CN108277280B - 一种检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测试剂盒，具体地，所述试剂盒可用于定量检测hsa‑miRNA‑21，hsa‑miRNA‑27a，hsa‑miRNA‑25a，hsa‑miRNA‑93，hsa‑miRNA‑34a，hsa‑miRNA‑223a，hsa‑miRNA‑181a，hsa‑miRNA‑121，hsa‑miRNA‑97，hsa‑miR‑107、hsa‑miR‑192、hsa‑miR‑196a、hsa‑miR‑197、hsa‑miR‑148a、hsa‑miR‑30c、hsa‑miR‑30d、hsa‑miR‑7、hsa‑miR‑181a、hsa‑miR‑181b、hsa‑miR‑203、hsa‑miR‑210的表达量，miRNA是细胞的基因调控系统中的重要组成，miRNA作为癌症标记物是一种非侵入性取样，可以在无创条件下通过单独的miRNA或miRNA组合物的表达谱来辅助诊断被试者是否罹患癌症，提高诊断的准确率。
Description
技术领域
本发明涉及辅助疾病检测领域，具体地涉及一种检测试剂盒。
背景技术
头颈部肿瘤是指自颅底到锁骨上，颈椎以前这样一个解剖范围的肿瘤，以恶性肿瘤为主。颈部肿瘤在综合性医院属于普通外科，比较常见的就是甲状腺肿瘤；耳鼻喉科肿瘤常见的有喉癌、副鼻窦癌等；口腔颌面部肿瘤常见的为各种口腔癌，如舌癌、牙龈癌、颊癌等。因此，头颈部所发生的肿瘤，其原发部位和病理类型之多，居全身肿瘤之首。
头颈部恶性肿瘤因其发病部位很多，因此其发病率在不同的国家、地区以及人种间都不相同。在美国华人中，男性发病率较高的是鼻咽癌，其次是甲状腺癌、口腔癌；女性发病率较高的是甲状腺癌，其次是鼻咽癌和涎腺肿瘤。在日本，男性发病率较高的是喉癌，其次是口腔癌；女性发病率较高的是甲状腺癌，其次是口腔癌。在我国，北京男性头颈部肿瘤发病率以喉癌占首位，其次为鼻咽癌和口腔癌；女性头颈部肿瘤发病率以甲状腺癌占首位，其次为口腔癌。而上海市统计资料显示，男性头颈部肿瘤发病率首位是鼻咽癌，其次为喉癌。女性头颈部肿瘤发病率首位是甲状腺癌，其次是鼻咽癌，头颈部肿瘤因其解剖复杂，组织病理类型繁多，一般常见鳞状上皮细胞癌，其次为各类腺癌、肉瘤少见。
癌症细胞的早期发现对于癌症的治疗及预防有十分重要的作用，本发明提供一种通过血清检测即可预测癌症的试剂盒，具有取样方便、检测方法简易、检测结果特异性高等特点，适用于日常体检、临床治疗等多种场景。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供提供一种检测试剂盒。
本发明是以如下技术方案实现的：
本发明提供一种检测试剂盒，所述试剂盒可用于定量检测hsa-miRNA-21，hsa-miRNA-27a，hsa-miRNA-25a，hsa-miRNA-93，hsa-miRNA-34a，hsa-miRNA-223a，hsa-miRNA-181a，hsa-miRNA-121，hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210的表达量。
进一步地，所述试剂盒包括试剂盒本体，外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；外源性参照瓶内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂；所述外源性参照可采用U6序列，其工作浓度为5nmol，其作用在于监测从miRNA提取到后续实时荧光定量PCR全过程的反应效率；所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、5×RT 缓冲液、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品，所述miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为100nmol，所述试剂盒包括下述miRNA，所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97，cut-off值50%、hsa-miR-107，cut-off值30%、hsa-miR-192， cut-off值45%、hsa-miR-196a，cut-off值20%、hsa-miR-197，cut-off值65%、hsa-miR-148a ，cut-off值20%、hsa-miR-30c，cut-off值40%、hsa-miR-30d，cut-off值50%，检测过程中上述miRNA达到上述cut-off值时，即可判定阳性；所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和荧光探针，用于牙龈癌预测的miRNA试剂盒的制备工艺和操作流程是基于定量PCR技术的，试剂盒包括常用的Taq酶等，本试剂盒的价值在于能够提供精简的探针库以便检测血清样本中miRNA的变化趋势，探针库包括实施例2中筛选出的miRNA的反向互补序列，所述引物包括：
hsa-miRNA-97-f：ttaagagacccctaactttaa (SEQ ID NO.1)
hsa-miRNA-97-r：gaaagagagcctttggcga (SEQ ID NO.2)
hsa-miR-107-f：tcttttaaaacttgacatcgcg (SEQ ID NO.3)
hsa-miR-107-r：ccgtaacactttaatggyacc (SEQ ID NO.4)
hsa-miR-192-f：aattatggtacaagccctagac (SEQ ID NO.5)
hsa-miR-192-r：ttccatctttctattagctctctcaa (SEQ ID NO.6)
hsa-miR-196a-f：gcctaagctaaaatcggctagc (SEQ ID NO.7)
hsa-miR-196a-r：cccctcgaatcctagatcttta (SEQ ID NO.8)
hsa-miR-197-f：gggaatctctcaaaatttaata (SEQ ID NO.9)
hsa-miR-197-r：cccataaaaataaggttacact (SEQ ID NO.10)
hsa-miR-148a-f：attttccggaatttaagaaaatc (SEQ ID NO.11)
hsa-miR-148a-r：ccctaaattgttttaagtttctataa (SEQ ID NO.12)
hsa-miR-30c-f：aaatttctcgaattttcctatatcc (SEQ ID NO.13)
hsa-miR-30c-r：cctctaaatcctaaagttgggt (SEQ ID NO.14)。
进一步地，所述试剂盒用于检测hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c的表达水平，当hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c均达到cut-off值时，可以认为该样品来源有高罹患牙龈癌风险，需进行进一步排查，所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97，cut-off值50%、hsa-miR-107，cut-off值30%、hsa-miR-192，cut-off值45%、hsa-miR-196a，cut-off值20%、hsa-miR-197，cut-off值65%、hsa-miR-148a，cut-off值20%、hsa-miR-30c，cut-off值40%。
进一步地，所述试剂盒可用于辅助诊断甲状腺癌、口腔癌、喉癌、腭癌、牙龈癌、舌癌、唇癌，诊断样本为血清样本。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种检测试剂盒，miRNA 是细胞的基因调控系统中的重要组成，miRNA作为癌症标记物是一种非侵入性取样，可以在无创条件下通过单独的miRNA或miRNA组合物的表达谱来辅助诊断被试者是否罹患癌症，提高诊断的准确率。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：牙龈癌相关miRNA 的筛选
头颈癌样品来自南京医科大学收集的283个样本，样本类型为血清，血清以新鲜采集分离为好，采血6小时内分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用无RNA酶的无菌微量离心管中。
获得了如下样本：甲状腺癌82例、口腔癌23例、喉癌31例、腭癌25例、牙龈癌59例、舌癌33例、唇癌30例。来自正常样品的RNA由6个样品来源的RNA混合（各来自6个正常的牙龈组织）组成，血清样本于2℃-8℃可稳定保存7天。
使用RNA提取试剂盒（Qiagen miRNeasy Mini Kit 试剂盒）提取样品总RNA，遵守厂商说明进行操作。然后在miRNA微阵列芯片上进行 RNA标记和杂交。具体步骤如下：用5μg生物素标记来自各样品的RNA，该芯片包含323个探针，包含245个人和小鼠miRNA基因。使用Perkin-Elmer Scan Array XL5K 对链霉素-Alexa647缀合物进行基于生物素结合的杂交信号进行检测；用Quantarray软件 (Perkin Elmer) 定量扫描图像，微阵列数据的统计学和生物信息学分析使用软件Silicon Genetics对原始数据进行标准化和分析。
将表达数据以中位数集中，用ANOVA (方差分析) 进行统计比较。使用PAM软件(Prediction Analysis of Microarrays, 获得自http://www.stat.stanford.edu/tibs/PAM/index.html) (Tibshirani, R.,等人Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:6567-6572 (2002))和Support Vector Machine (Furey, T.S.,等人Bioinformatics 16:906-914 (2000)) 软件确定用于预测牙龈癌的miRNA，两种算法都用交叉验证和Test-set检测。
根据微阵列分析获得与癌症进程有一定相关性的miRNA共计 156种，筛选出在牙龈癌中上调表达的miRNA，具体地，如下所述hsa-miRNA-21，hsa-miRNA-27a，hsa-miRNA-25a，hsa-miRNA-93，hsa-miRNA-34a，hsa-miRNA-223a，hsa-miRNA-181a，hsa-miRNA-121，hsa-miRNA-97，hsa-miR-107，hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210。
实施例2：牙龈癌相关miRNA 的验证
1、牙龈癌样品来源如实施例1中所示，取Trizol Reagent (Invitrogen，Carlsbad，CA) 提取各样品血清总RNA ，提取步骤如下：
步骤101、取6-8ml的血清，加入等体积的Trizol Reagent；
步骤102、相分离室温放置12min，然后按0.3ml氯仿/1.5ml Trizol Reagent的体积比加入氯仿，剧烈震荡25s，室温静置10min，于12000g，4℃离心10min；
步骤103、将水相转移到新的50ml离心管，苯酚/氯仿除去蛋白相二次；
步骤104、将水相转移到新的离心管中，按0.6ml异丙醇/1ml Trizol Reagent体积加入异丙醇，-20℃保存50min，于12000g，4℃离心60min；
步骤105、用2ml Trizol重悬沉淀，将悬液转移到新的1.5ml的离心管中；
步骤106、重复2，4步 (第四步离心改为15min)；
步骤107、 RNA洗涤去掉上清，加入75％乙醇，于12000g，4℃离心5min；
步骤108、测量获得的RNA浓度，通常能得到浓度为8μg RNA/100ml血清的血清总RNA。
2、针对上述RNA样品进行Solexa测序，具体步骤如下：
步骤201、总RNA进行PAGE电泳回收16-29nt RNA分子；
步骤202、将adaptor prime酶联在小RNA分子的3’与5’端；
步骤203、进行RT-PCR反应后并进行测序；
步骤204、常规方法进行数据分析与处理。
3、Real-time PCR方法具体操作步骤如下：
步骤301、取血清总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者取血清样本，以血清样本作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
步骤302、用hsa-miRNA-21，hsa-miRNA-27a，hsa-miRNA-25a，hsa-miRNA-93，hsa-miRNA-34a，hsa-miRNA-223a，hsa-miRNA-181a，hsa-miRNA-121，hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210设计引物；
步骤303、加入荧光探针进行PCR反应；
步骤304、检测并比较正常人或牙龈癌患者样本中微小核糖核酸的量的变化，检测结果表明牙龈癌患者的血清中hsa-miRNA-21，hsa-miRNA-27a，hsa-miRNA-25a，hsa-miRNA-93，hsa-miRNA-34a，hsa-miRNA-223a，hsa-miRNA-181a，hsa-miRNA-121，hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210等miRNA均有不同程度的过表达，从中筛选出7中显著过表达的miRNA作为生物标志物进行癌症预测。
实施例3：用于辅助诊断牙龈癌的试剂盒的制备
本发明提供一种试剂盒，包括试剂盒本体，外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；外源性参照瓶内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。
所述外源性参照可采用U6序列（RNU6-1 RNA, U6 small nuclear 1 [ Homosapiens ] Gene ID: 26827），其工作浓度为5nmol，其作用在于监测从miRNA提取到后续实时荧光定量PCR全过程的反应效率；
茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、5×RT缓冲液（5×RT缓冲液由250mmol Tris-HCl，375mmol KCl，15mmol MgCl2，50mmol DTT 组成）、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品（这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为100nmol，本试剂盒包括下述miRNA，所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97，cut-off值50%、hsa-miR-107，cut-off值30%、hsa-miR-192， cut-off值45%、hsa-miR-196a，cut-off值20%、hsa-miR-197，cut-off值65%、hsa-miR-148a ，cut-off值20%、hsa-miR-30c，cut-off值40%、hsa-miR-30d，cut-off值50%），检测过程中上述miRNA达到上述cut-off值时，即可判定阳性；
实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100mmol Tris-HCl，500mmolKCl）、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和荧光探针。用于牙龈癌预测的miRNA试剂盒的制备工艺和操作流程是基于定量PCR技术的，试剂盒包括常用的Taq酶等，本试剂盒的价值在于能够提供精简的探针库以便检测血清样本中miRNA的变化趋势，探针库包括实施例2中筛选出的miRNA的反向互补序列。
所述引物包括：
hsa-miRNA-97-f：ttaagagacccctaactttaa (SEQ ID NO.1)
hsa-miRNA-97-r：gaaagagagcctttggcga (SEQ ID NO.2)
hsa-miR-107-f：tcttttaaaacttgacatcgcg (SEQ ID NO.3)
hsa-miR-107-r：ccgtaacactttaatggyacc (SEQ ID NO.4)
hsa-miR-192-f：aattatggtacaagccctagac (SEQ ID NO.5)
hsa-miR-192-r：ttccatctttctattagctctctcaa (SEQ ID NO.6)
hsa-miR-196a-f：gcctaagctaaaatcggctagc (SEQ ID NO.7)
hsa-miR-196a-r：cccctcgaatcctagatcttta (SEQ ID NO.8)
hsa-miR-197-f：gggaatctctcaaaatttaata (SEQ ID NO.9)
hsa-miR-197-r：cccataaaaataaggttacact (SEQ ID NO.10)
hsa-miR-148a-f：attttccggaatttaagaaaatc (SEQ ID NO.11)
hsa-miR-148a-r：ccctaaattgttttaagtttctataa (SEQ ID NO.12)
hsa-miR-30c-f：aaatttctcgaattttcctatatcc (SEQ ID NO.13)
hsa-miR-30c-r：cctctaaatcctaaagttgggt (SEQ ID NO.14)
本试剂盒用于检测hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c的表达水平，当hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c均达到cut-off值时，所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97，cut-off值50%、hsa-miR-107，cut-off值30%、hsa-miR-192， cut-off值45%、hsa-miR-196a，cut-off值20%、hsa-miR-197，cut-off值65%、hsa-miR-148a ，cut-off值20%、hsa-miR-30c，cut-off值40%，可以认为该样品来源有高罹患牙龈癌风险，需进行进一步排查。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 杭州更蓝生物科技有限公司
<120> 一种检测试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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cctctaaatc ctaaagttgg gt 22
Claims (3)
1.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于定量检测hsa-miRNA-21，hsa-miRNA-27a，hsa-miRNA-25a，hsa-miRNA-93，hsa-miRNA-34a，hsa-miRNA-223a，hsa-miRNA-181a，hsa-miRNA-121，hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203和hsa-miR-210的表达量，所述试剂盒包括试剂盒本体，外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；外源性参照瓶内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂；所述外源性参照可采用U6序列，其工作浓度为5nmol，其作用在于监测从miRNA提取到后续实时荧光定量PCR全过程的反应效率；所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10mmoldNTP混合液、5×RT缓冲液、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10mmol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品，所述miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为100nmol，所述试剂盒包括下述miRNA，所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97，cut-off值50%、hsa-miR-107，cut-off值30%、hsa-miR-192，cut-off值45%、hsa-miR-196a，cut-off值20%、hsa-miR-197，cut-off值65%、hsa-miR-148a，cut-off值20%、hsa-miR-30c，cut-off值40%、hsa-miR-30d，cut-off值50%，检测过程中上述miRNA达到上述cut-off值时，即可判定阳性；所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液、10mmol的MgCl2、5单位/μL的Taq聚合酶、10mmoldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和荧光探针，用于牙龈癌预测的miRNA试剂盒的制备工艺和操作流程是基于定量PCR技术的，试剂盒包括Taq酶，所述试剂盒能够提供精简的探针库以便检测血清样本中miRNA的变化趋势，探针库包括所述miRNA的反向互补序列，所述引物包括：
hsa-miRNA-97-f：ttaagagacccctaactttaa(SEQIDNO.1)
hsa-miRNA-97-r：gaaagagagcctttggcga(SEQIDNO.2)
hsa-miR-107-f：tcttttaaaacttgacatcgcg(SEQIDNO.3)
hsa-miR-107-r：ccgtaacactttaatggyacc(SEQIDNO.4)
hsa-miR-192-f：aattatggtacaagccctagac(SEQIDNO.5)
hsa-miR-192-r：ttccatctttctattagctctctcaa(SEQIDNO.6)
hsa-miR-196a-f：gcctaagctaaaatcggctagc(SEQIDNO.7)
hsa-miR-196a-r：cccctcgaatcctagatcttta(SEQIDNO.8)
hsa-miR-197-f：gggaatctctcaaaatttaata(SEQIDNO.9)
hsa-miR-197-r：cccataaaaataaggttacact(SEQIDNO.10)
hsa-miR-148a-f：attttccggaatttaagaaaatc(SEQIDNO.11)
hsa-miR-148a-r：ccctaaattgttttaagtttctataa(SEQIDNO.12)
hsa-miR-30c-f：aaatttctcgaattttcctatatcc(SEQIDNO.13)
hsa-miR-30c-r：cctctaaatcctaaagttgggt(SEQIDNO.14)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c的表达水平，当hsa-miRNA-97，hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c均达到cut-off值时，可以认为该样品来源有高罹患牙龈癌风险，需进行进一步排查，所述miRNA的cut-off值为hsa-miRNA-97，cut-off值50%、hsa-miR-107，cut-off值30%、hsa-miR-192，cut-off值45%、hsa-miR-196a，cut-off值20%、hsa-miR-197，cut-off值65%、hsa-miR-148a，cut-off值20%、hsa-miR-30c，cut-off值40%。
3.根据权利要求1-2任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于辅助诊断甲状腺癌、口腔癌、喉癌、腭癌、牙龈癌、舌癌、唇癌，诊断样本为血清样本。
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| Subsite-based alterations in miR-21, miR-125b, and miR-203 in squamous cell carcinoma of the oral cavity and correlation to important target proteins;Linda Boldrup，et al;《Journal of Carcinogenesis》;20121128;1-7页 * |
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