CN105255869B - ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检测引物与试剂盒 - Google Patents

ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检测引物与试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药领域，尤其涉及ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检测引物与试剂盒。实验证明，根据多态性位点rs3742106基因型能够预测结直肠癌化疗疗效：基因型为AA时，预测结直肠癌患者的化疗效果好，基因型为CC或CA时化疗效果差。故而，本发明提供了ABCC4基因多态性位点rs3742106在制备预测结直肠癌化疗疗效的产品中的应用，且提供了检测ABCC4基因多态性位点rs3742106的引物组和试剂盒，以及检测方法。采用本发明提供的试剂盒和方法能够准确的测定多态性位点rs3742106，并能对结直肠癌化疗效果进行预测，预测结果与预期相符。

Description

ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检测引物与试 剂盒
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其涉及ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检测引物与试剂盒。
背景技术
结直肠癌(CRC)是最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内，CRC在男性和女性中的发病率分别处于恶性肿瘤发病率的第三位和第四位，死亡率分别位居第四位和第五位。近年来，我国CRC发病率呈明显上升趋势，在沿海发达地区及大中城市尤为明显。据统计，我国年均新发CRC病例达13万，约占全身肿瘤的12％～15％，并以年均4％增幅不断攀升。由于其发展迅速、恶性程度高、治疗困难，CRC越来越受到医学界特别是国内医学界的重视，使其成为基础研究和临床研究的重大课题。
由于CRC早期诊断率低，约60％的初发术后或复发转移患者需接受系统化疗。目前临床用于治疗CRC的一线化疗药物有5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、奥沙利铂等。然而，这些药物由于生物利用度个体差异很大，导致其疗效存在明显的个体差异，即使是联合使用其总体有效率也仅为30～40％
药物疗效的个体差异一直是临床常见的现象，也是临床医师关注的问题之一。癌症患者接受化疗时表现出的这种差异尤为明显，不同患者接受相同剂量强度的化疗药物后可能产生不同的反应，从有效到无效，甚至产生严重不良反应。药物发挥生物活性必须先进入靶细胞，而表达在靶细胞上的转运体对药物的转运直接关系到药物能否有效进入靶细胞，达到有效浓度。肠道作为口服药物最重要的吸收器官，分布着大量的药物转运体。这些转运体的诱导或抑制都将严重影响药物的疗效。
业已证实，作为人类最常见的一种基因变异，SNP在药物反应个体差异中起着极其重要的作用，是决定药物敏感性的主要因素之一，其与药物敏感性之间的关系及其功能意义也逐渐被人们所认识。随着研究的不断深入，越来越多的研究发现，位于转运体基因3′非编码区(3′-UTR)内存在的基因多态性(SNP)能够通过影响蛋白表达调控的关键因子microRNA(miRNA)的调控，从而影响转运体蛋白表达水平。
ABCC4定位于人类染色体13q32，有1325个氨基酸组成，属于ABC转运蛋白中的ABCC亚家族。ABCC4基因多态性位点rs3742106是位于ABCC4基因3’-UTR上的SNP位点，目前，尚无研究表明，ABCC4基因的多态性位点rs3742106与化疗药物的疗效相关。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供ABCC4基因多态性位点rs3742106的用途及其检测引物与试剂盒，本发明提供的引物具有良好的特异性，能够实现对ABCC4基因多态性位点rs3742106的准确检测，从而实现对结直肠癌化疗疗效的准确预测。
本发明提供了ABCC4基因多态性位点rs3742106在制备预测结直肠癌化疗疗效的产品中的应用。
在本发明的实施例中，化疗的药物为奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨中的一种或两者以上的组合。
所述的疗效是指结直肠癌患者经化疗后临床症状是否缓解，根据化疗后CT结果及肿瘤标志物联合评价化疗结果。化疗疗效评价根据RECIST疗效标准评价：
完全缓解(complete remission，CR)：所有目标病灶消失，至少维持4周；
部分缓解(partial remission，PR)：基线病灶最大径之和至少减少30％，至少维持4周；
病情稳定(steady disease，SD)：基线病灶最大径之和减少不足30％或增大不足20％；
病情进展(progress disease，PD)：基线病灶最大径之和至少增加20％或出现新病灶。
化疗有效包括CR和PR，化疗无效为SD和PD。
ABCC4基因多态性位点rs3742106存在3种基因型，分别为AA、CC、CA，本发明对277例结直肠癌病人进行调查，当完成4个月的治疗后，其中，137例患者疗效好，140例患者疗效差。对277例结直肠癌患者的ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型分析显示其分布符合Hardy-Weinburg平衡。经回归分析发现，多态性位点rs3742106基因型均与结直肠癌化疗疗效显著相关，根据多态性位点rs3742106基因型能够预测结直肠癌化疗疗效：基因型为AA时，预测结直肠癌患者的化疗效果好，基因型为CC或CA时化疗效果差。
本发明还提供了扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的引物组，包括SEQ ID NO:1～8所示核苷酸序列的引物中任意二条或二条以上的引物。
其中，用于扩增rs3742106多态性位点的引物为SEQ ID No.1～3，其核苷酸序列为：
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'；
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'；
SEQ ID No.3：5'-AGTCCGTTCCGAAGGCAATT-3'；
用于单碱基延伸的引物为SEQ ID No.4，其核苷酸序列为：
SEQ ID No.4：5'-AGTCCGTTCCGAAGGCATTT-3'；
用于扩增等位基因的特异性引物为SEQ ID No.5～8，其核苷酸序列为：
SEQ ID No.5：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGA-3'；
SEQ ID No.6：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGC-3'；
SEQ ID No.7：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATT-3'；
SEQ ID No.8：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATG-3'。
通常，用于检测基因多态性位点的方法有单碱基延伸-MALDI/TOF/MS法、DNA测序法、限制性片段长度多态性分析法、等位基因特异性扩增法、四引物扩增法。这些方法的灵敏性和准确性皆基于引物的特异性，本发明提供的引物能够具有良好的特异性，能够实现对ABCC4基因多态性位点rs3742106的准确检测。其检测样品为全血的基因组DNA。
本发明提供了一种扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，包括：
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物和
SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的单碱基延伸引物。
该试剂盒可通过单碱基延伸-MALDI/TOF/MS法对多态性位点rs3742106进行检测。
该试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶。
该试剂盒中还包括：SAP酶。
该试剂盒中还包括：IPLEX反应液。
本发明提供了一种检测ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的方法，该方法通过单碱基延伸-MALDI/TOF/MS法对ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型进行检测，具体包括以下步骤：
步骤1：以待测样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤2：扩增产物经纯化后，以SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的单碱基延伸引物进行延伸，获得延伸产物；
步骤3：延伸产物经纯化后，以MALDI/TOF/MS测定ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。
本发明提供了一种扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，包括：
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。
该试剂盒可通过DNA测序法对多态性位点rs3742106进行检测。
该试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶。
该试剂盒中还包括：SAP酶。
本发明提供了一种检测ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的方法，该方法基于DNA测序法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型，具体包括以下步骤：
步骤1：以待测样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤2：扩增产物纯化后，经测序获得ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。
本发明提供了一种扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，包括：
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。
该试剂盒可通过限制性片段长度多态性分析法对多态性位点rs3742106进行检测。
该试剂盒中还包括：MfeI酶或MunI酶。
该试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶。
本发明提供了一种检测ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的方法，该方法基于限制性片段长度多态性分析法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型，具体包括以下步骤：
步骤1：以待测样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤2：扩增产物以限制性内切酶消化后，经凝胶电泳分离，根据片段大小获得ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型；
限制性内切酶为MfeI或MunI。
本发明提供了一种扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，包括：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的特异性扩增引物，或
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的特异性扩增引物。
该试剂盒可通过等位基因特异性扩增法对多态性位点rs3742106进行检测。
该试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶。
本发明提供了一种检测ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的方法，该方法基于等位基因特异性扩增法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型，包括以下步骤：
步骤1：以待测样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示核苷酸序列的特异性扩增引物进行扩增，或以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示核苷酸序列的特异性扩增引物进行扩增，获得扩增产物；
步骤2：所述扩增产物经凝胶电泳分离，根据片段大小获得ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。
本发明提供了一种扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，包括：
由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的引物组成的引物组，或
由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的引物组成的引物组。
该试剂盒可通过四引物扩增法对多态性位点rs3742106进行检测。
该试剂盒中还包括：PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶。
本发明提供了一种检测ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的方法，该方法基于四引物扩增法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型，包括以下步骤：
步骤1：以待测样品的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的引物进行扩增，以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:6和SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的引物进行扩增，获得扩增产物；
步骤2：扩增产物经凝胶电泳分离，根据片段大小获得ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。
本发明通过实验证明，根据多态性位点rs3742106基因型能够预测结直肠癌化疗疗效：基因型为AA时，预测结直肠癌患者的化疗效果好，基因型为CC或CA时化疗效果差。故而，本发明提供了ABCC4基因多态性位点rs3742106在制备预测结直肠癌化疗疗效的产品中的应用，且提供了检测ABCC4基因多态性位点rs3742106的引物组和试剂盒，以及检测方法。实验表明，采用本发明提供的试剂盒和方法能够准确的测定多态性位点rs3742106，并能对结直肠癌以奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨或它们联用的化疗效果进行预测，预测结果与预期相符。
具体实施方式
本发明提供了涉及rs3742106多态性位点的用途及其试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器或试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
基于单碱基延伸-MALDI/TOF/MS法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的预测结直肠癌患者化疗疗效的试剂盒和方法。
一、试剂盒的组成成分：
1、检测ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的引物；
扩增多态性位点的引物：
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'
单碱基延伸多态性位点的引物：
SEQ ID No.4：5'-AGTCCGTTCCGAAGGCATTT-3'
2、PCR扩增酶及相应缓冲液；
3、dNTP；
4、PCR产物纯化酶；
5、单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；
6、单碱基延伸产物纯化酶。
二、基因型检测及疗效预测：
1、采集标本：
从患者外周静脉抽取全血1ml，放置于0.5M EDTA抗凝管中。
2、提取基因组DNA：
使用基因组DNA抽提试剂盒，按照说明书步骤提取DNA。
3、基因型检测：
(1)取1μl DNA样本，采用1％琼脂糖凝胶电泳对样本进行质量检查。
(2)取1μl检查合格的DNA样本，采用NanoDrop2000测定其浓度。
(3)根据DNA样本浓度，将其稀释至100～500ng/μl的工作浓度。
(4)PCR扩增反应：
扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的引物：
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'
PCR反应体系：
反应体系包含1μl DNA样本、1×PCR缓冲液、2.5mM MgCl2、引物SEQ ID No.1和SEQID No.2各0.4μM、0.2mM dNTPs和1U Taq DNA聚合酶。
PCR循环程序：
94℃预变性5min；然后以94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min使反应完全；16℃保存。
(5)延伸产物纯化：
加0.5U SAP酶至2μl PCR延伸产物中，37℃温浴40min；85℃ 5min使酶灭活。
(6)单碱基延伸反应:
单碱基延伸多态性位点的引物：
SEQ ID No.4：5'-AGTCCGTTCCGAAGGCATTT-3'
延伸反应条件：
10μl延伸反应体系中包括2μl纯化后的PCR产物、0.5μl IPLEX反应液、1μl延伸引物和超纯水6.5μl。
延伸反应程序：
94℃预变性30s；然后以94℃变性5s，52℃退火5s，80℃延伸5s，循环40次；最后72℃延伸3min；12℃保存。
(7)延伸产物纯化
加1U SAP酶至10μl PCR延伸产物中，37℃温浴60min；75℃ 15min使酶灭活。
(8)MALDI/TOF/MS仪测定延伸产物的质谱图
(9)基因型判断
根据质谱图判断ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。
实施例2：
基于DNA测序法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的试剂盒和方法。
一、试剂盒的组成成分：
1、扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的引物：
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'
2、PCR扩增酶及相应缓冲液；
3、dNTP；
4、PCR产物纯化酶。
二、基因型检测
1、采集标本
从患者外周静脉抽取全血1ml，放置于0.5M EDTA抗凝管中。
2、提取基因组DNA
使用基因组DNA抽提试剂盒，按照说明书步骤提取DNA。
3、基因型检测
(1)取1μl DNA样本，采用1％琼脂糖凝胶电泳对样本进行质量检查。
(2)取1μl检查合格的DNA样本，采用NanoDrop2000测定其浓度。
(3)根据DNA样本浓度，将其稀释至100～500ng/μl的工作浓度。
(4)PCR扩增反应
扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的引物：
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'
PCR反应体系：
反应体系包含1μl DNA样本、1×PCR缓冲液、2.5mM MgCl2、引物SEQ ID No.1和SEQID No.2各0.4μM、0.2mM dNTPs和1U Taq DNA聚合酶。
PCR循环程序：
94℃预变性5min；然后以94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min使反应完全；16℃保存。
(5)延伸产物纯化
加0.5U SAP酶至2μl PCR延伸产物中，37℃温浴40min；85℃ 5min使酶灭活。
(6)ABI3730XL测序仪测定延伸产物的序列
(7)基因型判断
根据测序图谱判断ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。
实施例3：
基于限制性片段长度多态性分析法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的试剂盒和方法。
一、试剂盒的组成成分：
1、扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的引物：
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'
SEQ ID No.3：5'-AGTCCGTTCCGAAGGCAATT-3'
2、PCR扩增酶及相应缓冲液；
3、dNTP；
4、限制性内切酶及其反应缓冲液。
二、基因型检测
1、采集标本
从患者外周静脉抽取全血1ml，放置于0.5M EDTA抗凝管中。
2、提取基因组DNA
使用基因组DNA抽提试剂盒，按照说明书步骤提取DNA。
3、基因型检测
(1)取1μl DNA样本，采用1％琼脂糖凝胶电泳对样本进行质量检查。
(2)取1μl检查合格的DNA样本，采用NanoDrop2000测定其浓度。
(3)根据DNA样本浓度，将其稀释至100～500ng/μl的工作浓度。
(4)PCR扩增反应
扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的引物：
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'
SEQ ID No.3：5'-AGTCCGTTCCGAAGGCAATT-3'
PCR反应体系：
反应体系包含1μl DNA样本、1×PCR缓冲液、2.5mM MgCl2、引物SEQ ID No.2和SEQID No.3各0.4μM、0.2mM dNTPs和1U Taq DNA聚合酶。
PCR循环程序：
94℃预变性5min；然后以94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min使反应完全；16℃保存。
(5)限制性内切酶消化
加10U MunI酶至10μl PCR延伸产物中，37℃温浴5min；85℃ 2min使酶灭活。
(6)凝胶电泳检测
采用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离检测限制性内切酶酶切产物。
(7)基因型判断
根据电泳图判断ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。
实施例4：
基于等位基因特异性扩增法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的试剂盒和方法。
一、试剂盒的组成成分：
1、扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的引物：
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'、
SEQ ID No.5：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGA-3'和
SEQ ID No.6：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGC-3'；
或
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'、
SEQ ID No.7：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATT-3'和
SEQ ID No.8：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATG-3'
2、PCR扩增酶及相应缓冲液；
3、dNTP。
二、基因型检测
1、采集标本
从患者外周静脉抽取全血1ml，放置于0.5M EDTA抗凝管中。
2、提取基因组DNA
使用基因组DNA抽提试剂盒，按照说明书步骤提取DNA。
3、基因型检测
(1)取1μl DNA样本，采用1％琼脂糖凝胶电泳对样本进行质量检查。
(2)取1μl检查合格的DNA样本，采用NanoDrop2000测定其浓度。
(3)根据DNA样本浓度，将其稀释至100～500ng/μl的工作浓度。
(4)等位基因特异性扩增反应
扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的引物：
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'、
SEQ ID No.5：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGA-3'和
SEQ ID No.6：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGC-3'；
或
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'、
SEQ ID No.7：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATT-3'和
SEQ ID No.8：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATG-3'；
PCR反应体系：
反应体系包含1μl DNA样本、1×PCR缓冲液、2.5mM MgCl2、引物SEQ ID No.1/SEQID No.5和SEQ ID No.1/SEQ ID No.6，或者，SEQ ID No.2/SEQ ID No.7和SEQ ID No.2/SEQ ID No.8各0.4μM、0.2mM dNTPs和1U Taq DNA聚合酶。
PCR循环程序：
94℃预变性5min；然后以94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min使反应完全；16℃保存。
(5)凝胶电泳检测
采用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离检测等位基因特异性扩增产物。
(6)基因型判断
根据电泳图判断ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。
实施例5：
基于四引物扩增法测定ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的试剂盒和方法。
一、试剂盒的组成成分：
1、扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的引物：
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'、
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'、
SEQ ID No.5：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGA-3'和
SEQ ID No.6：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGC-3'；
或
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'、
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'、
SEQ ID No.7：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATT-3'和
SEQ ID No.8：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATG-3'；
2、PCR扩增酶及相应缓冲液；
3、dNTP。
二、基因型检测
1、采集标本
从患者外周静脉抽取全血1ml，放置于0.5M EDTA抗凝管中。
2、提取基因组DNA
使用基因组DNA抽提试剂盒，按照说明书步骤提取DNA。
3、基因型检测
(1)取1μl DNA样本，采用1％琼脂糖凝胶电泳对样本进行质量检查。
(2)取1μl检查合格的DNA样本，采用NanoDrop2000测定其浓度。
(3)根据DNA样本浓度，将其稀释至100～500ng/μl的工作浓度。
(4)等位基因特异性扩增反应
扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型的引物：
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'、
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'、
SEQ ID No.5：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGA-3'和
SEQ ID No.6：5'-CATAGTCCAAAAACTAGTCGC-3'；
或
SEQ ID No.1：5'-CAAGATGGTGCAACAACTGG-3'、
SEQ ID No.2：5'-GTTAGAGCTGGAGATCCTTG-3'、
SEQ ID No.7：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATT-3'和
SEQ ID No.8：5'-GTCCGTTCCGAAGGCATATG-3'；
PCR反应体系：
反应体系包含1μl DNA样本、1×PCR缓冲液、2.5mM MgCl2、引物组SEQ ID No.1/SEQ ID No.2/SEQ ID No.5/SEQ ID No.8，或者，SEQ ID No.1/SEQ ID No.2/SEQ ID No.6/SEQ ID No.7各0.4μM、0.2mM dNTPs和1U Taq DNA聚合酶。
PCR循环程序：
94℃预变性5min；然后以94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸7min使反应完全；16℃保存。
(5)凝胶电泳检测
采用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离检测扩增产物。
(6)基因型判断
根据电泳图判断ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。
实施例6
采用实施例1～5提供的方法，对138例结直肠癌病人的血液样品进行检测，获得病人ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。并对这些患者进行为期4个月的化疗，化疗药物分别为卡培他滨。根据多态性位点rs3742106基因型能够预测结直肠癌化疗疗效：基因型为AA的人数为35人，预测结直肠癌患者的化疗效果好；基因型为CC的人数为40人，基因型为CA的人数为63人，预测化疗效果差，结果见表1。
表1：非条件Logistic回归模型分析rs3742106基因型与结直肠癌患者化疗疗效的相关性
Figure BDA0000833185050000151
结果显示，采用实施例1～5提供的方法对患者基因型的检测结果完全一致，根据化疗后CT结果及肿瘤标志物联合评价化疗结果。化疗疗效评价根据RECIST疗效标准评价：完全缓解(complete remission，CR)：所有目标病灶消失，至少维持4周；部分缓解(partialremission，PR)：基线病灶最大径之和至少减少30％，至少维持4周；病情稳定(steadydisease，SD)：基线病灶最大径之和减少不足30％或增大不足20％；病情进展(progressdisease，PD)：基线病灶最大径之和至少增加20％或出现新病灶。化疗有效包括CR和PR，化疗无效为SD和PD。
有效率＝该基因型化疗有效人数/该基因型总人数×100％
结果显示，ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型分析显示其分布符合Hardy-Weinburg平衡，经回归分析发现，多态性位点rs3742106基因型均与结直肠癌化疗疗效显著相关，基因型为CC或CA的患者疗效有效率较低，二基因型为AA的患者疗效有效率较高。该预期疗效与实际结果相符。
实施例7
采用实施例1～5提供的方法，对111例结直肠癌病人的血液样品进行检测，获得病人ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。并对这些患者进行为期4个月的化疗，化疗药物分别为5-氟尿嘧啶。根据多态性位点rs3742106基因型能够预测结直肠癌化疗疗效：基因型为AA的人数为23人，预测结直肠癌患者的化疗效果好；基因型为CC的人数为32人，基因型为CA的人数为56人，预测化疗效果差，结果见表2。
表2：非条件Logistic回归模型分析rs3742106基因型与结直肠癌患者化疗疗效的相关性
Figure BDA0000833185050000161
结果显示，采用实施例1～5提供的方法对患者基因型的检测结果完全一致，根据化疗后CT结果及肿瘤标志物联合评价化疗结果。化疗疗效评价根据RECIST疗效标准评价：完全缓解(complete remission，CR)：所有目标病灶消失，至少维持4周；部分缓解(partialremission，PR)：基线病灶最大径之和至少减少30％，至少维持4周；病情稳定(steadydisease，SD)：基线病灶最大径之和减少不足30％或增大不足20％；病情进展(progressdisease，PD)：基线病灶最大径之和至少增加20％或出现新病灶。化疗有效包括CR和PR，化疗无效为SD和PD。
有效率＝该基因型化疗有效人数/该基因型总人数×100％
结果显示，ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型分析显示其分布符合Hardy-Weinburg平衡，经回归分析发现，多态性位点rs3742106基因型均与结直肠癌化疗疗效显著相关，基因型为CC或CA的患者疗效有效率较低，二基因型为AA的患者疗效有效率较高。该预期疗效与实际结果相符。
实施例8
采用实施例1～5提供的方法，对229例结直肠癌病人的血液样品进行检测，获得病人ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。并对这些患者进行为期4个月的化疗，化疗药物分别为奥沙利铂。根据多态性位点rs3742106基因型能够预测结直肠癌化疗疗效：基因型为AA的人数为53人，预测结直肠癌患者的化疗效果好；基因型为CC的人数为67人，基因型为CA的人数为109人，预测化疗效果差，结果见表3。
表3：非条件Logistic回归模型分析rs3742106基因型与结直肠癌患者化疗疗效的相关性
Figure BDA0000833185050000171
结果显示，采用实施例1～5提供的方法对患者基因型的检测结果完全一致，根据化疗后CT结果及肿瘤标志物联合评价化疗结果。化疗疗效评价根据RECIST疗效标准评价：完全缓解(complete remission，CR)：所有目标病灶消失，至少维持4周；部分缓解(partialremission，PR)：基线病灶最大径之和至少减少30％，至少维持4周；病情稳定(steadydisease，SD)：基线病灶最大径之和减少不足30％或增大不足20％；病情进展(progressdisease，PD)：基线病灶最大径之和至少增加20％或出现新病灶。化疗有效包括CR和PR，化疗无效为SD和PD。
有效率＝该基因型化疗有效人数/该基因型总人数×100％
结果显示，ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型分析显示其分布符合Hardy-Weinburg平衡，经回归分析发现，多态性位点rs3742106基因型均与结直肠癌化疗疗效显著相关，基因型为CC或CA的患者疗效有效率较低，二基因型为AA的患者疗效有效率较高。该预期疗效与实际结果相符。
实施例9
采用实施例1～5提供的方法，对127例结直肠癌病人的血液样品进行检测，获得病人ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。并对这些患者进行为期4个月的化疗，化疗药物分别为卡培他滨和奥沙利铂联用。根据多态性位点rs3742106基因型能够预测结直肠癌化疗疗效：基因型为AA的人数为32人，预测结直肠癌患者的化疗效果好；基因型为CC的人数为36人，基因型为CA的人数为47人，预测化疗效果差，结果见表4。
表4：非条件Logistic回归模型分析rs3742106基因型与结直肠癌患者化疗疗效的相关性
Figure BDA0000833185050000181
结果显示，采用实施例1～5提供的方法对患者基因型的检测结果完全一致，根据化疗后CT结果及肿瘤标志物联合评价化疗结果。化疗疗效评价根据RECIST疗效标准评价：完全缓解(complete remission，CR)：所有目标病灶消失，至少维持4周；部分缓解(partialremission，PR)：基线病灶最大径之和至少减少30％，至少维持4周；病情稳定(steadydisease，SD)：基线病灶最大径之和减少不足30％或增大不足20％；病情进展(progressdisease，PD)：基线病灶最大径之和至少增加20％或出现新病灶。化疗有效包括CR和PR，化疗无效为SD和PD。
有效率＝该基因型化疗有效人数/该基因型总人数×100％
结果显示，ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型分析显示其分布符合Hardy-Weinburg平衡，经回归分析发现，多态性位点rs3742106基因型均与结直肠癌化疗疗效显著相关，基因型为CC或CA的患者疗效有效率较低，二基因型为AA的患者疗效有效率较高。该预期疗效与实际结果相符。
实施例10
采用实施例1～5提供的方法，对96例结直肠癌病人的血液样品进行检测，获得病人ABCC4基因多态性位点rs3742106的基因型。并对这些患者进行为期4个月的化疗，化疗药物分别为5-氟尿嘧啶和奥沙利铂联用。根据多态性位点rs3742106基因型能够预测结直肠癌化疗疗效：基因型为AA的人数为16人，预测结直肠癌患者的化疗效果好；基因型为CC的人数为24人，基因型为CA的人数为36人，预测化疗效果差，结果见表5。
表5：非条件Logistic回归模型分析rs3742106基因型与结直肠癌患者化疗疗效的相关性
Figure BDA0000833185050000191
结果显示，采用实施例1～5提供的方法对患者基因型的检测结果完全一致，根据化疗后CT结果及肿瘤标志物联合评价化疗结果。化疗疗效评价根据RECIST疗效标准评价：完全缓解(complete remission，CR)：所有目标病灶消失，至少维持4周；部分缓解(partialremission，PR)：基线病灶最大径之和至少减少30％，至少维持4周；病情稳定(steadydisease，SD)：基线病灶最大径之和减少不足30％或增大不足20％；病情进展(progressdisease，PD)：基线病灶最大径之和至少增加20％或出现新病灶。化疗有效包括CR和PR，化疗无效为SD和PD。
有效率＝该基因型化疗有效人数/该基因型总人数×100％
结果显示，ABCC4基因多态性位点rs3742106基因型分析显示其分布符合Hardy-Weinburg平衡，经回归分析发现，多态性位点rs3742106基因型均与结直肠癌化疗疗效显著相关，基因型为CC或CA的患者疗效有效率较低，二基因型为AA的患者疗效有效率较高。该预期疗效与实际结果相符。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0000833185120000011
Figure IDA0000833185120000021

Claims (7)

1.ABCC4基因多态性位点rs3742106在制备预测结直肠癌化疗疗效的产品中的应用；所述化疗的药物为卡培他滨和/或奥沙利铂；
基因型为AA时，预测结直肠癌患者的化疗效果好，基因型为CC或CA时化疗效果差。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预测结直肠癌化疗疗效的产品为扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的引物组，其包括SEQ ID NO:1～8所示核苷酸序列的引物中任意二条或二条以上的引物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预测结直肠癌化疗疗效的产品为扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，其包括：
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物和
SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的单碱基延伸引物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预测结直肠癌化疗疗效的产品为扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，其包括：
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预测结直肠癌化疗疗效的产品为扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，其包括：
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预测结直肠癌化疗疗效的产品为扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，其包括：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的特异性扩增引物，或
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的特异性扩增引物。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预测结直肠癌化疗疗效的产品为扩增ABCC4基因多态性位点rs3742106的试剂盒，其包括：
由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的引物组成的引物组，或
由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的引物组成的引物组。
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