CN112143808A - 一种可作为胃癌诊断标志物的lncRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可作为胃癌诊断标志物的lncRNA及其应用。本发明通过使用MNNG造模获得胃癌模型，再通过高通量测序技术筛选获得在胃癌模型中表达差异的lncRNA，最后筛选到了所述lncRNA SC1。本发明提供的lncRNA SC1作为MNNG诱导大鼠胃癌诊断标志物，特异性好，能准确鉴别MNNG诱导大鼠胃癌模型；敏感性高，能检测出MNNG诱导大鼠癌症且诊断效率高，可靠性有保障，为诊断MNNG诱导大鼠胃癌提供了新的检测手段，检测方法简单易操作，具有良好的转化医学前景潜力。

Description

一种可作为胃癌诊断标志物的lncRNA及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种可作为胃癌诊断标志物的lncRNA及其应用。

背景技术

胃癌属于消化系统常见病，无论在全球还是在我国，胃癌发病率在所有恶性肿瘤中均排名第五；胃癌又是难治病，致死率高，其死亡率在所有恶性肿瘤中排名第三，严重威胁人类健康。虽然我国胃癌病人的五年生存率已经提升到35.9％，仍远低于韩国的68.9％的五年生存率(Claudia Allemani,Tomohiro Matsuda,Veronica Di Carlo,RheaHarewood,Melissa Matz,Maja

et al.Global surveillance of trends incancer survival 2000–14(CONCORD-3):analysis of individual records for 37 513025patients diagnosed with one of 18cancers from 322population-basedregistries in 71countries.The Lancet,2018,391(10125):1023-1075.)。2018年全球胃癌新发病超103万例，死亡超78万例，我国胃癌高发，占全球新发病例总数的近一半，且发病人数将随人口老龄化的加剧而增加。胃癌的治疗困难重重，但其发生及进展经历一个漫长的过程，其诊断和早期治疗是降低胃癌死亡率的关键。

高通量测序技术又称深度测序技术，近十余年来逐渐兴起，在基础研究和临床研究领域得到广泛应用。该技术测序通量大，而且灵敏度高，能检测到表达量很低的基因的表达，且能识别新的转录产物。

LncRNA是指长度超过200个核苷酸的非编码RNA，人类基因组编码数万个lncRNA(Thomas Derrien,Rory Johnson,Giovanni Bussotti,Andrea Tanzer,Sarah Djebali,Hagen Tilgner,Gregory Guernec,David Martin,Angelika Merkel,David G Knowles,etal.The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs:Analysis of their genestructure,evolution,and expression[J].Genome Research,2012,22(9):1775-1789.)，一些lncRNA在发育和疾病的基因调控网络中发挥“中枢调节器”功能(1、Fatica,A.,andBozzoni,I.(2014).Long non-coding RNAs:new players in cell differentiation anddevelopment.Nat.Rev.Genet.15,7–21.；2、Schmitt,A.M.,and Chang,H.Y.(2016).Longnoncoding RNAs in cancer path-ways.Cancer Cell 29,452–463.)。胃癌患者lncRNA表达异常，与胃癌的发生、转移和预后相关(邹磊，颉晚林，张鑫.LncRNA在胃癌早期诊断中的研究进展.国际检验医学杂志，2019，40(1):102-107.)。

LncRNA AC074117.10和AC073283.7被认为可以作为胃癌的耐药诊断标志物(CN110452989A)，lncRNA GMAN在胃癌中相对高表达，且在胃癌的发生发展中发挥重要作用(CN109593848A)，lncRNA LINC00941可能是与胃癌的发生发展相关的分子标志物(CN108192977A)，lncRNA ENSG00000228742(CN106701986A)、ENSG00000225521(CN106755513B)、LNCRNA SC1(CN106148529A)、HERC2P3(CN106701900A)，KRT18P55(CN105063221A)、Lnc21q22.11(CN104877998A)、FER1L4(CN103937796A)作为分子标志物在胃癌诊治中具有应用潜力。

动物实验是胃癌发生及进展机理研究的载体，也是胃癌治疗药物研发的载体。大鼠1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)诱导胃癌模型能模拟人正常胃组织到慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠化生、上皮内瘤变、胃癌、死亡全过程，为药物早期开始干预直至晚期延长生存时间提供可能性和足够大的用药窗口期，是研究药物如中医药“治未病”防治胃癌的理想模型。目前该模型已被广泛应用(陈泽慧,魏玥,安静,彭继升,黄大未,贾云飞,杨晋翔.胃癌及胃癌前病变大鼠造模方法的文献研究.天津中医药,2019，36(9)：850-855.)。然而，目前这一模型中的lncRNA诊断标志物尚无相关报道。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种可作为胃癌诊断标志物的lncRNA及其应用。

一种可作为胃癌诊断标志物的lncRNA，命名为lncRNA SC1，序列如SEQ ID No.1所示。

本发明通过使用MNNG造模获得胃癌模型，再通过高通量测序技术筛选获得在胃癌模型中表达差异的lncRNA，最后通过RT-qPCR验证筛选到了所述lncRNA SC1。

本发明又提供了所述的lncRNA在作为大鼠胃癌模型中胃癌诊断标志物中的应用。

本发明又提供了所述的lncRNA在筛选胃癌治疗药物中的应用。

本发明又提供了一种用于检测所述lncRNA的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物：5'-GTGTCCAGTGTGCGGTACAGC-3'；下游引物：5'-GGAGCTTGGCGAATCCAGTGC-3'，使用时先提取待检测样品的总RNA，再逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板、用所述引物对进行扩增来判断待检测样品中是否含有所述lncRNA。

本发明又提供了一种用于检测所述lncRNA的试剂盒，包含所述的引物对。

本发明还提供了一种非疾病诊断为目的的、用于大鼠胃癌模型辅助判断的检测所述lncRNA的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测胃癌胃部组织和正常胃组织的总RNA，逆转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用权利要求4所述引物对进行实时荧光定量PCR检测；

(3)采用相对定量法计算所述LncRNA的表达量。

其中，实时荧光定量PCR检测的反应体系为20μL PCR反应体系为：2×聚合酶链反应预混液11μL，cDNA模板1μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，无RNA酶水7μL，

其中，2×聚合酶链反应预混液包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl₂，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I。

PCR反应条件为：先95℃预变性30秒；然后95℃变性5秒，60℃退火和延伸34秒，共40个循环。

本发明提供的lncRNA SC1作为MNNG诱导大鼠胃癌诊断标志物，特异性好，能准确鉴别MNNG诱导大鼠胃癌模型；敏感性高，能检测出MNNG诱导大鼠癌症且诊断效率高，可靠性有保障，为诊断MNNG诱导大鼠胃癌提供了新的检测手段，检测方法简单易操作，具有良好的转化医学前景潜力。

附图说明

图1为胃癌模型大鼠胃癌、胃癌前病变、十二指肠癌的典型病理图。

图2为益胃饮对MNNG诱导大鼠胃癌模型胃十二指肠瘤块大小的影响检测结果图，其中，*P<0.05；YWY：益胃饮(下同)。

图3为高通量测序数据筛选流程图。

图4为高通量测序筛选差异表达lncRNA展示图。

图5为RT-qPCR验证lncRNA SC1的结果图。

具体实施方式

实施例1

(1)试剂和仪器

益胃饮：配方详见已发表的文献(董宇、赵丽莎、吴人照、陈伟、柴可群.益胃饮中药血清药物化学研究.世界科学技术-中医药现代化,2020,22(1):84-92)；

MNNG：日本东京化成工业株式会社生产，批号：75F71-TF；

总RNA提取试剂盒：Trizol(invitrogen，美国)；

反转录试剂盒：PrimeScriptTM RT Master Mix(TaKaRa，日本)；

qPCR试剂盒：SYBR Premix Ex Taq TMⅡ(TaKaRa，日本)；

引物：上海生工生物工程有限公司设计合成；

荧光定量PCR仪：StepOnePlus^TM(ABI，美国)；

分光光度计：NanoDrop ND2000(Thermo，美国)。

(2)动物实验Wistar大鼠，6周龄，体重约200g，均饲养于浙江省中医药研究院的屏障实验室内，每12h光照明暗交替。动物实验经过浙江省立同德医院伦理委员会论证和批准[No.(2016)040]。

分为自然对照组、模型组(MNNG溶液167μg/ml，自由饮用)、益胃饮组(5g/kg·d)。造模16周后益胃饮组开始灌胃给药，连续治疗24周。最后1天，戊巴比妥钠麻醉大鼠后，解剖胃部及其上游0.5cm食管和下游1.5cm十二指肠。每个胃样品垂直平均分为2部分：一部分于液氮中速冻，提取总RNA后进行高通量测序；另一部分用10％福尔马林固定，用于病理观察。

(3)病理检测

胃组织用10％福尔马林固定，经石蜡包埋后，切4μm厚度切片。切片随后进行HE染色、AB-PAS染色，光镜下检测。检测者对实验设计和结果评估均为单盲检测。

(4)高通量测序和生物信息学分析

总RNA提取：取全程胃组织，使用Trizol试剂，按照说明书提取总RNA，并用分光光度计检测总RNA质量和浓度。送样深圳华大基因科技服务有限公司进行lncRNA的高通量测序。

(5)RT-qPCR检测基因表达

PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara，日本)反转mRNA(500ng/10μl体系)，SYBRPremix Ex Taq II(Tli Rnase H Plus)(Takara，日本)做qPCR，实验按照试剂盒说明进行。

(6)统计

统计方法：采用SPSS17.0统计软件进行统计，所有数据以均数±标准差

的形式表示，组间比较采用LSD-t和Dunnett t-检验方法检验，P<0.05为有统计意义，差异显著。

(7)实验结果1：图1展示了胃癌模型大鼠胃癌、胃癌前病变、十二指肠癌典型病理图片。结论：MNNG诱导大鼠胃癌模型成功。

(8)实验结果2：图2展示了益胃饮对MNNG诱导大鼠胃癌模型胃十二指肠瘤块大小的影响。结论：益胃饮显著降低MNNG诱导大鼠胃癌模型胃十二指肠瘤块大小。

(9)实验结果3：高通量测序筛选MNNG诱导大鼠胃癌的lncRNA标志物及应用

通过高通量测序(图3)，得到在正常组、模型组、益胃饮组表达的lncRNA分别为7403、6881、6832个，通过华大基因多组学数据分析系统，筛选出在正常组和模型组之间差异表达的116个lncRNA，其中77个在模型组上调，39个下调。针对这116个lncRNA，通过单因素方差分析，筛选出在三组间差异表达的，且在益胃饮组表达差异逆转的lncRNA共5个(图3、图4)。

(10)实验结果4：RT-qPCR验证

用RT-qPCR的方法验证这5个lncRNA在三组间的表达差异，引物如下：

上游引物：5'-GTGTCCAGTGTGCGGTACAGC-3'；

下游引物：5'-GGAGCTTGGCGAATCCAGTGC-3'。

其中，实时荧光定量PCR检测的反应体系为20μL PCR反应体系为：2×聚合酶链反应预混液11μL，cDNA模板1μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，无RNA酶水7μL，

其中，2×聚合酶链反应预混液包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl₂，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I。

PCR反应条件为：先95℃预变性30秒；然后95℃变性5秒，60℃退火和延伸34秒，共40个循环。

结果只有BGIG10116_32332通过验证，我们将其命名为lncRNA SC1(图5)，lncRNASC1的序列如SEQ ID No.1所示。

序列表

<110> 浙江省中医药研究院

<120> 一种可作为胃癌诊断标志物的lncRNA及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 420

<212> RNA

<213> 大鼠(Rattus norvegicus)

<400> 1

acagaggaga caagcccugg auucccaggu cuucauaucc agugaucagc acugcacaga 60

ccaaguacca uguacuucag caucagcuug guuuuccuug ugcucauuuu aaaaaguguc 120

cagugugcgg uacagcuggu ggagucugga ggaggcuuag ugcagccugg aaagucccug 180

aaacucuccu guucagccuc uggauucaca uucaguagcu auggcaugca cuggauucgc 240

caagcuccag gaaaggggcu agauuggguu gcauacauua guaguagcag cgguacgguc 300

uaugcagacg cugugaagga acgguucacc aucuccagag acaaugcaaa gaacacccug 360

uaccugcaac ucaacagucu gaagucugaa gacacugcca ucuauuacug ugcaagaagc 420

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgtccagtg tgcggtacag c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagcttggc gaatccagtg c 21

Claims (8)

1.一种可作为胃癌诊断标志物的lncRNA，命名为lncRNA SC1，序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的lncRNA在作为大鼠胃癌模型中胃癌诊断标志物中的应用。

3.如权利要求1所述的lncRNA在筛选胃癌治疗药物中的应用。

4.一种用于检测权利要求1所述lncRNA的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物：5'-GTGTCCAGTGTGCGGTACAGC-3'；下游引物：5'-GGAGCTTGGCGAATCCAGTGC-3'，

使用时先提取待检测样品的总RNA，再逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板、用所述引物对进行扩增来判断待检测样品中是否含有所述lncRNA。

5.一种用于检测权利要求1所述lncRNA的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求4所述的引物对。

6.一种非疾病诊断为目的的、用于大鼠胃癌模型辅助判断的检测权利要求1所述lncRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测胃癌胃部组织和正常胃组织的总RNA，逆转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用权利要求4所述引物对进行实时荧光定量PCR检测；

(3)采用相对定量法计算所述LncRNA的表达量。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR检测的反应体系为20μLPCR反应体系为：2×聚合酶链反应预混液11μL，cDNA模板1μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，无RNA酶水7μL，其中，2×聚合酶链反应预混液包括2.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl₂，100μmol/L dNTPs和2.0mmol/L SYBR Green I。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：先95℃预变性30秒；然后95℃变性5秒，60℃退火和延伸34秒，共40个循环。

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