CN111394466B - 一种检测结直肠癌易感性的试剂盒 - Google Patents

一种检测结直肠癌易感性的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测结直肠癌易感性的试剂盒，包括多重PCR扩增试剂：ExTaq premix，PCR引物组；基因型检测试剂：SNaPshot Multiplex Kit，单碱基延伸引物组；通过检测待测者UGT2B7基因上的rs7439366 C>T，LEP基因上的rs2167270 G>A，IL10基因上的rs1800871 T>C，MIR27A基因上的rs895819 T>C，IGF1基因上的rs35767 C>T，MTHFR基因上的rs1801133 C>T、CCND1基因上的rs9344 G>A位点的基因型，识别结直肠癌高危人群。

Description

一种检测结直肠癌易感性的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种检测结直肠癌易感性的试剂盒。
背景技术
结直肠癌是一种严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤。根据世界卫生组织发布的最新版《全球癌症报告》数据显示，2018年全球结直肠癌新发病例数超过180万，约占癌症发病的10.2％[1]。如何有效防治结直肠癌已成为医学界面临的重大基础和临床研究课题之一。流行病学研究表明，吸烟、酗酒、高脂饮食及久坐等外在因素与结直肠癌的发生有关，然而在上述背景下，并不是所有个体都会罹患结直肠癌，说明个体内因——遗传易感性也起着关键作用。
单核苷酸多态性是指在基因组中单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失。它在人类基因组DNA中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，其总数多达300万个。单核苷酸多态性是继可变数目串联重复多态性之后的新一代遗传标记，具有高密度、稳定遗传和易于分型检测的特点，因而在疾病特别是多基因疾病研究领域显示出巨大优势。近期荟萃分析结果表明，多个基因上的单核苷酸多态性位点(UGT2B7基因上的rs7439366C>T[2]，LEP基因上的rs2167270G>A[3]，IL10基因上的rs1800871T>C[4]，MIR27A基因上的rs895819T>C[5]，IGF1基因上的rs35767C>T[6]，MTHFR基因上的rs1801133C>T[7]和CCND1基因上的rs9344G>A[8])与结直肠癌易感性存在显著关联。因此，鉴定待测者上述7个位点的基因型将有助于识别结直肠癌高危人群，对于实施明确的个体化预防及治疗有着重大的现实意义。然而先前针对上述位点的检测，大多以外周血基因组DNA为模版并只对单个基因上的位点进行检测。目前尚无经济、高效、可靠的试剂盒用于无创检测待测者上述7个位点的基因型。
参考文献
1.Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,Siegel RL,Torre LA,Jemal A.Globalcancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortalityworldwide for 36 cancers in 185 countries.CA Cancer J Clin.2018；68(6):394-424.
2.Shen ML,Xiao A,Yin SJ,Wang P,Lin XQ,Yu CB,He GH.Associationsbetween UGT2B7 polymorphisms and cancer susceptibility:A meta-analysis.Gene.2019；706:115-123.
3.Yang J,Zhong Z,Tang W,Chen J.Leptin rs2167270 G>A(G19A)polymorphismmay decrease the risk of cancer:A case-control study and meta-analysisinvolving 19 989 subjects.J Cell Biochem.2019.[Epub ahead of print]
4.Mirjalili SA,Moghimi M,Aghili K,Jafari M,Abolbaghaei SM,NeamatzadehH,Mazaheri M,Zare-Shehneh M.Association of promoter region polymorphisms ofinterleukin-10 gene with susceptibility of colorectal cancer:a systematicreview and meta-analysis.Arq Gastroenterol.2018；55(3):306-313.
5.Alidoust M,Hamzehzadeh L,Rivandi M,Pasdar A.Polymorphisms in non-coding RNAs and risk of colorectal cancer:A systematic review and meta-analysis.Crit Rev Oncol Hematol.2018；132:100-110.
6.Wang W,Wu BQ,Chen GB,Zhou Y,Li ZH,Zhang JL,Ding YL,Zhang P,WangJQ.Meta-analysis of the association of IGFBP3 and IGF1 polymorphisms withsusceptibility to colorectal cancer.Neoplasma.2018；65(6):855-864.
7.Xu L,Qin Z,Wang F,Si S,Li L,Lin P,Han X,Cai X,Yang H,GuY.Methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and colorectalcancer susceptibility:a meta-analysis.Biosci Rep.2017；37(6).pii:BSR20170917.
8.Qiu H,Cheng C,Wang Y,Kang M,Tang W,Chen S,Gu H,Liu C,ChenY.Investigation of cyclin D1 rs9344G>A polymorphism in colorectal cancer:ameta-analysis involving 13,642 subjects.Onco Targets Ther.2016；9:6641-6650.
发明内容
为了无创、高效、经济、准确的检测待测者UGT2B7基因上的rs7439366C>T，LEP基因上的rs2167270G>A，IL10基因上的rs1800871T>C，MIR27A基因上的rs895819T>C，IGF1基因上的rs35767C>T，MTHFR基因上的rs1801133C>T和CCND1基因上的rs9344G>A位点的基因型，识别结直肠癌高危人群。本发明提供了一种检测结直肠癌易感性的试剂盒。该试剂盒能够提取口腔粘膜细胞DNA，基于测序仪同时检测待测者上述7个位点的基因型。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种检测结直肠癌易感性的试剂盒，包括多重PCR扩增试剂：ExTaq premix，PCR引物组；基因型检测试剂：SNaPshot Multiplex Kit，单碱基延伸引物组；通过检测待测者UGT2B7基因上的rs7439366C>T，LEP基因上的rs2167270G>A，IL10基因上的rs1800871T>C，MIR27A基因上的rs895819T>C，IGF1基因上的rs35767C>T，MTHFR基因上的rs1801133C>T、CCND1基因上的rs9344G>A位点的基因型，识别结直肠癌高危人群。
还包括用于采集口腔粘膜细胞的棉签；DNA提取试剂：Chelex-100，蛋白酶K；基因型检测试剂：SAP酶，Exonuclease I酶。
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测UGT2B7基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ IDNO.15。
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测LEP基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.16。
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测IL10基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.17。
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测MIR27A基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ IDNO.18。
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测IGF1基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.19。
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测MTHFR基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ IDNO.20。
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测CCND1基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ IDNO.21。
本发明试剂盒中PCR引物组序列具体如下：
用于特异性扩增含UGT2B7基因上的rs7439366C>T位点序列的引物：
F-GACAATGGGGAAAGCTGACG，
R-AGTCAAACACTCTGAAAGAAGACTATAGAA；
用于特异性扩增含LEP基因上的rs2167270G>A位点序列的引物：
F-TGTGATCGGGCCGCTATAAG，
R-GCCAAGAAAGACCAGCAGAGAAG；
用于特异性扩增含IL10基因上的rs1800871T>C位点序列的引物：
F-GGAGATGGTGTACAGTAGGGTGAGG，
R-GGGGAAGTGGGTAAGAGTAGTCTGC；
用于特异性扩增含MIR27A基因上的rs895819T>C位点序列的引物：
F-GCAGGATGGCAGGCAGACA，
R-GGATTTCCAACCGACCCTGA；
用于特异性扩增含IGF1基因上的rs35767C>T位点序列的引物：
F-CCAGGATAACACAAAGAGCCAGAGTA，
R-GCAAAAGCCCAGAGCAGACATA；
用于特异性扩增含MTHFR基因上的rs1801133C>T位点序列的引物：
F-AAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT，
R-CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATG；
用于特异性扩增含CCND1基因上的rs9344G>A位点序列的引物：
F-CAGTGCAAGGCCTGAACCTGA，
R-ACTAGGTGTCTCCCCCTGTAAGC。
本发明中单碱基延伸引物组序列具体如下：
用于检测UGT2B7基因上的rs7439366C>T位点基因型的单碱基延伸引物：
AATCAACATTTGGTAAGAGTGGAT；
用于检测LEP基因上的rs2167270G>A位点基因型的单碱基延伸引物：
GTAGGAATCGCAGCGCCA；
用于检测IL10基因上的rs1800871T>C位点基因型的单碱基延伸引物：
GAGCAAACTGAGGCACAGAGAT；
用于检测MIR27A基因上的rs895819T>C位点基因型的单碱基延伸引物：
GCTTGTGAGCAGGGTCCAC；
用于检测IGF1基因上的rs35767C>T位点基因型的单碱基延伸引物：
GTCAGTCCCCTGAGAGTCATG；
用于检测MTHFR基因上的rs1801133C>T位点基因型的单碱基延伸引物：
CTGCGTGATGATGAAATCG；
用于检测CCND1基因上的rs9344G>A位点基因型的单碱基延伸引物：
CTGGGACATCACCCTCACTTAC。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测结直肠癌易感性的试剂盒。该试剂盒能够无创、高效、经济、准确的检测待测者rs7439366，rs2167270，rs1800871，rs895819，rs35767，rs1801133和rs9344位点的基因型，有助于识别结直肠癌高危人群，实施明确的个体化预防及治疗。
附图说明
图1：通过GeneMapper 4.0软件解读1个样本rs7439366，rs2167270，rs1800871，rs895819，rs35767，rs1801133和rs9344位点的峰图结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明提供了一种检测结直肠癌易感性的试剂盒，(1).试剂盒包含的PCR扩增引物组，其可在同一PCR反应管内同时特异性扩增含有rs7439366，rs2167270，rs1800871，rs895819，rs35767，rs1801133和rs9344位点的核酸片段，不仅可以提高PCR的产率，还能提高DNA样品的利用率；(2).试剂盒包含的单碱基延迟引物,其通过测序仪可以快速准确地对受检者rs7439366，rs2167270，rs1800871，rs895819，rs35767，rs1801133和rs9344位点进行分型。
基于本发明提供的试剂盒同时检测待测者rs7439366，rs2167270，rs1800871，rs895819，rs35767，rs1801133和rs9344位点的基因型。以对一个受检者检测上述7个位点的基因型为例，具体实施方式如下：
将试剂盒中引物稀释到工作浓度50μM，PCR扩增引物Premix体系100μL中每条引物加入1μL，单碱基延伸引物Premix体系25μL中每条引物加入1μL。
1)DNA提取
剥取棉拭子表层，放入离心管中，加入5％chelex-100液300ul,使其浸没标本，再加入6μL蛋白酶K，混匀，56℃水浴30min，混匀，沸水浴10min，置于冰上10min，14000r/min离心2min，取上清液(即DNA)，使用Nano-100测定浓度并将样本稀释到工作浓度5-10ng/μL。
2)多重PCR反应(20μl)：
4μL PCR扩增引物Premix，10μL ExTaq premix，2μL DNA，4μL H2O
程序：95℃2min+(95℃20s+65°(TD-0.5/C)40s+72℃1min)*12+(95℃20s+59°30s+72℃1min)*24+72℃10min+4℃∞
3)多重PCR产物纯化
在15μL PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37℃温浴1小时，然后75℃灭活15分钟。
4)SNaPshot多重单碱基延伸反应
5μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2μL纯化后的多重PCR产物，1μL单碱基延伸引物Premix，2μL H2O
程序：95℃10s+(95℃10s+50℃5s+60℃30s)*35+60℃30s+4℃∞
5)延伸产物纯化
在10μL延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1小时，然后85℃灭活15分钟。
6)延伸产物上ABI3730XL测序仪
取1μL纯化后的延伸产物，与0.5μL Liz120 SIZE STANDARD，8.5μL Hi-Di混匀，95℃变性5分钟后上ABI3730XL测序仪，收集的原始数据用GeneMapper 4.0软件来分析。
图1为通过GeneMapper 4.0软件解读1个样本rs7439366，rs2167270，rs1800871，rs895819，rs35767，rs1801133和rs9344位点的峰图结果。灰色条形框中的位点rs号代表该位点的出峰位置，实心峰下的字母代表解析出的等位基因，该样本的rs7439366位点基因型为CT，rs2167270位点基因型为GG，rs1800871位点基因型为TT，rs895819位点基因型为TT，rs35767位点基因型为CC，rs1801133位点基因型为TT，rs9344位点基因型为GA。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
序列表
<110> 盐城师范学院
<120> 一种检测结直肠癌易感性的试剂盒
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 1
gacaatgggg aaagctgacg 20
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 2
agtcaaacac tctgaaagaa gactatagaa 30
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 3
tgtgatcggg ccgctataag 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 4
gccaagaaag accagcagag aag 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 5
ggagatggtg tacagtaggg tgagg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 6
ggggaagtgg gtaagagtag tctgc 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 7
gcaggatggc aggcagaca 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 8
ggatttccaa ccgaccctga 20
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 9
ccaggataac acaaagagcc agagta 26
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 10
gcaaaagccc agagcagaca ta 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 11
aagcacttga aggagaaggt gtct 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 12
caaagaaaag ctgcgtgatg atg 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 13
cagtgcaagg cctgaacctg a 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 14
actaggtgtc tccccctgta agc 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 15
aatcaacatt tggtaagagt ggat 24
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 16
gtaggaatcg cagcgcca 18
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 17
gagcaaactg aggcacagag at 22
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 18
gcttgtgagc agggtccac 19
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 19
gtcagtcccc tgagagtcat g 21
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 20
ctgcgtgatg atgaaatcg 19
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 21
ctgggacatc accctcactt ac 22

Claims (2)

1.一种检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：包括多重PCR扩增试剂：ExTaqpremix，PCR引物组；基因型检测试剂：SNaPshot Multiplex Kit，单碱基延伸引物组；通过检测待测者UGT2B7基因上的rs7439366 C>T，LEP基因上的rs2167270 G>A，IL10基因上的rs1800871 T>C，MIR27A基因上的rs895819 T>C，IGF1基因上的rs35767 C>T，MTHFR基因上的rs1801133 C>T、CCND1基因上的rs9344 G>A位点的基因型，识别结直肠癌高危人群；
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测UGT2B7基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.15；
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测LEP基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.16；
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测IL10基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.17；
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测MIR27A基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.18；
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测IGF1基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.19；
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测MTHFR基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.20；
其PCR引物组序列和单碱基延伸引物组序列中，用于检测CCND1基因的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO.21。
2.根据权利要求1所述的检测结直肠癌易感性的试剂盒，其特征在于：还包括用于采集口腔粘膜细胞的棉签；DNA提取试剂：Chelex-100，蛋白酶K；基因型检测试剂：SAP酶，Exonuclease I酶。
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