CN107937483B - Stat1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用 - Google Patents

Stat1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，提供一种STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，解决现有技术尚未有监测对alisertib耐药的方法的缺陷,包括以下步骤：(1)体外耐药细胞建立与鉴定：构建体外耐药脑胶质瘤细胞与结肠癌细胞，所述脑胶质瘤细胞和结肠癌细胞在特定培养基中培养6个月，再利用MTT法检测耐药脑胶质瘤细胞和结肠癌细胞；(2)体内建立耐药细胞；(3)STAT1信号通路异常激活；(4)启动子甲基化检测。

Description

STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用。
背景技术
化疗是治疗恶性肿瘤最重要的手段之一，然而，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药常常最终导致化疗失败，肿瘤复发。新型口服第二代Aurora-A小分子抑制剂alisertib(MLN8237)具有高靶向性、低毒性、易通过血脑屏障等优点。研究发现其对多种肿瘤具有很好的作用效果。目前，全球共有59项关于alisertib 的临床试验，然而，尚未有监测对alisertib耐药的方法。
发明内容
因此，针对以上内容，本发明提供一种STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，解决现有技术尚未有监测对alisertib耐药的方法的缺陷。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，包括以下步骤：
(1)体外耐药细胞建立与鉴定：构建体外耐药脑胶质瘤细胞与结肠癌细胞，所述脑胶质瘤细胞和结肠癌细胞在特定培养基中培养6个月，再利用MTT法检测耐药脑胶质瘤细胞和结肠癌细胞；
(2)体内建立耐药细胞
将细胞数为1x106个结肠癌细胞接种于6周龄小鼠背部，给予体内耐药细胞 20mg/kg/天，连续14天，停药1周，3个治疗疗程；待实验结束后，分离肿瘤细胞并接种于6周龄小鼠背部，给予体内耐药细胞20mg/kg/天，连续14天，以确定耐药性；
(3)STAT1信号通路异常激活：
利用基因芯片技术、实时定量荧光PCR及常规蛋白免疫印记技术发现STAT1 蛋白表达上调；
(4)启动子甲基化检测：a、设计引物：
Figure RE-GDA0001581582690000021
b、DNA提取：
1、向从荷瘤小鼠分离的肿瘤组织加1ml PBS细胞研磨后，离心弃上清；
2、向离心管中加入500μl裂解液，涡旋10-20秒，充分混匀，室温放置20-30 分钟；
3.加入150μl异丙醇，立即涡旋5-10秒，充分混匀；
4、将上一步溶液加到吸附柱C中，12000rpm离心2分钟；
5.弃废液，向吸附柱中加500μl缓冲液IR，12000rpm离心30秒；
6.向吸附柱中加入600μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；
7.加入400μl漂洗液WB,12,000rpm离心30秒，弃掉废液；
8.将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心60秒，尽量除去漂洗液；
9.小心取出吸附柱，放入一个灭菌的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液TE；
c、MSP处理
1.将13个样本各约2.5ug DNA于1.5ml EP管中使用DDW稀释至50ul；
2.加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3.42℃水浴30min；
4.加30ul10mM对苯二酚至上述水浴后混合液中；
5.加520ul 3.6M亚硫酸氢钠至上述水浴后溶液中；
6.EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；
7.加200ul石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；
8.50℃避光水浴16h；
9.PCR产物回收试剂盒回收上述DNA浓度测定备用；
d、PCR扩增：PCR反应的条件为:95℃热变性10分钟,95℃10秒，52℃ 30秒，72℃，40秒，共重复40次循环；反应体系如下
20μl反应体系:
成份 体积 终浓度
2x HotStart Taq mix 10μl 1X
DNA模板 1.0μl 80ng
STAT1-MF3 0.4μl 0.4μM
STAT1-MR3 0.4μl 0.4μM
加无菌水至 20μl
e、琼脂糖电泳。
进一步的改进是：所述脑胶质瘤细胞为脑胶质瘤U251细胞，所述结肠癌细胞为结肠癌SW480细胞。
进一步的改进是：所述体内耐药细胞为alisertib耐药细胞。
进一步的改进是：所述耐药脑胶质瘤U251细胞的建立方法为：在含有终浓度为1nMalisertib细胞的专用培养基中培养1周后，将存活的脑胶质瘤U251细胞重悬于终浓度为10nM alisertib细胞的专用培养基中继续培养，每2天更换含有终浓度为10nM alisertib细胞的专用培养基；3周后，收集存活的脑胶质瘤U251细胞并将其重悬于终浓度为20nMalisertib细胞的专用培养基继续培养 4周，每周传代；第9周时，收集活细胞并将其重悬于终浓度为25nM alisertib 细胞的专用培养基继续培养16周；利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)(4，二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测耐药细胞株情况。
进一步的改进是：所述结肠癌SW480细胞所需的培养基为DMEM高糖培养基，所述DMEM培养基的配方为：以500ml计，
Figure RE-GDA0001581582690000041
Figure RE-GDA0001581582690000051
进一步的改进是：SW480细胞在含有终浓度为1nM alisertib细胞的DMEM 培养基中培养1周后，将存活的SW480细胞重悬于终浓度为10nM alisertib细胞的DMEM培养基中继续培养，每2天更换含有终浓度为10nM alisertib细胞的DMEM 培养基，3周后，收集活着的SW480细胞并将其重悬于终浓度为20nM alisertib 细胞的DMEM培养基继续培养4周，每周传代；第9周时，收集活细胞并将其重悬于终浓度为25nM alisertib细胞的DMEM培养基继续培养16周；利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)(4，二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴盐比色法检测耐药细胞株情况SW480细胞在含有终浓度为1nM alisertib细胞的DMEM培养基中培养1周后，将存活的SW480细胞重悬于终浓度为10nM alisertib细胞的DMEM培养基中继续培养；每2天更换含有终浓度为10nM alisertib细胞的DMEM培养基；3周后，收集活着的SW480细胞并将其重悬于终浓度为20nM alisertib细胞的DMEM培养基继续培养4周，每周传代；第9周时，收集活细胞并将其重悬于终浓度为25nM alisertib的DMEM培养基继续培养16周；利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)(4，二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴盐比色法检测耐药细胞株情况。
通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是：本发明通过在体外构建耐药脑胶质瘤细胞与结肠癌细胞，以及在体内构建耐药细胞，并通过异常激活 STAT1信号通路以及启动子甲基化检测，所述甲基化检测包括a、设计引物，b、 DNA提取，c、MSP处理，d、PCR扩增，琼脂糖电泳，通过最后的琼脂糖电泳检测到alisertib耐药组中肿瘤(6T，7T和9T)以及alisertib处理若干天的小鼠肿瘤(1T，2T和3T)中，STAT1启动子明显发生去甲基化，采用本发明的 STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，可以监测对alisertib耐药情况，解决现有技术的空白。
说明书附图
图1为alisertib耐药细胞株建成结果示意图；
图2为SW480-alisertib耐药细胞株建成结果示意图；
图3为3个治疗疗程结束后alisertib治疗组中6T、7T和9T实验小鼠对alisertib无反应显示图；
图4为体内SW480-alisertib耐药细胞株建成结果示意图；
图5为利用基因芯片技术比对野生型(control)与耐药株(resistance)中差异基因的表达情况示意图；
图6为Q-PCR技术验证芯片结果示意图；
图7为蛋白免疫印记技术确定结果示意图；
图8为琼脂糖电泳结果示意图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。
实施例为：
STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，包括以下步骤：
(1)体外耐药细胞建立与鉴定：构建体外耐药脑胶质瘤U251细胞与结肠癌 SW480细胞，所述脑胶质瘤细胞和结肠癌细胞在特定培养基中培养6个月，再利用MTT法检测耐药脑胶质瘤细胞和结肠癌细胞；脑胶质瘤U251细胞专用培养基购自Cyagen公司；
外耐药脑胶质瘤U251细胞构建方法如下：
U251细胞在含有终浓度为1nM alisertib的专用培养基中培养1周后，将存活的U251细胞重悬于终浓度为10nM alisertib的专用培养基中继续培养。每 2天更换含有终浓度为10nM alisertib的专用培养基。3周后，收集存活的U251 细胞并将其重悬于终浓度为20nM alisertib的专用培养基继续培养4周，每周传代。第9周时，收集活细胞并将其重悬于终浓度为25nM alisertib的专用培养基继续培养16周。利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)(4，二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测耐药细胞株情况。
结果：U251细胞在高剂量alisertib 30M条件下，超过60％细胞死亡。然而，近70％的U251MR细胞存活，说明alisertib耐药细胞株建成(结果见图1)。
结肠癌SW480细胞所需的DMEM高糖培养基购自凯基生物。向500ml的 DMEM培养基中添加50ml胎牛血清，4℃保存备用。
具体配方如下(500ml)：
Figure RE-GDA0001581582690000071
Figure RE-GDA0001581582690000081
结肠癌SW480耐药细胞构建方法如下：
SW480细胞在含有终浓度为1nM alisertib的DMEM培养基中培养1周后，将存活的SW480细胞重悬于终浓度为10nM alisertib的DMEM培养基中继续培养。每2天更换含有终浓度为10nM alisertib的DMEM培养基。3周后，收集活着的SW480细胞并将其重悬于终浓度为20nM alisertib的DMEM培养基继续培养4 周，每周传代。第9周时，收集活细胞并将其重悬于终浓度为25nM alisertib的 DMEM培养基继续培养16周。利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)(4，二甲基噻唑-2)2， 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测耐药细胞株情况。
结果：SW480细胞经1nM alisertib共培养48小时后，约有50％细胞死亡。然而，在此浓度下，超过80％的SW480MR细胞存活，说明SW480-alisertib耐药细胞株建成(结果见图2)。
(2)体内建立alisertib耐药细胞
将1x106SW480细胞悬浮于100ul含有10％胎牛血清的DMEM培养基，并与等体积的基质胶(购自BD公司)混合，随后接种于6周龄裸鼠背部，给予alisertib 20mg/kg/天，连续14天，停药1周，3个治疗疗程；待实验结束后，分离肿瘤细胞并接种于6周龄裸鼠背部，给予alisertib 20mg/kg/天，连续14天，以确定耐药性。
结果：SW480细胞接种于6周龄裸鼠背部，待肿瘤体积长到50mm3时，按 20mg/kg/天给予alisertib，连续14天，停药1周，3个治疗疗程。在实验期间，由于对照组及个别alisertib治疗组(1T、2T和5T)中，荷瘤小鼠肿瘤体积较大或小鼠体重急速下降等问题时，对其实施安乐死，并分离肿瘤备用。3个治疗疗程结束后发现，alisertib治疗组中6T、7T和9T实验小鼠对alisertib无反应(图3)。随后将7T和9T实验小鼠中的肿瘤细胞分离，制成单细胞悬液，按照上述方法并接种于6周龄裸鼠背部，并连续给予alisertib 20mg/kg/天14天。实验结束时发现：alisertib不能抑制SW480细胞的生长，说明说明体内SW480-alisertib耐药细胞株建成(结果见图4)。
(3)STAT1信号通路异常激活：
利用基因芯片技术(上海吉凯基因协助完成)、实时定量荧光PCR及常规蛋白免疫印记技术确认STAT1蛋白表达上调；
结果：图5、利用基因芯片技术比对野生型(control)与耐药株(resistance) 中差异基因的表达情况。聚类图展示了所有样本和差异基因在表达值层面的聚集情况。红色表示基因的信号值相对上调。绿色表示基因的信号值相对下调，黑色表示基因的信号值适中，灰色表示基因的信号值未检出；图6、Q-PCR技术验证芯片结果，确定STAT1mRNA表达上调；图7、蛋白免疫印记技术确定：与对照小鼠的肿瘤(C1，C2，C3,C4,C5,和C6)相比,alisertib耐药组中肿瘤(6T， 7T和9T)以及alisertib处理若干天的小鼠肿瘤(1T，2T和3T)中，STAT1蛋白及其活性形式(p-STAT1)明显上调。
(4)启动子甲基化检测：
STAT1启动子信息详细信息为：
GCGTTCCCTGGGTTTAGCAACACGGAGGTCAGTTGCTAAAGGGAGCTTCTAGAATGACGACGTCGCCAAATCTGTCCTCT GCCTGGATTCTCGGCGATGAAACTACTACAGAGACCTCCAAGTTTGGGCTTCTGCAAACACAGCACGTCCTTCTGATCGT TCTCTAAGATATGTAAACAGAACGCCAGTTCCCAGCGTGGCAAC；
a、设计引物：
Figure RE-GDA0001581582690000101
b、DNA提取，试剂盒购自江苏溥博生物科技有限公司(组织DNA提取试剂盒Probegene DK041)：
1、向从荷瘤小鼠分离得到的肿瘤组织加1ml PBS细胞研磨后，离心弃上清；
2、向离心管中加入500μl裂解液LB，涡旋10-20秒，充分混匀，室温放置 20-30分钟；
3、加入150μl异丙醇，立即涡旋5-10秒，充分混匀；
4、将上一步溶液加到吸附柱C中，12000rpm离心2分钟；
5、弃废液，向吸附柱中加500μl缓冲液IR，12000rpm离心30秒；
6、向吸附柱中加入600μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；
7、加入400μl漂洗液WB,12,000rpm离心30秒，弃掉废液；
8、将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心60秒，尽量除去漂洗液；
9、小心取出吸附柱，放入一个灭菌的离心管中，在吸附膜的中间部位加50 μl洗脱缓冲液TE；
c、MSP处理
1、将13个样本各约2.5ug DNA于1.5ml EP管中使用DDW稀释至50ul；
2、加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3、42℃水浴30min；
4、加30ul 10mM对苯二酚至上述水浴后混合液中；
5、加520ul 3.6M亚硫酸氢钠至上述水浴后溶液中；
6、EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；
7、加200ul石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；
8、50℃避光水浴16h；
9、PCR产物回收试剂盒回收上述DNA浓度测定备用；
d、PCR扩增：PCR反应的条件为:95℃热变性10分钟,95℃10秒，52℃30秒，72℃，40秒，40循环；反应体系如下
20μl反应体系:
成份 体积 终浓度
2x HotStart Taq mix 10μl 1X
DNA模板 1.0μl 80ng
STAT1-MF3 0.4μl 0.4μM
STAT1-MR3 0.4μl 0.4μM
加无菌水至 20μl
e、琼脂糖电泳。
结果：如图8所示、在对照小鼠肿瘤(C1，C2，C3,C4,C5,和C6)中，检测的 STAT1启动子区域是不完全甲基化的；然而，在alisertib耐药组中肿瘤(6T，7T 和9T)以及alisertib处理若干天的小鼠肿瘤(1T，2T和3T)中，STAT1启动子明显发生去甲基化(见M电泳带)。
以上所记载，仅为利用本创作技术内容的实施例，任何熟悉本项技艺者运用本创作所做的修饰、变化，皆属本创作主张的专利范围，而不限于实施例所揭示者。

Claims (5)

1.STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）体外耐药细胞建立与鉴定：构建体外耐药脑胶质瘤U251细胞与结肠癌SW480细胞，所述脑胶质瘤U251细胞和结肠癌SW480细胞在特定培养基中培养6个月，再利用MTT法检测耐药脑胶质瘤细胞和结肠癌细胞；
（2）体内建立耐药细胞
将细胞数为1x106 个结肠癌细胞接种于6周龄小鼠背部，给予体内耐药alisertib细胞20mg/kg/天，连续14天，停药1周，3个治疗疗程；待实验结束后，分离肿瘤细胞并接种于6周龄小鼠背部，给予体内alisertib耐药细胞 20mg/kg/天，连续14天，以确定耐药性；
（3）STAT1信号通路异常激活：
利用基因芯片技术、实时定量荧光PCR及常规蛋白免疫印记技术发现STAT1蛋白表达上调；
（4）启动子甲基化检测：a、设计引物：
引物检测目的片段为204碱基对
引物 引物序列5-3
STAT1-MF3 GCGTTTTTTGGGTTTAGTAATAC
STAT1-MR3 ATTACCACGCTAAAAACTAACGTT
STAT1-UF3 GTGTTTTTTGGGTTTAGTAATATGG
STAT1-UR3 TTACCACACTAAAAACTAACATT；
b、DNA提取：
①向从荷瘤小鼠分离的肿瘤组织加1ml PBS细胞研磨后，离心弃上清；
②向离心管中加入500μl裂解液，涡旋10-20秒，充分混匀，室温放置20-30分钟；
③加入150μl异丙醇，立即涡旋5-10秒，充分混匀；
④将上一步溶液加到吸附柱C中，12000 rpm离心2分钟；
⑤弃废液，向吸附柱中加500μl缓冲液 IR，12000 rpm离心30秒；
⑥向吸附柱中加入600μl漂洗液 WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液；
⑦加入400μl 漂洗液WB, 12,000rpm离心30秒，弃掉废液；
⑧将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心60秒，尽量除去漂洗液；
⑨小心取出吸附柱 ，放入一个灭菌的离心管中，在吸附膜的中间部位加 50μl 洗脱缓冲液TE；
c、MSP处理
①将13个样本各约2.5 ug DNA于1.5 ml EP管中使用DDW稀释至50 ul；
②加5.5 ul 新鲜配制的3 M NaOH；
③42℃水浴30 min；
④加30ul10 mM 对苯二酚至上述水浴后混合液中；
⑤加520 ul 3.6M亚硫酸氢钠至上述水浴后溶液中；
⑥EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；
⑦加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；
⑧50℃避光水浴16 h；
⑨PCR产物回收试剂盒回收上述DNA浓度测定备用；
d、PCR扩增：PCR 反应的条件为: 95℃热变性10分钟, 95℃ 10秒，52℃ 30秒，72℃，40秒，共重复40次循环；反应体系如下
20μl 反应体系 :
成份体积终浓度
2x HotStart Taq mix 10μl 1X
DNA模板 1.0μl 80ng
STAT1-MF3 0.4μl 0.4μM
STAT1-MR3 0.4μl 0.4μM
加无菌水至 20 μl
e、琼脂糖电泳。
2.根据权利要求1所述的STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，其特征在于：所述体内耐药细胞为alisertib耐药细胞。
3.根据权利要求1所述的STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，其特征在于：所述耐药脑胶质瘤U251细胞的建立方法为：在含有终浓度为1 nM alisertib细胞的专用培养基中培养1周后，将存活的脑胶质瘤U251细胞重悬于终浓度为10 nM alisertib细胞的专用培养基中继续培养，每2天更换含有终浓度为10 nM alisertib细胞的专用培养基；3周后，收集存活的脑胶质瘤U251细胞并将其重悬于终浓度为20 nM alisertib细胞的专用培养基继续培养4周，每周传代；第9周时，收集活细胞并将其重悬于终浓度为25 nMalisertib细胞的专用培养基继续培养16周；利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)(4， 二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）比色法检测耐药细胞株情况。
4.根据权利要求3所述的STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，其特征在于：所述结肠癌SW480细胞所需的培养基为DMEM培养基，所述DMEM培养基的配方为：以500ml计，
化合物名称 含量 (mg/L) 化合物名称 含量 (mg/L)
无水氯化钙 200.00 L-丝氨酸 42.00
硝酸铁 .9H 2 O 0.10 L-苏氨酸 95.00
氯化钾 400.00 L-色氨酸 16.00
无水硫酸镁 97.67 L-酪氨酸钠盐 104.00
氯化钠 6400.00 L-缬氨酸 94.00
无水磷酸二氢钠 125.00 D-泛酸钙 4.00
L-盐酸精氨酸 84.00 氯化胆碱 4.00
L-盐酸胱氨酸 63.00 叶酸 4.00
L-谷氨酰胺 584.00 肌醇 7.20
甘氨酸 30.00 烟酰胺 4.00
L-盐酸组氨酸 42.00 核黄素 0.40
L-异亮氨酸 105.00 盐酸硫胺 4.00
L-亮氨酸 105.00 盐酸吡哆辛 4.00
L-盐酸赖氨酸 146.00 葡萄糖 4500.00
L-甲硫氨酸 30.00 丙酮酸钠 110.00
L-苯丙氨酸 66.00 酚红 15.00。
5.根据权利要求1所述的STAT1启动子甲基化检测在耐药肿瘤细胞中的应用，其特征在于： SW480细胞在含有终浓度为1 nM alisertib细胞的DMEM培养基中培养1周后，将存活的SW480细胞重悬于终浓度为10 nM alisertib细胞的DMEM培养基中继续培养，每2天更换含有终浓度为10 nM alisertib细胞的DMEM培养基，3周后，收集活着的SW480细胞并将其重悬于终浓度为20 nM alisertib细胞的DMEM培养基继续培养4周，每周传代；第9周时，收集活细胞并将其重悬于终浓度为25 nM alisertib细胞的DMEM培养基继续培养16周；利用3-(4，5-二甲基噻唑-2)(4， 二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴盐比色法检测耐药细胞株情况。
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