断价值的基因在3株膀胱癌中的甲基化状态，及其的甲基化和非甲基化靶点序列的序列分析的验证。图2B，显示20个有诊断价值基因的MSP数据和测序验证的典型的结果。
鉴于膀胱癌细胞系很可能含有临床膀胱癌的遗传和表观遗传水平上的缺陷，我们先在3株膀胱癌细胞系：T24(ATCC序号：HTB-4)SCaBER(HTB-3)和5637(HTB-9)中对59个基因开展了MSP分析。我们发现41个基因至少在一个细胞家系有一个等位基因为高甲基化(表.3)虽然，FADD，LITAF，MGMT和TNFRSF21基因为纯和去甲基化状态，有报道提出它们的高甲基化与膀胱癌相关[44，45]，我们从而将其和其它41个基因同时在11个膀胱癌和3个膀胱炎患者的尿沉淀样品中进行分析。在这初筛阶段剔除的14个基因为APC，BCAR3，BNIP3，CBR1，CBR3，COX2，DRG1，HNF3B，MDR1，MTSS1，SLC29A1，TIMP3，TNFRSF10A和WWOX.在11例尿沉淀分析中，21个基因在分别在1到10例(9％-90％)中呈高甲基化，而在3例膀胱炎患者中则否。这提示这些基因的高甲基化状态有不同程度的膀胱癌特异性。特征性地MAGEA1基因启动子去基化和伴有的转录的活化广泛地见于肿瘤。但本项膀胱癌研究中，该现象出现的频率很低(表.3)从而对其的进一步研究得以终止。以同样的理由，LAMA3，ICAM1和GALC基因被剔出。我们进而在15例癌组织DNA和3例正常膀胱组织中开展了32个基因DNA甲基化状态的分析。虽然在3例正常膀胱组织中的所分析的28个基因处于去甲基化的状态，其中19基因的高甲基化状态在15个受试者中有1-12个(6.7％-73.3％)膀胱癌组织被检测，提示其有不同程度的膀胱癌特异性。余下基因在肿瘤组织中亦为去甲基化状态：PTCHD2，BRCA1，CDH13，TMS1，CDH1，p14ARF，p16INK4a，FADD，LITAF，MGMT和TNFRSF2.为了确定肿瘤组织和尿沉淀细胞DNA甲基化谱式的相关性，我们同时对9个成对的样品进行了分析样品进行了MSP分析(图3)。在总共99个甲基化事件中，86个(87％)是肿瘤组织和尿沉淀共存的。11个甲基化事件(11％)仅见之于肿瘤组织，而仅见之于尿沉淀的甲基化事件为2个(2％)。两类样品间的不吻合率虽低仍有为13％，由此，为了避免丢失有价值的位点，我们将所有仅在一种样品中为甲基化状态的基因包括在下一步的研究之中：BRCA1和CDH13(仅在肿瘤组织中高甲基化)和PTCHD2(仅在尿沉淀中高甲基化).鉴于TMS1被认为是有价值的前列腺癌的标志物[44]，虽至此未发现其呈膀胱癌相关的甲基化状态，对它的分析仍继续进行下去。
膀胱癌和非膀胱癌对照组的尿沉淀DNA中21个基因甲基化状态
受试样品为膀胱癌(132例)和3个对照组『1)，神经疾病患者(6例)；2)，健康志愿者(7例)；3)，非癌的泌尿系统疾患患者(23例)，其中8例膀胱腺炎，4例前列腺肥大，3例膀胱结石，5例肾结石，3例肾上腺占位)膀胱癌患者的平均年龄为63.4(34-88)，与泌尿科非肿癌患者的平均年龄55.7(16-83)和神经疾病患者64.1(46-78)很接近。
在健康志愿者和神经疾病患者尿沉淀DNA中21个受试基因为去甲基化状态，但在非癌的泌尿系统疾患组中有3例(2例前列腺肥大病例(84，64岁)，1例膀胱结石病例(54岁))发生了涉及到4个基因6次高甲基化事件：RASSF1A(2/23)，MT1A(2/23)，RUNX3(1/23)和ITGA4(1/23)(图4A)。这些假阳性的结果对判定膀胱癌的标准的影响已通过相应的统计学分析予以考虑(图4A和图.4B)。在膀胱癌者尿沉淀DNA高甲基化率出现频率最高的，并在对照组均为去甲基化状态的4个相关基因为：SALL3(58.3％，CI(置信区间)：95％：49.8％-66.4％)，CFTR(55.3％CI：95％：46.8％-63.5％)，ABCC6(36.4％ CI 95％：28.7％-44.8％)，和HPP1(34.8％CI 95％：27.3％-43.3％)。另外的6个其p为＜0.01基因为：BCL2(27.3％ CI 95％：20.4％-35.4％)，ALX4(25.0％ CI 95％：18.4％-33.0％)，RUNX3(32.6％ CI 95％：25.2％-41.0％)，ITGA4((31.1％，CI 95％：23.8％-39.4％)，RASSF1A(35.6％ CI 95％：28.0％-44.1％)和MYOD1(22.0％ CI 95％：15.8％-29.8％)。其p值＜0.05的基因包括：MT1A(34.8％ CI 95％：27.3％-43.3％)，DRM(18.9％ CI 95％：13.2％-26.5％)，BMP3B(15.9％ CI 95％：10.6％-23.1％)CCNA1(15.9％ CI 95％：10.6％-23.1％)和CDH13(16.7％，CI 95％：11.3-23.9％)。虽其p值大于0.05(p＜0.131)，在膀胱癌病例甲基化率大于12.1％的基因还有：RPRM，MINT1和BRCA1。这些基因可能还有一定的对膀胱癌的诊断价值。与过去的报道不同[44]，TMS1(P＝1)和GSTP1(P＝1)的高甲基化状态仅见之于2例膀胱癌患者中(5.3％，2/132)出现了高甲基化状态。通过以18个基因中任一个处于高甲基化状态为指标来判定膀胱癌，132例受试的膀胱癌患者中121例为阳性(92％)。其中6/8(灵敏度75％)在0a期；60/68(88.2％)在I期；49/50(98.2％)为II期；4/4(100％)为III期；2/2例(100％)为IV期(表5)。与尿细胞学分析的结果(检测出1个I期，2个II期，遗漏了17例，包括4例0a期)相比，本项分析检出20例中的19例，仅遗漏了1例(4例中)0a期，提示这一方法可远较尿细胞学分析为高的敏感性
通过严格的统计学分析，我们未发现基因的DNA甲基化状态与癌分期间有明显的相关性(表5)。与79例手术后尿沉淀DNA基因甲基化谱式比较：MYOD1和MINT1的高甲基化状态分别从术前的22.2％和12.9％降到术后的0％，其他基因甲基化的出现频率也显著减少(p＜0.005)(表6)。尿沉淀中仍有甲基化基因的状态很可能源于手术的不彻底。序贯地对术前和后尿沉淀DNA进行基因甲基化状态分析可作为手术质量有效的评估手段。另外，DNA甲基化的模式与膀胱癌是否初发和复发无明显相关(p＞0.05)(表7)。仅检测单基因甲基化状态最多能检出58.3％的膀胱癌(SALL3)，对多个基因检验将能够提高对膀胱癌的检出率和特异性。10个基因的高甲基化状态有极高的肿瘤特异性(p＜0.01)和另有5个基因的高甲基化状态也有明显的肿瘤特异性(p＜0.05(图4A和图4B)。有3个基因甲基化状态在非癌性泌尿系统疾患对照组中也低频率的出现，会对这类基因作为指标来检出膀胱癌的特异性产生影响。“真阳性”(TP)的定义是膀胱癌的样本至少一个基因甲基化了；而“假阴性”(FN)的定义是膀胱癌的样本所有受试基因均为去甲基化状态。“假阳性”(FP)的定义是非癌性泌尿系统疾患者的样本中至少有一个基因甲基化；“真阴性”(TN)的定义是非癌性泌尿系统疾患者的样本中所有受试基因均为去甲基化状态。“敏感度”＝TP/(TP+FN)(％，图5A，第4列)；“特异性”＝TN/(TN+FP)(％，图5A，第5列)，对每一个基因的检测都可以用这两个公式计算。2至11个基因组合的特异性和敏感度的ROC值(receiver operatingcharacteristic)在图5中示出。
SALL4，CFTR，ABCC6和HPP1在对照组中均无假阳性，从而以单一和组合的方式用于对膀胱癌的检测，其特异性均为100％(图4)：其敏感性分别为：仅SALL3：58.3％(77/132)，SALL3和CFTR一起：74.2％(98/132)，SALL3，CFTR加ABCC6：80.3％(106/132)，SALL3，CFTR，ABCC6和HPR1一起达82.6％(109/132)(图5A第4，5列).
          膀胱癌(123)            非肿瘤对照(23)
甲基化    TP(121)                FP(3)
未甲基化  FN(12)                 TP(20)
第一列是基因组合的列表。方括号中的基因认为是冗余的，因为它的加入没有改变基因组合的敏感性。第二列分别是真阳性(TP，膀胱癌病例有至少一个基因甲基化)和假阴性(FN，膀胱癌病例没有基因甲基化)的事件数。第三列是假阳性(FP，非肿瘤泌尿系统损伤有至少一个基因甲基化)
以及真阴性(TN，非肿瘤泌尿系统损伤没有基因甲基化)的事件数。每套基因组合的敏感度＝TP/(TP+FN)(％，第四列)，特异性＝TN/(TN+FP)(％，第五列)，计算结果见图5A.
在23例非癌性泌尿系统疾患者的样本中有2例为RASSF1A阳性(2个假阳性，21个真阴性，图4A，第3列)。从而加入该基因的5基因组合的敏感性虽可提高到85.6％，特异性降低到91.3％(图5A，第4，5列).由于在另一例个非癌性泌尿系统疾患者样品中MT1A为甲基化(累计假阳性达3个，真阴性20个，图5A，第3列)，加其的6基因组合的敏感性升至86.4％，并伴随者特异性降到87％。。进一步加入并不能提高检测的敏感性，从而RUNX，ITGA4或BCL2基因不作为有价值的标记无。加入ALX4的7基因组合的敏感度为：87.1％，再加入CDH13的8基因组合：88.6％，再加入RPRM的9基因组合：90.2％，再加入MINT的10个基因组合：90.9％，和加入BRCA1的11基因组合：91.7％)。特异性仍为87％。
尽管上述描述属于特例，但对业内人员而言这项发明的思想和范围易掌握的并能在这些已确立的原则上对这些信息及其在实际中的应用形式作出改进。所以，这些改进的可能性必将包括在有关的权益要求之中。
表1癌症检测的分子生物标记
Figure A20071004410600161
注：/：无相关性；靶点/基因：多/单靶点：需要分析一个(单)靶点以上(多)/每个基因。波动性：生物标志物对非肿瘤因素(生物钟、生理、病理因素)变化是否发生量的变化。SNP：单核苷酸多态性，LOH：杂合性缺失.
表2基因启动子CpG岛MSP分析所需引物序列表
Figure A20071004410600162
Figure A20071004410600181
表3受试基因的甲基化状态
Figure A20071004410600182
Figure A20071004410600191
Figure A20071004410600201
注：1纯合子非甲基化 2灰色背景：杂合子甲基化 3黑色背景：纯合子甲基化受试基因数示出，临床样品数见括号中的数字。用源于膀胱炎患者的尿沉淀作为非膀胱癌对照。
下列基因表现为在肿瘤细胞中的纯和甲基化，从而未示出：
表4膀胱癌患者与对照的临床特征
Figure A20071004410600211
表5膀胱癌尿沉淀中DNA甲基化状态与TMN分期
Figure A20071004410600212
表6膀胱癌患者手术前后的尿液中的受试基因的甲基化状态
Figure A20071004410600221
表7初发病和复发病例的受试基因甲基化状态
Figure A20071004410600231
参考文献
1.Jaenisch，R.and A.Bird，Epigenetic regulation of gene expression：how the genome integratesintrinsic and environmental signals.Nat Genet，2003.33 Suppl：p.245-54.
2.Ting，A.H.，K.M.McGarvey，and S.B.Baylin，The cancer epigenome--components and functionalcorrelates.Genes Dev，2006.20(23)：p.3215-31.
3.Hanahan，D.and R.A.Weinberg，The hallmarks of cancer.Cell，2000.100(1)：p.57-70.
4.Bird，A.，The essentials of DNA methylation.Cell，1992.70：p.5-8.
5.Gaudet，F.，et al.，Induction of tumors in mice by genomic hypomethylation.Science，2003.300(5618)：p.489-92.
6.Eden，A.，et al.，Chromosomal instability and tumors promoted by DNA hypomethylation.Science，2003.300(5618)：p.455.
7.Huang，J.，et al.，Recurrence of DLK1 as an imprimted gene could contribute to humanhepatcocellular carcinoma.Carcinogenesis，2006.In press.
8.Belinsky，S.A.，et al.，Aberrant methylation of p16(INK4a)is an early event in lung cancer and apotential biomarker for early diagnosis.Proc Natl Acad Sci U S A，1998.95(20)：p.11891-6.
9.Belinsky，S.A.，Gene-promoter hypermethylation as a biomarker in lung cancer.Nat Rev Cancer，2004.4(9)：p.707-17.
10.Ushijima，T.，T.Nakajima，and T.Maekita，DNA methylation as a marker for the past and future.JGastroenterol，2006.41(5)：p.401-7.
11.Jemal，A.，et al.，Cancer statistics，2006.CA Cancer J Clin，2006.56(2)：p.106-30.
12.Liu，J.，et al.，Cancer Statisitics in Shanghai，China(1972-1999).Tumor，2004.24(1)：p.11-13.
13.Amiel，G.E.and S.P.Lerner，Combining surgery and chemotherapy for invasive bladder cancer：current and future directions.Expert Rev Anticancer Ther，2006.6(2)：p.281-91.
14.Eble，J.，et al.，Pathology and genetics of tumours of the urinary system and male genital organs.World Health Organization classifi cation of tumours，IARC Press，Lyon (France)，2004：p.93-109.
15.Kitamura，H.and T.Tsukamoto，Early bladder cancer：concept，diagnosis，and management.Int JClin Oncol，2006.11(1)：p.28-37.
16.Kriegmair，M.，et al.，Detection of early bladder cancer by 5-aminolevulinic acid induced porphyrinfluorescence.J Urol，1996.155：p.105-9.
17.Schneeweiss，S.，M.Kriegmair，and H.Stepp，Is everything all right if nothing seems wrong？A simplemethod of assessing the diagnostic value of endoscopic procedures when a gold standard is absent.J Urol，1999.161(4)：p.1116-9.
18.Zaak，D.，et al.，Endoscopic detection of transitional cell carcinoma with 5-aminolevulinic acid：results of 1012 fluorescence endoscopies.Urology，2001.57(4)：p.690-4.
19.Wawroschek，F.and P.Rathert，[Urine cytology].Urologe A，1995.34(1)：p.69-75.
20.Lin，J.，et al.，E-cadherin promoter polymorphism (C-160A)and risk of recurrence in patients withsuperficial bladder cancer.Clin Genet，2006.70(3)：p.240-5.
21.Schulz，W.A.，Understanding urothelial carcinoma through cancer pathways.Int J Cancer，2006.119(7)：p.1513-8.
22.Liu，B.C.and J.R.Ehrlich，Proteomics approaches to urologic diseases.Expert Rev Proteomics，2006.3(3)：p.283-96.
23.Pisitkun，T.，R.Johnstone，and M.A.Knepper，Discovery of Urinary Biomarkers.Mol Cell Proteomics，2006.5(10)：p.1760-1771.
24.Feil，G.and A.Stenzl，[Tumor marker tests in bladder cancer].Actas Urol Esp，2006.30(1)：p.38-45.
25.Herman，J.，et al.，Methylationspecific PCR：a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc
Natl Acad Sci USA，1996.93：p.9821-6.
26.Gonzalgo，M.L.and P.A.Jones，Rapid quantitation of methylation differences at specific sites usingmethylation-sensitive single nucleotide primer extension(Ms-SNuPE).Nucleic Acids Res，1997.25(12)：p.2529-31.
27.Kawai，J.，et al.，Comparison of DNA methylation patterns among mouse cell lines by restrictionlandmark genomic scanning.Mol Cell Biol，1994.14(11)：p.7421-7.
28.Huang，T.H.，M.R.Perry，and D.E.Laux，Methylation profiling of CpG islands in human breast cancercells.Hum Mol Genet，1999.8(3)：p.459-70.
29.Fan，J.B.，et al.，BeadArray-based solutions for enabling the promise of pharmacogenomics.Biotechniques，2005.39(4)：p.583-8.
30.Ehrich，M.，et al.，Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base-specificcleavage and mass spectrometry.Proc Natl Acad Sci U S A，2005.102(44)：p.15785-90.
31.Yu，J.，et al.，Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of genes which may contribute tohepatocellular carcinogenesis.BMC Cancer，2002.2：p.29.
32.Yu，J.，et al.，Methylation profiles of thirty four promoter-CpG islands and concordant methylationbehaviours of sixteen genes that may contribute to carcinogenesis of astrocytoma.BMC Cancer，2004.4：p.65.
33.Yu，J.，et al.，Methylation profiling of twenty four genes and the concordant methylation behaviours ofnineteen genes that may contribute to hepatocellular carcinogenesis.Cell Res，2003.13(5)：p.319-33.
34.Ding，S.，et al.，Methylation profile of the promoter CpG islands of 14″drug-resistance″genes inhepatocellular carcinoma.World J Gastroenterol，2004.10(23)：p.3433-40.
35.Li，J.L.，et al.，Correlation between methylation profile of promoter cpg islands of sevenmetastasis-associated genes and their expression states in six cell lines of liver origin.Ai Zheng，2004.23(9)：p.985-91.
36.Xu，X.L.，et al.，Methylation profile of the promoter CpG islands of 31 genes that may contribute tocolorectal carcinogenesis.World J Gastroenterol，2004.10(23)：p.3441-54.
37.Yang，Z.，et al.，The methylation profiles of the promoter CpG island of nine tumor associated genescorrelate with their expression in three lung cancer cell lines.Tumor，2004.11(3)：p.216-222.
38.Zhang，J.，et al.，A novel protein-DNA interaction involved with the CpG dinucleotide at-30 upstreamis linked to the DNA methylation mediated transcription silencing of the MAGE-A1 gene.Cell Res，2004.14(4)：p.283-94.
39.Zhu，J.，The altered DNA methylation pattern and its implications in liver cancer.Cell Res，2005.15(4)：p.272-80.
40.Zhu，J.，DNA methylation and hepatocellular carcinoma.J Hepatobiliary Pancreat Surg，2006.13(4)：p.265-73.
41.Huang，J.，et al.，Recurrence of DLK1 as an imprimted gene could contribute to human hepatcocellularcarcinoma.Carcinogenesis，2007.In press.
42.Zhang，A.P.，et al.，The DNA methylation profile within the 5′-regulatory region of DRD2 in discordant sibpairs with schizophrenia.Schizophr Res，2007.90(1-3)：p.97-103.
43.Zhu，J.and X.Yao，Use of DNA methylation for cancer detection and molecular classification. J BiochemMol Biol，2007.40(2)：p.135-41.
44.Hoque，M.O.，et al.，Quantitation of promoter methylation of multiple genes in urine DNA and bladdercancer detection.J Natl Cancer Inst，2006.98(14)：p.996-1004.
45.Friedrich，M.G.，et al.，Detection of methylated apoptosis-associated genes in urine sediments of bladdercancer patients.Clin Cancer Res，2004.10(22)：p.7457-65.

Claims (8)

1.一种诊断受检对象是否患有膀胱癌的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从受检对象采集尿沉淀样品；
(b)测定样品中一个或多个基因的甲基化谱式，所述基因选自下组：ABCC13，ABCC6，ABCC8，ALX4，APC，BCAR3，BCL2，BMP3B，BNIP3，BRCA1，BRCA2，CBR1，CBR3，CCNA1，CDH1，CDH13，CDKN1C，CFTR，COX2，DAPK1，DRG1，DRM，EDNRB，FADD，GALC，GSTP1，HNF3B，HPP1，HTERT，ICAM1，ITGA4，LAMA3，LITAF，MAGEA1，MDR1，MGMT，MINT1，MINT2，MT1GMT，MINT1，MINT2，MT1A，MTSS1，MYOD1，OCLN，p14ARF，p16INK4a RASSF1A，RPRM，RUNX3，SALL3，SERPINB5，SLC29A1，STAT1，TMS1，TNFRSF10A，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF21和WWOX；
(c)将受检对象与正常研究对象的尿沉淀样品的所述基因的甲基化谱式进行比较，如果有一个或多个基因处于高甲基化状态则说明上述受检对象患有膀胱癌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因选自下组：SALL3，CFTR，ABCC6，HPR1，RASSF1A，MT1A，RUNX3，ITGA4，BCL2，ALX4，MYOD1，DRM，CDH13，BMP3B，CCNA1，RPRM，MINT1，和BRCA1；如果尿沉淀样品中的所述基因中有至少一个基因表现出高度甲基化状态则说明所述受检对象患有膀胱癌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述甲基化谱式是通过甲基化特异性聚合酶链反应法或定量甲基化特异性聚合酶链反应法测定的。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述基因的甲基化谱式是通过甲基化特异性限制性内切酶消化、亚硫酸氢盐DNA测序、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸、限制酶界标基因组扫描、差异性甲基化杂交、BeadArray平台技术和碱基特异性切割/质谱分析来测定的。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在(b)步骤中，测定所述基因的启动子的CpG岛区域的甲基化谱式。
6.用于诊断膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒含有：
(a)用于测定尿沉淀样品中的一或多个基因的甲基化谱式的反应系统，所述基因选自下组：ABCC13，ABCC6，ABCC8，ALX4，APC，BCAR3，BCL2，BMP3B，BNIP3，BRCA1，BRCA2，CBR1，CBR3，CCNA1，CDH1，CDH13，CDKN1C，CFTR，COX2，DAPK1，DRG1，DRM，EDNRB，FADD，GALC，GSTP1，HNF3B，HPP1，HTERT，ICAM1，ITGA4，LAMA3，LITAF，MAGEA1，MDR1，MGMT，MINT1，MINT2，MT1GMT，MINT1，MINT2，MT1A，MTSS1，MYOD1，OCLN，p14ARF，p16INK4a RASSF1A，RPRM，RUNX3，SALL3，SERPINB5，SLC29A1，STAT1，TMS1，TNFRSF10A，TNFRSF10C，TNFRSF10D，TNFRSF21和WWOX；
(b)说明书，该说明书描述了用所述反应系统进行测定并比较待测和正常样品的所述一个或多个基因的甲基化谱式，如果存在一或多个基因处于高度甲基化状态则说明上述受检对象患有膀胱癌。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述基因选自下组：SALL3，CFTR，ABCC6，HPR1，RASSF1A，MT1A，RUNX3，ITGA4，BCL2，ALX4，MYOD1，DRM，CDH13，BMP3B，CCNA1，RPRM，MINT1，和BRCA1。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述用于测定尿沉淀样品中的所述一或多个基因的甲基化谱式的反应系统选自甲基化特异性聚合酶链反应系统或定量甲基化特异性聚合酶链反应系统。
CN200710044106.1A 2007-07-23 2007-07-23 尿沉淀dna甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒 Active CN101353695B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200710044106.1A CN101353695B (zh) 2007-07-23 2007-07-23 尿沉淀dna甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒
US12/670,491 US20100317000A1 (en) 2007-07-23 2008-07-23 Method for diagnosing bladder cancer by analyzing dna methylation profiles in urine sediments and its kit
PCT/CN2008/071725 WO2009012708A1 (fr) 2007-07-23 2008-07-23 Procédé de diagnostic du cancer de la vessie par analyse de profils de méthylation d'adn dans des sédiments urinaires et son kit

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200710044106.1A CN101353695B (zh) 2007-07-23 2007-07-23 尿沉淀dna甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101353695A true CN101353695A (zh) 2009-01-28
CN101353695B CN101353695B (zh) 2013-05-01

Family

ID=40281008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200710044106.1A Active CN101353695B (zh) 2007-07-23 2007-07-23 尿沉淀dna甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20100317000A1 (zh)
CN (1) CN101353695B (zh)
WO (1) WO2009012708A1 (zh)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010127499A1 (zh) * 2009-05-08 2010-11-11 Gui Yaoting 利用人体甲基化信息测定泌尿结石的装置及方法
CN102311953A (zh) * 2011-09-23 2012-01-11 上海市肿瘤研究所 尿液诊断膀胱癌的方法和试剂盒
CN102424840A (zh) * 2011-12-20 2012-04-25 上海市肿瘤研究所 尿液诊断膀胱癌患者复发危险性的方法和试剂盒
CN106947822A (zh) * 2017-04-12 2017-07-14 广州市康立明生物科技有限责任公司 Itga4基因甲基化检测试剂、试剂盒及检测方法
WO2017143866A1 (zh) * 2016-02-26 2017-08-31 福建师范大学 用于定量检测rprm基因dna甲基化试剂盒及方法
CN107119142A (zh) * 2017-06-23 2017-09-01 成都睿杰森生物科技有限公司 一种快速检测传代干细胞恶性转化的试剂盒
CN107592885A (zh) * 2015-02-24 2018-01-16 兹莫研究公司 测定dna甲基化的分析法和癌症的dna甲基化标记
CN107614705A (zh) * 2015-07-06 2018-01-19 纽克莱克斯有限公司 用于诊断膀胱癌的方法
CN107937483A (zh) * 2017-11-20 2018-04-20 徐州医科大学 Stat1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用
CN108165627A (zh) * 2015-08-31 2018-06-15 北京泱深生物信息技术有限公司 一种诊治盆腔脱垂的分子标志物
CN108441561A (zh) * 2018-04-19 2018-08-24 安徽达健医学科技有限公司 一种双重甲基化荧光定量pcr法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒
WO2019105090A1 (zh) * 2017-12-01 2019-06-06 博尔诚（北京）科技有限公司 用于检测食道癌的组合物及其用途
WO2023142630A1 (zh) * 2022-01-27 2023-08-03 北京优乐复生科技有限责任公司 一种用于膀胱尿路上皮癌诊断的检测方法和试剂盒

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2446055A1 (en) * 2009-06-26 2012-05-02 Epigenomics AG Methods and nucleic acids for analysis of bladder cell proliferative disorders
ES2633111T3 (es) 2010-03-26 2017-09-19 Hongzhi Zou Métodos y materiales para detectar neoplasia colorrectal
US20120244141A1 (en) 2010-09-28 2012-09-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Stratification of cancer patients for susceptibility to therapy with PTK2 inhibitors
WO2012116019A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-30 Brown University Compositions and methods for detecting bladder cancer
EP2644705A1 (en) 2012-03-30 2013-10-02 RWTH Aachen Biomarker for bladder cancer
WO2013173912A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 The Hospital For Sick Children Method of diagnosing cancer comprising detection of the methylation signature in the htert promoter
US10597730B2 (en) 2012-05-25 2020-03-24 The Hospital For Sick Children Method of diagnosing cancer
EP3543360B1 (en) 2013-03-14 2021-02-17 Mayo Foundation for Medical Education and Research Detecting neoplasm
CN103805705A (zh) * 2014-02-14 2014-05-21 青岛农业大学 原癌基因hras启动子甲基化模式与膀胱癌的临床相关性研究方法
US10301680B2 (en) 2014-03-31 2019-05-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting colorectal neoplasm
US10184154B2 (en) 2014-09-26 2019-01-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting cholangiocarcinoma
US10030272B2 (en) 2015-02-27 2018-07-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting gastrointestinal neoplasms
EP3274440A4 (en) 2015-03-27 2019-03-06 Exact Sciences Corporation PROOF OF DISEASES OF THE DISHES
KR102688282B1 (ko) 2015-08-31 2024-07-26 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 위 신생물 검출 방법
US10370726B2 (en) 2016-04-14 2019-08-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting colorectal neoplasia
KR102506365B1 (ko) 2016-04-14 2023-03-06 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 췌장 고도 이형성증의 검출방법
AU2018229294B2 (en) 2017-02-28 2024-06-13 Exact Sciences Corporation Detecting prostate cancer
JP7277460B2 (ja) 2017-11-30 2023-05-19 マヨ ファウンデーション フォア メディカル エデュケーション アンド リサーチ 乳癌の検出
EP3880847A2 (en) * 2018-11-16 2021-09-22 Oslo Universitetssykehus HF Methods and compositions for characterizing bladder cancer
CN111582082B (zh) * 2020-04-24 2022-04-01 燕山大学 基于可解释聚类模型的二分类运动想象脑电信号识别方法
CN113981080A (zh) * 2021-10-15 2022-01-28 复旦大学附属肿瘤医院 晚期三阴性乳腺癌铂类治疗敏感性的预测指标生成分析方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070087358A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-19 Melanie Ehrlich Methods for diagnosing cancer based on DNA methylation status in NBL2
US20090203011A1 (en) * 2007-01-19 2009-08-13 Epigenomics Ag Methods and nucleic acids for analyses of cell proliferative disorders
JP5697448B2 (ja) * 2007-09-17 2015-04-08 エムディーエックスヘルス エスエー 膀胱癌の検出のための新規なマーカー

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010127499A1 (zh) * 2009-05-08 2010-11-11 Gui Yaoting 利用人体甲基化信息测定泌尿结石的装置及方法
CN102311953A (zh) * 2011-09-23 2012-01-11 上海市肿瘤研究所 尿液诊断膀胱癌的方法和试剂盒
CN102424840A (zh) * 2011-12-20 2012-04-25 上海市肿瘤研究所 尿液诊断膀胱癌患者复发危险性的方法和试剂盒
US10801060B2 (en) 2015-02-24 2020-10-13 Zymo Research Corporation Assays to determine DNA methylation and DNA methylation markers of cancer
CN107592885A (zh) * 2015-02-24 2018-01-16 兹莫研究公司 测定dna甲基化的分析法和癌症的dna甲基化标记
CN107614705B (zh) * 2015-07-06 2023-06-20 纽克莱克斯有限公司 用于诊断膀胱癌的方法
CN107614705A (zh) * 2015-07-06 2018-01-19 纽克莱克斯有限公司 用于诊断膀胱癌的方法
CN108165627A (zh) * 2015-08-31 2018-06-15 北京泱深生物信息技术有限公司 一种诊治盆腔脱垂的分子标志物
CN108165627B (zh) * 2015-08-31 2020-04-07 北京泱深生物信息技术有限公司 一种诊治盆腔脱垂的分子标志物
WO2017143866A1 (zh) * 2016-02-26 2017-08-31 福建师范大学 用于定量检测rprm基因dna甲基化试剂盒及方法
CN106947822B (zh) * 2017-04-12 2020-04-10 广州市康立明生物科技有限责任公司 Itga4基因甲基化检测试剂、试剂盒及检测方法
CN106947822A (zh) * 2017-04-12 2017-07-14 广州市康立明生物科技有限责任公司 Itga4基因甲基化检测试剂、试剂盒及检测方法
US11718881B2 (en) 2017-04-12 2023-08-08 Creative Biosciences (Guangzhou) Co., Ltd. Detection reagent, detection kit and detection method for ITGA4 gene methylation
CN107119142A (zh) * 2017-06-23 2017-09-01 成都睿杰森生物科技有限公司 一种快速检测传代干细胞恶性转化的试剂盒
CN107937483A (zh) * 2017-11-20 2018-04-20 徐州医科大学 Stat1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用
CN107937483B (zh) * 2017-11-20 2021-07-06 徐州医科大学 Stat1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用
WO2019105090A1 (zh) * 2017-12-01 2019-06-06 博尔诚（北京）科技有限公司 用于检测食道癌的组合物及其用途
CN108441561A (zh) * 2018-04-19 2018-08-24 安徽达健医学科技有限公司 一种双重甲基化荧光定量pcr法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒
WO2023142630A1 (zh) * 2022-01-27 2023-08-03 北京优乐复生科技有限责任公司 一种用于膀胱尿路上皮癌诊断的检测方法和试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009012708A1 (fr) 2009-01-29
US20100317000A1 (en) 2010-12-16
CN101353695B (zh) 2013-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101353695B (zh) 尿沉淀dna甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒
Müller et al. DNA methylation-based diagnostic, prognostic, and predictive biomarkers in colorectal cancer
Kobayashi et al. DNA methylation profiling reveals novel biomarkers and important roles for DNA methyltransferases in prostate cancer
Vanaja et al. Hypermethylation of genes for diagnosis and risk stratification of prostate cancer
US8150626B2 (en) Methods and compositions for diagnosing lung cancer with specific DNA methylation patterns
Costa et al. Quantitative promoter methylation analysis of multiple cancer-related genes in renal cell tumors
Fan et al. Methods for genome-wide DNA methylation analysis in human cancer
AU2009344468B2 (en) A method for screening cancer
US8048634B2 (en) Cancer screening method
US20220307091A1 (en) Unbiased dna methylation markers define an extensive field defect in histologically normal prostate tissues associated with prostate cancer: new biomarkers for men with prostate cancer
Reinert Methylation Markers for Urine‐Based Detection of Bladder Cancer: The Next Generation of Urinary Markers for Diagnosis and Surveillance of Bladder Cancer
WO2007050777A2 (en) Methods and compositions for diagnosing lung cancer with specific dna methylation patterns
Fang et al. Genome-wide analysis of aberrant DNA methylation for identification of potential biomarkers in colorectal cancer patients
US12071672B2 (en) Unbiased DNA methylation markers define an extensive field defect in histologically normal prostate tissues associated with prostate cancer: new biomarkers for men with prostate cancer
Costa et al. Epigenetic markers for molecular detection of prostate cancer
US20120135877A1 (en) DNA Methylation Markers For Prostate Cancer Field Defect
CA2876252A1 (en) Biomarkers for prostate cancer
Zhu et al. Use of DNA methylation for cancer detection and molecular classification
EP2899272A1 (en) Method for obtaining information about colorectal cancer and marker and kit for obtaining information about colorectal cancer
US8609343B2 (en) Detection of bladder cancer
US20090186360A1 (en) Detection of GSTP1 hypermethylation in prostate cancer
EP2978861B1 (en) Unbiased dna methylation markers define an extensive field defect in histologically normal prostate tissues associated with prostate cancer: new biomarkers for men with prostate cancer
Dmitriev et al. Functional hypermethylation of ALDH1L1, PLCL2, and PPP2R3A in colon cancer
Henrique et al. Methylation-based biomarkers for early detection of urological cancer
Zhang et al. Detailed methylation patterns and protein expression profiles of MGMT in colorectal carcinoma surgical margins

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant