CN107557460A

CN107557460A - 基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及易感snp的方法

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Publication number: CN107557460A
Application number: CN201710984508.3A
Authority: CN
Inventors: 雷菁; 赵双双; 尚小云; 张轶; 刁波
Original assignee: Wuhan Racing Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Racing Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2018-01-09

Abstract

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及易感SNP的方法。本发明通过对结直肠癌全基因组测序分析以及对GWAS研究中亚洲人群阳性样本分析，筛选与亚洲人群罹患肺癌风险显著相关的、功能独立的25个CRC热点突变位点和22个SNP位点用于评估个体罹患CRC的风险。本发明通过核酸质谱技术对SNP和热点变异位点进行检测，相比于TaqMan‑PCR和二代平台测序，该检测方法具有简便、灵活性强，高通量大、成本低等特点。本发明除可用于CRC的早期评估和大规模筛查，为CRC的患病风险评估、诊断提供重要参考依据，以实现对结直肠癌疾病的早期预警，同时还可以根据检测结果对CRC患者进行个性化治疗。

Description

基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及易感SNP的方法

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及其易感SNP的方法

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，过去十年来，CRC的发病率和死亡率急剧上升，已成为中国显着的公共卫生问题。虽然结直肠癌的治疗在近年有了长足的进步，但总体疗效并没有很大的改善，手术后的5年生存率在50％左右。而结直肠癌的早期患者治疗效果较好，5年生存率可在90％以上。导致CRC发病的因素主要包括环境和遗传。许多环境因素如营养，缺少运动，肥胖，吸烟和饮酒都是CRC的病因。关于遗传因素，全基因组关联研究(GWAS)已确定多个与CRC易感性相关的遗传基因座，尽管研究已经表明环境因素是结直肠癌发生的始发因素，但个体的遗传特征决定了对于CRC的易感性。因此，通过对CRC易感的SNP进行检测，可以提前预知CRC患病的风险，对CRC的早期诊断和有效预防具有重大的指导意义。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。作为预测疾病易感性的潜在标志物。通过全基因组关联研究(GWAS)检查不同个体中常见遗传变体，以确定变体是否与疾病特征相关。该方法已经成为确定多基因疾病(包括癌症)遗传易感因子的主要策略。

近年，通过对中国人群进行的GWAS分析，筛选出22个SNP与CRC易感性有显著相关性，分别为rs7014346、rs10808555、rs7837328、rs1062044、rs12522693、rs4845882、rs6695837、rs12953717、rs3802842、rs11614913、rs2298881、rs961253、rs4939827、rs7229639、rs11196172、rs6983267、rs895819、rs4444235、rs10505477、rs17836917、rs1801133、rs1342387。

癌症是一类与遗传物质突变有关的疾病，虽然在一个典型的肿瘤组织中会有数千个基因突变，但是只有其中一少部分会真正导致疾病的发生，其具体过程通过促进增殖或生存来实现，因此被称为原癌驱动基因，其中与CRC发生相关的原癌驱动基因有RAS-RAF-ERK信号通路的KRAS/NRAS、BRAF基因，PI3K-PTEN-AKT细胞信号通路的PIK3CA、PTEN基因，WNT信号通路的APC、CTNNB1基因以及泛素蛋白酶体系统(UPS)的FBXW7基因。

目前常用的检测SNP的方法主要是采用TaqMan-PCR及其二代平台测序，但是其存在诸如设计的灵活性不够、检测的准确性不高以及检测容量小的问题。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及其易感SNP的方法，此方法筛选出与结直肠癌发生存在相关性的SNP位点以及与CRC发生相关的驱动基因，使用核酸质谱仪检测SNP和癌症基因突变位点，该方法简便，检测位点样本量大、准确率高，并且成本低。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及易感SNP的方法，该方法包括如下步骤：

(1)筛选出用于评估个体罹患结直肠癌风险相关的SNP位点和结直肠癌相关驱动基因突变位点；

(2)设计步骤(1)中结直肠癌易感SNP位点、与结直肠癌相关驱动基因突变位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物；

(3)将步骤(2)中的扩增引物分组，各组中所含的各SNP位点和基因突变位点的上下游引物等摩尔混合，得到相应的扩增引物混合液，每组扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM；

(4)对应于步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分组，得到单碱基延伸引物混合液；

(5)以待测样本DNA为模板，利用步骤(3)中的扩增引物分别进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段；

(6)虾碱式磷酸酶消除步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；

(7)利用各组相对应的单碱基延伸引物对步骤(6)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；

(8)脱盐树脂纯化延伸产物；

(9)MassARRAY平台对结直肠癌风险相关性的SNPs位点和结直肠癌相关驱动基因的热点变异位点进行基因分型检测，通过对不同基因型质量大小的分析，确定是否存在基因变异。

进一步地，所述步骤(1)中可用来评估个体罹患结直肠癌风险相关性的SNP位点在NCBI中的SNP数据库的rs号分别为rs7014346、rs10808555、rs7837328、rs1062044、rs12522693、rs4845882、rs6695837、rs12953717、rs3802842、rs11614913、rs2298881、rs961253、rs4939827、rs7229639、rs11196172、rs6983267、rs895819、rs4444235、rs10505477、rs17836917、rs1801133和rs1342387。

进一步地，所述步骤(1)中用于评估个体罹患结直肠癌风险的蛋白变异位点分别为：KRAS基因的蛋白变异位点为p.G12SRC、p.G12DAV、p.G13SRC、p.G13DV和p.A146T，NRAS基因的蛋白变异位点为p.G12DAV、p.Q61K和p.Q61PL，BRAF基因的蛋白变异位点为p.V600E，PI3K3CA基因的蛋白变异位点为p.E542K、p.E545KQ和p.H1047RL，APC基因的蛋白变异位点为p.R213*、p.R232*、p.R876*、p.R1114*和p.R1450*，CTNNB1基因的蛋白变异位点为p.T41PA和p.S45F，SMAD4基因的蛋白变异位点为p.R361C和p.R361H，FBXW7基因的蛋白变异位点为p.R465C、p.R465H、p.R505SC和p.S582L。

进一步地，所述易感SNP位点的PCR特异性扩增引物序列对和延伸引物分别为：针对rs1062044的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID.3、针对rs6695837的SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6、针对rs12522693的SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9、针对rs17836917的SEQ ID NO.10、SEQID NO.11和SEQ ID NO.12、针对rs4939827的SEQID.NO13、SEQID NO.14和SEQ ID NO.15、针对rs7229639的SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、针对rs12953717的SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21、针对rs10808555的SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、针对rs7014346的SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27、针对rs10505477的SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、针对rs6983267的SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33、针对rs7837328的SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、针对rs4444235的SEQ IDNO.37、SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39、针对rs3802842的SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、针对rs961253的SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45、针对rs11196172的SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID 48、针对Rs11614913的SEQ IDNO.49、SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51、针对rs1342387的SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、针对Rs895819的SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57、针对rs2298881的SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、针对rs1801133的SEQ IDNO.61、SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63、针对rs4845882的SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；

所述结直肠癌驱动基因热点变异位点的特异性扩增引物序列对和延伸引物分别为：针对p.G12SRC的SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.69、针对p.G12DAV的SEQ IDNO.70、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72、针对p.G13SRC的SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.74和SEQID NO.75、针对p.G13DV的SEQ ID NO.76、SEQID NO.77和SEQ ID NO.78、针对p.A146T的SEQID NO.79、SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81、针对p.G12DAV的SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.84、针对p.Q61K的SEQ ID NO.85、SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87、针对p.Q61PRL的SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90、针对p.V600E的SEQ ID NO.91、SEQ IDNO.92和SEQ ID NO.93、针对p.E542K的SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.96、针对p.E545KQ的SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.99、针对p.H1047RL的SEQ IDNO.100、SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102、针对p.R213*的SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.105、针对p.R232*的SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108、针对p.R876*的SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111、针对p.R1114*的SEQ IDNO.112、SEQ ID NO.113和SEQ ID 114、针对p.R1450*的SEQ ID NO.115、SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.117、针对p.T41PA的SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.120、针对p.S45F的SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.123、针对p.R361C的SEQ IDNO.124、SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126、针对p.R361H的SEQ ID NO.127、SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.129、针对p.R465C的SEQ ID NO.130、SEQ ID NO.131和SEQ ID NO.132；针对p.R465H的SEQ ID NO.133、SEQ ID NO.134和SEQ ID NO.135、针对p.R505SC的SEQ IDNO.136、SEQ ID NO.137和SEQ ID NO.138、针对p.S582L的SEQ ID NO.139、SEQ ID NO.140和SEQ ID NO.141。

进一步地，所述步骤(3)中扩增引物分组具体方法为：将步骤(2)中的扩增引物分为8组，第一组P1为包括rs1062044、rs6695837、rs12522693、rs17836917、rs4939827、rs7229639、rs12953717、rs10808555、rs7014346、rs10505477共10个位点的10对扩增引物，第二组P2为包括rs6983267、rs7837328、rs4444235、rs3802842、rs11196172、rs11614913、rs1342387、Rs895819、rs2298881、rs1801133和rs4845882共11个位点的11对扩增引物，第三组P3为rs961253的1对扩增引物，第四组P4为KRAS_p.G12SRC的1个变异位点的1对扩增引物，第五组P5为KRAS_p.G12DAV的1个变异位点的1对扩增引物，第六组P6为包括KRAS_p.G13SRC、NRAS_p.Q61K、NRAS_p.Q61PRL、BRAF_p.V600E、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545KQ、PIK3CA_p.H1047RL、APC_p.R213*和APC_p.R232*的9个位点的9对扩增引物，第七组P7为包括KRAS_p.G13DV、KRAS_p.A146T、NRAS_p.G12DAV、CTNNB1_p.S45F、FBXW7_p.R505SC和FBXW7_p.S582L共6个变异位点的8对扩增引物，第八组E8为包括APC_p.R876*、APC_p.R1114*、APC_p.R1450*、CTNNB1_p.T41PA、SMAD4_p.R361C、SMAD4_p.R361H、FBXW7_p.R465C和FBXW7_p.R465H共8个变异位点的8对扩增引物；按分组将每组中上下游扩增引物等摩尔混合，得到8管扩增引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM。

进一步地，所述步骤(4)中单碱基延伸引物分组具体方法为：将步骤(2)中的单碱基延伸引物分为8组，引物前编号为E1的代表第一组，包括rs1062044、rs6695837、rs12522693、rs17836917、rs4939827、rs7229639、rs12953717、rs10808555、rs7014346、rs10505477共10个位点，引物前编号为E2的代表第二组，包括rs6983267、rs7837328、rs4444235、rs3802842、rs11196172、rs11614913、rs1342387、Rs895819、rs2298881、rs1801133和rs4845882共11个位点，引物前编号为E3的代表第三组，为rs9612531个SNP位点，引物前编号为E4的代表第四组，为KRAS_p.G12SRC的1个变异位点，引物前编号为E5的代表第五组，为KRAS_p.G12DAV的1个变异位点，引物前编号为E6的代表第六组，包括KRAS_p.G13SRC、NRAS_p.Q61K、NRAS_p.Q61PRL、BRAF_p.V600E、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545KQ、PIK3CA_p.H1047RL、APC_p.R213*和APC_p.R232*的9个变异位点，引物前编号为E7的代表第七组，包括KRAS_p.G13DV、KRAS_p.A146T、NRAS_p.G12DAV、CTNNB1_p.S45F、FBXW7_p.R505SC和FBXW7_p.S582L共6个变异位点，引物前编号为E8的代表第八组，包括APC_p.R876*、APC_p.R1114*、APC_p.R1450*、CTNNB1_p.T41PA、SMAD4_p.R361C、SMAD4_p.R361H、FBXW7_p.R465C和FBXW7_p.R465H共8个变异位点；按分组，将每组中延伸引物等摩尔混合，得到8管延伸引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM。

进一步地，所述步骤(5)的PCR扩增条件为：95℃3min，(95℃15s，60℃15s，72℃30s)45个循环，72℃保持5min。

进一步地，所述步骤(8)的反应条件为94℃30s，[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个循环]40个循环，72℃3min。

本发明的有益效果：

本发明通过核酸质谱技术对SNP和热点变异位点进行检测，相比为TaqMan-PCR和二代平台测序，该检测方法具有简便、灵活性强，高通量大、成本低等特点。本发明除可用于结直肠癌的早期评估和大规模筛查，为结直肠癌的患病风险评估、诊断提供重要的参考依据，以实现对结直肠癌疾病的早期预警，同时还可以根据检测结果对结直肠癌患者进行个性化治疗。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。

实施例1：结直肠癌易感相关基因的SNPs以及直肠癌驱动基因热点变异位点筛选的可行性分析

本发明的发明人通过对结直肠癌全基因组测序分析，搜索NCBI国内外全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)研究文献和相关专利(专利文献1-3，非专利文献1-9)，同时检索GWAS Catalog数据库和COSMIC、SNPedia、UCSC、ICGC和MY CANCERGENOME等癌症相关数据库，筛选出GWAS研究中亚洲人群阳性样本超过1000例和中国人群阳性样本超过500例，在大规模病理对照组临床研究中得到验证的与CRC发生显著相关的位点，本发明人对其做出筛选和评估，选择了与亚洲人群罹患肺癌风险显著相关的25个CRC热点突变和22个单核苷酸多态性位点，并且功能彼此独立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性，可用于评估个体罹患CRC的风险。

筛选出22个与CRC易感性有显著相关性的SNP，分别为rs7014346、rs10808555、rs7837328、rs1062044、rs12522693、rs4845882、rs6695837、rs12953717、rs3802842、rs11614913、rs2298881、rs961253、rs4939827、rs7229639、rs11196172、rs6983267、rs895819、rs4444235、rs10505477、rs17836917、rs1801133和rs1342387。

其中rs1062044位于1q25.3染色体的LAMC1基因区域，rs6695837位于1q25.3染色体的LAMC1基因下游区域，rs12522693位于5q23.3染色体的LOC107986449区域，rs17836917位于17q12染色体的ASIC2和CCL2基因间，rs11196172位于10q25.2染色体的TCF7L2基因区域，rs1801133、rs4845882位于1q36.22染色体的MTHFR基因区域，rs11614913位于12q13.13染色体的MIR196A2基因区域，rs1342387位于1q32.1染色体的ADIPOR1基因区域，rs895819位于19q13.12染色体的miR-27a基因区域，rs2298881位于19q13.32染色体的ERCC1基因区域，rs4939827、rs7229639、rs12953717位于18q21.1染色体的SMAD7基因区域，rs10808555、rs7014346、rs7837328、rs6983267、rs10505477位于8q24.21染色体的CASC8基因区域，rs4444235、rs3802842、rs961253位于14q22.2染色体的BMP4基因区域。另一方面，所述的SNP位点中，当rs7014346、rs10808555、rs7837328位点为GA基因型，rs1062044、rs12522693、rs4845882位点为AA基因型，rs6695837、rs12953717位点为TT基因型，rs3802842、rs11614913、rs2298881位点为CC基因型，rs961253位点为AC基因型，rs4939827位点为CT基因型，rs7229639位点为GC基因型，rs11196172位点为AG或GG基因型，rs6983267、rs895819位点为GG基因型，rs4444235位点为CC或CT基因型，rs10505477位点为TT或CT基因型，判断个体为结直肠癌易感性个体，当rs17836917、rs1801133位点为AA基因型，rs1342387位点为TT基因型，判断个体为结直肠癌不易感性个体。

筛选出的结直肠癌相关驱动基因的热点变异位点的蛋白变异位点分别为：KRAS基因的p.G12SRC、p.G12DAV、p.G13SRC、p.G13DV和p.A146T，NRAS基因的p.G12DAV、p.Q61K和p.Q61PL，BRAF基因的p.V600E，PI3K3CA基因的p.E542K、p.E545KQ和p.H1047RL，APC基因的p.R213*、p.R232*、p.R876*、p.R1114*和p.R1450*，CTNNB1基因的p.T41PA和p.S45F，SMAD4基因的p.R361C和p.R361H，FBXW7基因的p.R465C、p.R465H、p.R505SC和p.S582L。

专利文献

专利文献1：公开号CN201410452337.6；

专利文献2：公开号CN201510212990.X；

专利文献3：公开号CN201510213332.2；

非专利文献

1.Ke J,Tian J,Li J,et al.Molecular Carcinogenesis,2017.

2.Lou J,Gong J,Ke J,et al.Carcinogenesis,2017,38(2):177.

3.Xiong F,Wu C,Bi X Y,et al.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2010,19(7):1855.

4.Tan C,Hu W,Huang Y,et al.Oncotarget,2016,7(47):77651.

5.Li X,Yang X X,Hu N Y,et al.Molecular Biology Reports,2011,38(8):5093-5097.

6.Li Z Z,Bai L,Wang F,et al.Medical Oncology,2016,33(7):71.

7.Ou Y,Chen P,ZhouZ,et al.Bmc Medical Genetics,2014,15(1):137.

8.Yao K,Hua L,Wei L,et al.Medicine,2015,94(46):e1884.

9.Dan W,Liang S,Zhao Z,et al.Oncotarget,2017,8(13):21327-21335.

实施例2：通过本发明技术检测结直肠癌易感性相关SNP位点及CRC热点变异位点

一、提取外周血样本DNA，得DNA提取液；

1.取200μl外周血样本，放入1.5ml离心管。(如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间，则后续操作按照比例增加试剂量。如果起始量介于300μl-1ml之间，则需要先进行红细胞裂解操作)

2.加入200μl结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，在加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮。

3.加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

4.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。

5.加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。

6.加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。

7.加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。

8.将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。

10.DNA可以存放在2-8℃，若长时间存放，可以放置在-20℃。

二、PCR扩增

以提取的外周血DNA为模板，将表1和表3的扩增引物分为8组，扩增引物为P1-F和P1-R为第1组，扩增引物为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为8组；将每条扩增引物等摩尔混合，得到8管扩增引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM，进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。

PCR扩增反应体系(50μl)为

加ddH₂O至50μl。

PCR反应程序：

表1：易感SNPs位点的特异性扩增引物序列对

表2：结直肠癌驱动基因热点变异位点的特异性扩增引物序列对

表3 易感SNPs位点的延伸引物序列

表4：结直肠癌驱动基因热点变异位点的延伸引物序列

三、PCR产物碱性磷酸酶处理

使用博奥生物的试剂处理所获得的PCR产物，消除反应体系中剩余的dNTP。

虾碱式磷酸酶处理反应体系为7μl(每一个反应)：

SAP Buffer(10*) 0.17μl

SAP Enzyme(1.7U/μl) 0.3μl

扩增产物 5μl

补ddH₂O至7μl

消化反应条件为：

37℃、40min；85℃、5min。

四、单碱基延伸

在虾碱性磷酸酶处理结束后，对目标产物的位点进行单碱基延伸。

单碱基延伸反应体系：

补ddH₂O至9μl

单碱基延伸PCR反应程序：

启动PCR仪进行单碱基延伸反应。

五、树脂纯化

向上一步的产物中加入脱盐树脂，对延伸产物进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。具体步骤为：

加入41μl水，Clean Resin树脂15mg(96孔)或者16μl水，Clean Resin树脂6mg(384孔)，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触；3200g离心5min。

六、芯片点样

启动MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至96孔或384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。

七、质谱分析

将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization-time offligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果。

实施例3：使用实施例2的方法检测结直肠癌细胞株

一、检测对象

选用已知突变位点的T84、HCT116、HT-29、LS174T、SW620、MOLT-46个结直肠癌细胞株(均能从ATCC购买得到)进行检测方法的可行性分析，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)(来源于正常人的口腔黏膜组织提取得到)做为阴性对照，水做为空白对照。

二、实验步骤

本发明技术用于该实施例的具体操作方法如下：

(1)提取结直肠癌细胞株DNA，得DNA提取液；

(2)PCR扩增；以实施例2中的扩增引物混合液为扩增引物，DNA提取液为扩增模板进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。PCR的体系为：2*Phanta Max Buffer1.2.μl、dNTP Mix(10mM each)0.1μl、扩增引物混合液1μl、DNA(10ng/μl)2μl，Phanta MaxSuper-Fidelity DNAPolymerase(1U/μl)0.1μl，水补足至5μl。扩增程序为：95℃3min；95℃15s、56℃15s、72℃1min，45个循环；72℃5min。

(3)PCR产物碱性磷酸化处理；将步骤(2)得到的PCR产物进行虾碱式磷酸酶处理，加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl，水补足至7μl。37℃40min，85℃5min。

(4)单碱基延伸：将步骤(3)中的8管扩增引物分别对应实施例2中的8管延伸引物，P1对应E1，以此类推。将步骤(3)得到的产物进行单碱基延伸，加入extendprimermix 0.94μl、iPLEX Bufferplus(10×)0.2μl、iPLEX terminator终止混合液(10×)0.2μl、iPLEXenzyme热测序酶(33U/μl)0.041μl、水补足至9μl。扩增程序为：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5个循环]，35个循环；72℃3min，进行单碱基延伸反应。

(5)树脂纯化，将步骤(4)获得的产物加入脱盐树脂，进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。加入水41μl，Clean Resin树脂15mg(96孔)或者水16μl，Clean Resin树脂6mg(384孔)，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触，3200g离心5min。

(5)质谱分析：启动MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果，根据质谱峰变异碱基处是否出现峰，判断是否突变。

三、结论

检测6例结直肠癌细胞株的变异位点及SNP位点，验证结果显示与美国标准菌种收藏所(ATCC)细胞株的变异情况一致。表明本发明中使用的驱动基因突变位点均能在各自的细胞系中检测出相应的突变位点，其具体的变异位点及变异蛋白如表5所示。此外，在T84、HCT116、HT-29、LS174T、SW620细胞株中还检查到rs6695837、rs17836917、rs7229639、rs7014346、rs6983267、rs4444235、rs11196172、rs1342387、rs2298881、rs4845882易感基因SNP位点。阴性对照以及空白对照均没有检测到基因变异，表明本发明技术具有可行性。

表5 本发明试剂盒在肺癌细胞株检测的验证结果

实施例4：使用实施例2的方法检测结直肠癌早期诊断相关基因的SNPs和突变位点

一、检测对象

从20例病理已经诊断为结直肠癌患者的外周血中，检测一组结直肠癌早期诊断相关基因的SNPs和突变位点。

二、检测步骤

具体步骤如下所述：

(1)使用百泰克全血基因组DNA快速提取试剂盒获得待检样本gDNA；

(a)取200μl收集的外周血，放入1.5ml离心管。加入200μl结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，在加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。

(b)加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，过程中不可用手剧烈振荡，以免剪切DNA。

(c)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。

(d)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。

(e)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。

(f)加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。

(g)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(h)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。

(i)DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

(2)以提取的外周血DNA为模板，以表1、表2、表3和表4中混合好的特异性扩增引物，进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。PCR的体系为：2*Phanta Max Buffer1.2μl、dNTP Mix(10mM each)0.1μl、扩增引物混合液1μl、外周血DNA(10ng/μl)2μl，PhantaMax Super-Fidelity DNAPolymerase(1U/μl)0.1μl，水补足至5μl。扩增程序为：95℃3min；95℃15s、56℃15s、72℃1min，45个循环；72℃5min。

(3)PCR产物碱性磷酸化处理：将步骤:(2)得到的PCR产物进行虾碱式磷酸酶处理，加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl，水补足至7μl。37℃40min，85℃5min。

(4)单碱基延伸：将步骤(3)中8管扩增引物混合液分别对应8管延伸引物混合液，P1对应E1，以此类推。将步骤(3)得到的产物进行单碱基延伸，加入extendprimermix 0.94μl、iPLEX Bufferplus(10×)0.2μl、iPLEX terminator终止混合液(10×)0.2μl、iPLEXenzyme热测序酶(33U/μl)0.041μl、水补足至9μl。延伸反应程序为：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5个循环]，35个循环；72℃3min。

(5)树脂纯化：将步骤(4)获得的产物加入脱盐树脂，进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。加入水41μl，Clean Resin树脂15mg(96孔)或者水16μl，Clean Resin树脂6mg(384孔)，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触，3200g离心5min。

(6)芯片点样，启动MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果，根据质谱峰变异碱基处是否出现峰，判断突变。

三、结论

结果显示本实施例检测的30例样本中，每个样本都能检测到本发明中6～13个突变位点和10～15个CRC易感基因SNP，说明本发明技术能够有效的检测到结直肠癌患者体内存在的突变。其中SMAD4基因的p.R361CH及FBXW7基因p.R465CH突变可改变CRC患者对某些抗肿瘤药物的敏感性，因此，可以作为治疗CRC药物的新靶点。

序列表

<110> 武汉赛云博生物科技有限公司

<120> 基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及易感SNP的方法

<130> 2017

<160> 141

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg gatggccagt atatccagtc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg cctttggcac aggatgttta 30

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcttagaag gaagagggg 19

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg gctagaacaa aacaaatccg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgttggatg agcttgaaac ccttggcgtc 30

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccgtgtcat tcactatg 18

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgttggatg ccaaggttga ggcccagtat 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgttggatg atctgagggg agccactagc 30

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccactagcag tctcac 16

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgttggatg tagaaagaga aggcttgccc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgttggatg gccttcttaa ttctgcttct 30

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagaatctaa agaaagtaag tgg 23

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgttggatg ctgtctctaa tccaccatgc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgttggatg tctgtgtttc ctgaggagtc 30

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggcctcatc caaaagagga aa 22

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgttggatg agacaccccc tggaaaaagc 30

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgttggatg tcacacacgc agcattcac 29

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccagcccaga aaaactgca 19

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acgttggatg tgcatttcac accaacctcg 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acgttggatg cctgttttag ggatgagctg 30

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgaacttac cgggag 16

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acgttggatg gcaagaaaaa gaaggaggg 29

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acgttggatg ccagtggaac atttgacaac 30

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aacatttgac aactgaagta act 23

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acgttggatg cttgcagctt ctgcctaatg 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgttggatg ccttctagcc tacaacatgg 30

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atgtcttctg gagtgctacc 20

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

acgttggatg gctgccaatt tcttggtatt 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acgttggatg tgtgtcacca cttgtctatc 30

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atcaaacagg aagccttaa 19

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acgttggatg tcatcgtcct ttgagctcag 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

acgttggatg ctccctcccc cacataaaat 30

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttgagctcag cagatgaaag 20

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

acgttggatg gaagaaggga gtagcatgtg 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acgttggatg ccctactctc tgacatacac 30

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ggaacaggaa gcaaaaatta gcaaa 25

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

acgttggatg gatttggaca tgatgcccac 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

acgttggatg cctcaagcaa ttttaagctg 30

<210> 39

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ttaagctgcc tggac 15

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

acgttggatg tatgtacagc ccttgcagac 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

acgttggatg gttccacaca gatgctatcc 30

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tgaggtgaat ttctggga 18

<210> 43

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

acgttggatg cagaaagaca tgagttttca g 31

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

acgttggatg gatgctcagc aacttcaatt 30

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

caacttcaat taatctttct gaat 24

<210> 46

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

acgttggatg caaaaccaaa gaagcaaagg g 31

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

acgttggatg agattatgag ctccccaatg 30

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gaagcaaagg gaaaagaa 18

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

acgttggatg ctgatctgtg gcttaggtag 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

acgttggatg tcgacgaaaa ccgactgatg 30

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gaaatcggca acaagaaact g 21

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

acgttggatg gaaacctgca ggagggtaaa 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

acgttggatg tgcctgtagc tctctgattc 30

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

agctgattca aaaacatcaa cc 22

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

acgttggatg acttagccac tgtgaacacg 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

acgttggatg agcagggctt agctgcttgt 30

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gtagacactg tgaacacgac ttgg 24

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

acgttggatg attctattgg ctccgtcccc 30

<210> 59

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

acgttggatg agagatggac aaggccagg 29

<210> 60

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

cccccgcctt ccgtt 15

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

acgttggatg gtgcatgcct tcacaaagcg 30

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

acgttggatg cacttgaagg agaaggtgtc 30

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

aggcgaaggt gtctgcggga g 21

<210> 64

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

acgttggatg ttaagtaaag atgttctgg 29

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

acgttggatg aactgtggga ggagccattc 30

<210> 66

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

gagccattct gtgtcctc 18

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

acgttggatg taaggcctgc tgaaaatgac 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30

<210> 69

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

ctcttgccta cgcca 15

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

acgttggatg ctgtatcgtc aaggcactct 30

<210> 72

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

ctcttgccta cgcca 15

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

acgttggatg taaggcctgc tgaaaatgac 30

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30

<210> 75

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

ccctccaagg cactcttgcc tacg 24

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

acgttggatg taaggcctgc tgaaaatgac 30

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

ggaatgcact cttgcctacg 20

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

acgttggatg aggctcagga cttagcaaga 30

<210> 80

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

acgttggatg ttcagtgtta cttacctgtc 30

<210> 81

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

cttacctgtc ttgtctttg 19

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

acgttggatg ggtttccaac aggttcttgc 30

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

acgttggatg attgtcagtg cgcttttccc 30

<210> 84

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

gtggtggttg gagcag 16

<210> 85

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

acgttggatg gtgaaacctg tttgttggac 30

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

acgttggatg cctgtcctca tgtattggtc 30

<210> 87

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

ggactggata cagctgga 18

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

acgttggatg gtgaaacctg tttgttggac 30

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

acgttggatg cctgtcctca tgtattggtc 30

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

tcatggcact gtactcttct 20

<210> 91

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

acgttggatg ttcaaactga tgggacccac 30

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30

<210> 93

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

ccactccatc gagatttc 18

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

acgttggatg gcaatttcta cacgagatcc 30

<210> 95

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

ccccacgaga tcctctctct 20

<210> 97

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

acgttggatg gcaatttcta cacgagatcc 30

<210> 98

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30

<210> 99

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

catagaaaat ctttctcctg ct 22

<210> 100

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

acgttggatg aactgagcaa gaggctttgg 30

<210> 101

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

acgttggatg tccatttttg ttgtccagcc 30

<210> 102

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

aggaaacaaa tgaatgatgc ac 22

<210> 103

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

acgttggatg agaacaacta ggtacctgcc 30

<210> 104

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

acgttggatg gctcttcgct gttttatcac 30

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

cctgccagga tatggaaaaa 20

<210> 106

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

acgttggatg agccagaatt cagcaaatcg 30

<210> 107

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

acgttggatg cttctgttgc ttgggactgt 30

<210> 108

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

ggtcgaaaag gacatacttc gtata 25

<210> 109

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

acgttggatg tctaggcaac taccatccag 30

<210> 110

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

acgttggatg catgactttg gcaatctggg 30

<210> 111

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

aaaagccagg aacttcttca aag 23

<210> 112

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

acgttggatg tttctccata caggtcacgg 30

<210> 113

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

acgttggatg tgacacaaag actggcttac 30

<210> 114

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

gccaatggtt cagaaacaaa t 21

<210> 115

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

acgttggatg tccaccacct cctcaaacag 30

<210> 116

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

acgttggatg ttgcttaggt ccactctctc 30

<210> 117

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

agcatcaaac agctcaaacc aag 23

<210> 118

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 118

acgttggatg acactctgtt gcatgggtat 30

<210> 119

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 119

acgttggatg tcataatagc caaacagagg 30

<210> 120

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

accatcaact gataaataga taaac 25

<210> 121

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 121

acgttggatg ctgttgcatg ggtatactac 30

<210> 122

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 122

acgttggatg tcataatagc caaacagagg 30

<210> 123

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 123

ggtatactac attttgttta tctattt 27

<210> 124

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 124

acgttggatg ctgttgatgg atacgtggac 30

<210> 125

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 125

acgttggatg ctgtggacat tggagagttg 30

<210> 126

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

acccttctgg aggagat 17

<210> 127

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 127

acgttggatg ctgttgatgg atacgtggac 30

<210> 128

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 128

acgttggatg ctgtggacat tggagagttg 30

<210> 129

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 129

gttgagagtt gacccaaaca aaag 24

<210> 130

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 130

acgttggatg tagaggaaga agtcccaacc 30

<210> 131

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 131

acgttggatg cacaccttat atgggcatac 30

<210> 132

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 132

tcatgaagat gcatacaac 19

<210> 133

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 133

acgttggatg tagaggaaga agtcccaacc 30

<210> 134

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 134

acgttggatg cacaccttat atgggcatac 30

<210> 135

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 135

ggcatacttc cactgt 16

<210> 136

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 136

acgttggatg atgctccact aacaaccctc 30

<210> 137

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 137

acgttggatg tgagacaggc cagtgtttac 30

<210> 138

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 138

tcatgttgca gcagtc 16

<210> 139

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 139

acgttggatg gaatctgcat tcccagagac 30

<210> 140

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 140

acgttggatg gcattcacac gttaacaggg 30

<210> 141

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 141

taacagggca ccagt 15

Claims

1.一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及易感SNP的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(6)虾碱式磷酸酶消除步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；

(8)脱盐树脂纯化延伸产物；

2.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及其易感SNP的方法，其特征在于，所述步骤(1)中可用来评估个体罹患结直肠癌风险相关性的SNP位点在NCBI中的SNP数据库的rs号分别为rs7014346、rs10808555、rs7837328、rs1062044、rs12522693、rs4845882、rs6695837、rs12953717、rs3802842、rs11614913、rs2298881、rs961253、rs4939827、rs7229639、rs11196172、rs6983267、rs895819、rs4444235、rs10505477、rs17836917、rs1801133和rs1342387。

3.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及其易感SNP的方法，其特征在于，所述步骤(1)中用于评估个体罹患结直肠癌风险的基因突变位点的蛋白变异位点分别为：KRAS基因的蛋白变异位点为p.G12SRC、p.G12DAV、p.G13SRC、p.G13DV和p.A146T，NRAS基因的蛋白变异位点为p.G12DAV、p.Q61K和p.Q61PL，BRAF基因的蛋白变异位点为p.V600E，PI3K3CA基因的蛋白变异位点为p.E542K、p.E545KQ和p.H1047RL，APC基因的蛋白变异位点为p.R213*、p.R232*、p.R876*、p.R1114*和p.R1450*，CTNNB1基因的蛋白变异位点为p.T41PA和p.S45F，SMAD4基因的蛋白变异位点为p.R361C和p.R361H，FBXW7基因的蛋白变异位点为p.R465C、p.R465H、p.R505SC和p.S582L。

4.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及其易感SNP的方法，其特征在于，所述易感SNP位点的PCR特异性扩增引物序列对和延伸引物分别为：针对rs1062044的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID.3、针对rs6695837的SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6、针对rs12522693的SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9、针对rs17836917的SEQ ID NO.10、SEQID NO.11和SEQ ID NO.12、针对rs4939827的SEQID.NO13、SEQID NO.14和SEQ ID NO.15、针对rs7229639的SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、针对rs12953717的SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21、针对rs10808555的SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、针对rs7014346的SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27、针对rs10505477的SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、针对rs6983267的SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33、针对rs7837328的SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、针对rs4444235的SEQ IDNO.37、SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39、针对rs3802842的SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、针对rs961253的SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45、针对rs11196172的SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID 48、针对Rs11614913的SEQ IDNO.49、SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51、针对rs1342387的SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、针对Rs895819的SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57、针对rs2298881的SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、针对rs1801133的SEQ IDNO.61、SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63、针对rs4845882的SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；

5.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及其易感SNP的方法，其特征在于，所述步骤(3)中扩增引物分组具体方法为：将步骤(2)中的扩增引物分为8组，第一组P1为包括rs1062044、rs6695837、rs12522693、rs17836917、rs4939827、rs7229639、rs12953717、rs10808555、rs7014346、rs10505477共10个位点的10对扩增引物，第二组P2为包括rs6983267、rs7837328、rs4444235、rs3802842、rs11196172、rs11614913、rs1342387、Rs895819、rs2298881、rs1801133和rs4845882共11个位点的11对扩增引物，第三组P3为rs961253的1对扩增引物，第四组P4为KRAS_p.G12SRC的1个变异位点的1对扩增引物，第五组P5为KRAS_p.G12DAV的1个变异位点的1对扩增引物，第六组P6为包括KRAS_p.G13SRC、NRAS_p.Q61K、NRAS_p.Q61PRL、BRAF_p.V600E、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545KQ、PIK3CA_p.H1047RL、APC_p.R213*和APC_p.R232*的9个位点的9对扩增引物，第七组P7为包括KRAS_p.G13DV、KRAS_p.A146T、NRAS_p.G12DAV、CTNNB1_p.S45F、FBXW7_p.R505SC和FBXW7_p.S582L共6个变异位点的8对扩增引物，第八组E8为包括APC_p.R876*、APC_p.R1114*、APC_p.R1450*、CTNNB1_p.T41PA、SMAD4_p.R361C、SMAD4_p.R361H、FBXW7_p.R465C和FBXW7_p.R465H共8个变异位点的8对扩增引物；按分组将每组中上下游扩增引物等摩尔混合，得到8管扩增引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM。

6.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及其易感SNP的方法，其特征在于，所述步骤(4)中单碱基延伸引物分组具体方法为：将步骤(2)中的单碱基延伸引物分为8组，引物前编号为E1的代表第一组，包括rs1062044、rs6695837、rs12522693、rs17836917、rs4939827、rs7229639、rs12953717、rs10808555、rs7014346、rs10505477共10个位点，引物前编号为E2的代表第二组，包括rs6983267、rs7837328、rs4444235、rs3802842、rs11196172、rs11614913、rs1342387、Rs895819、rs2298881、rs1801133和rs4845882共11个位点，引物前编号为E3的代表第三组，为rs9612531个SNP位点，引物前编号为E4的代表第四组，为KRAS_p.G12SRC的1个变异位点，引物前编号为E5的代表第五组，为KRAS_p.G12DAV的1个变异位点，引物前编号为E6的代表第六组，包括KRAS_p.G13SRC、NRAS_p.Q61K、NRAS_p.Q61PRL、BRAF_p.V600E、PIK3CA_p.E542K、PIK3CA_p.E545KQ、PIK3CA_p.H1047RL、APC_p.R213*和APC_p.R232*的9个变异位点，引物前编号为E7的代表第七组，包括KRAS_p.G13DV、KRAS_p.A146T、NRAS_p.G12DAV、CTNNB1_p.S45F、FBXW7_p.R505SC和FBXW7_p.S582L共6个变异位点，引物前编号为E8的代表第八组，包括APC_p.R876*、APC_p.R1114*、APC_p.R1450*、CTNNB1_p.T41PA、SMAD4_p.R361C、SMAD4_p.R361H、FBXW7_p.R465C和FBXW7_p.R465H共8个变异位点；按分组，将每组中延伸引物等摩尔混合，得到8管延伸引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM。

7.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及易感SNP的方法，其特征在于，所述步骤(5)的PCR扩增条件为：95℃3min，(95℃15s，60℃15s，72℃30s)45个循环，72℃保持5min。

8.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术检测结直肠癌驱动基因及易感SNP的方法，其特征在于，所述步骤(8)的反应条件为94℃30s，[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个循环]40个循环，72℃3min。