CN105586399A - 一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒 - Google Patents

一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒。本发明血清/血浆lncRNA标志物为MALAT1和HOTAIR的组合，所述该引物为MALAT1和HOTAIR的引物，其中MALAT1的上下游引物序列是SEQ？No.1和SEQ？No.2；HOTAIR的上下游引物序列是SEQ？No.3和SEQ？No.4。本发明克服了仅采用一种血清/血浆lncRNA作为肿瘤标志物试剂盒敏感度和特异度均较低，从而导致早期胃癌诊断的错诊率和漏诊率大大增加的缺陷。本发明提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类lncRNA生物标志物的成功开发有助于胃癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴，采用lncRNA芯片检测以获取疾病特异和异常表达的血清/血浆lncRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法进行单个验证，采用了染料法进行验证。

Description

一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒。
背景技术
胃癌是世界第二高发肿瘤，同时也是胃肠道肿瘤中最常见肿瘤之一。尽管胃癌恶性程度较高，但若能早期发现早期治疗，仍可获得最佳治疗效果，早期胃癌手术切除率为90％-100％，5年生存率可达70％-100％，与进展期胃癌相比，两者治疗效果存在着巨大的反差。但大部分患者就诊时已处于晚期。目前对胃癌的生物学标志进行了大量而广泛的研究，包括基因标记、血清学标记和细胞学标记等，由于这些指标的特异性和敏感性各有差异，对于早期胃癌目前还没有准确有效的筛查方法，也缺乏可靠的诊断措施。由鉴于此，胃癌早期诊断率亟待提高，寻找有效的标志物对胃癌早期诊断、促进其预后有重要意义。
非编码RNA(ncRNA)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点，它分为miRNA和lncRNA。LncRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的长度超过200nt的RNA分子，本身不具有开放阅读框，且具有高度保守性、时序性和组织特异性，通过与靶mRNA结合，降解或者抑制mRNA的翻译导致靶基因的转录后沉默，从而调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。
在本发明作出之前，近年来，lncRNA与肿瘤的关系已经成为研究的热点和焦点，已经发现lncRNA通过与基因的共表达和肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等发病高度相关。研究已经证实血清/血浆中存在着几百种lncRNAs，这些长链分子性质稳定，含量丰富且不会降解，易于定量检测，并存在着显著的疾病特异性。血清/血浆lncRNA作为肿瘤诊断和预后分子标志物不仅创伤小，方法便捷，还能改进疾病诊断，肿瘤分类，预后估计、疗效及复发预测的准确度。但是，血清/血浆lncRNA的表达量还是相对较低，若无标准化试剂盒的规范化步骤，血清/血浆lncRNA不易检出，失去早期诊断的可能；另一方面，仅采用一种血清/血浆lncRNA作为肿瘤标志物往往特异性不足，因仅采用一种血清/血浆lncRNA作为肿瘤标志物试剂盒敏感度和特异度均较低，从而导致早期胃癌诊断的错诊率和漏诊率大大增加。没有用于早期胃癌患者血清学诊断的较为稳定的生物标志物，就不能筛选出胃癌异常表达的血清/血浆lncRNAs作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，提出一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒。
一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒，其主要技术特征在于血清/血浆lncRNA标志物为MALAT1和HOTAIR的组合。
所述该引物为MALAT1和HOTAIR的引物，其中MALAT1的上下游引物序列是SEQNo.1和SEQNo.2；HOTAIR的上下游引物序列是SEQNo.3和SEQNo.4。
所述该试剂盒用于检测血清/血浆中MALAT1和HOTAIR。
所述该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。
本发明的有益效果：
本发明提供的血清/血浆lncRNA标志物作为胃癌诊断的标志物的优越性在于：
(1)血清/血浆lncRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类lncRNA生物标志物的成功开发有助于胃癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)血清/血浆lncRNAs试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于胃癌患者的辅助诊断，有助于反映胃癌患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个体化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的设计和评价体系，本发明人采用lncRNA芯片检测以获取疾病特异和异常表达的血清/血浆lncRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法进行单个验证，采用了染料法进行验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆lncRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明优点为通过控制年龄和性别等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆lncRNA在胃癌辅助诊断的应用前景，阐述异常表达的lncRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使胃癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1——显示胃癌病例组和健康人对照组lncRNA的柱状示意图，其中A为胃癌病例组和健康人对照组血清MALAT1表达图，B为胃癌病例组和健康人对照组血清HOTAIR图。
图2——显示AUC曲线(A)MALAT1(B)HOTAIR(C)联合示意图，其中，A为胃癌患者MALAT1的AUC曲线，曲线下面积为0.849；B为胃癌患者HOTAIR的AUC曲线，曲线下面积为0.752；C为胃癌患者MALAT1和HOTAIR联合AUC曲线，曲线下面积为0.869。
具体实施方式
本发明的技术思路是：
以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，并控制患者年龄和性别等因素对于发病的影响)，并采用RT-PCR、Real-timePCR方法、LncRNAmicroarray芯片检测等。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：
(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。
(2)血清/血浆lncRNA差异表达谱分析：选择胃癌病例、与胃癌病例年龄、性别匹配的健康人对照，检测其血清/血浆lncRNA表达谱及含量，分析胃癌病例和健康人对照间血清/血浆lncRNA的共性和特性，筛选差异表达lncRNAs，进行进一步单个样本验证，确定胃癌发病相关血清/血浆lncRNAs。
(3)血清/血浆lncRNA筛查和诊断试剂盒的研制：根据胃癌病例和健康人对照的特异血清/血浆lncRNA开发lncRNAs诊断试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物，该标志物为MALAT1和HOTAIR的组合。
所述的血清/血浆lncRNA标志物的引物，这些引物为：
MALAT1的引物为SEQNo.1和SEQNo.2；HOTAIR的引物为SEQNo.3和SEQNo.4。
所述的血清/血浆lncRNA标志物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的血清/血浆lncRNA标志物的引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。一种胃癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中MALAT1和HOTAIR。所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有血清/血浆lncRNA中MALAT1和HOTAIR的引物。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的血清/血浆lncRNA标志物的引物为：
MALAT1的引物为SEQNo.1和SEQNo.2；HOTAIR的引物为SEQNo.3和SEQNo.4。
所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，Mgcl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体来说主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)经病理学明确诊断的胃癌病例
(2)采血前未经过手术和化疗，无手术前放化疗
(3)与病例年龄、性别匹配的健康人对照
本研究共采用6例符合标准的样本进行研究。
2.Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取血清/血浆总RNA，按常规方法操作。通常能得到～5ugRNA/50ml血清/血浆。
3.LncRNAmicroarray芯片检测(欧易公司)
(1)总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品
(2)cDNA样品进行预扩增反应
(3)预扩增产物进行LncRNAmicroarray芯片检测，得到lncRNA的表达谱
(4)数据分析和处理
4.Real-timeRT-PCR(qRT-PCR)方法
(1)取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品
(2)设计引物
(3)加入荧光探针或染料进行PCR反应
(4)检测并比较胃癌病例与健康人对照血清/血浆样本中lncRNA的量的变化。
5.诊断试剂盒制备方法
LncRNAmicroarray芯片检测方法综合确定胃癌病例和健康人对照中有拷贝差异和表达差异，通过qRT-PCR技术筛选在胃癌病例和健康人对照中表达量和差异程度大的一组血清/血浆lncRNA，作为胃癌辅助诊断的指标。最后筛选出的与胃癌发病有关的血清/血浆lncRNA组成诊断试剂盒(MALAT1和HOTAIR)。诊断试剂盒可以包括这些血清/血浆lncRNA组合的引物，探针，以及Taq酶，dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用x2检验(用于分类变量)或者studentt检验(用于连续性变量)，比较人口学特征、组织类型和lncRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。
我们在3例胃癌病例和3例健康人对照中运用LncRNAmicroarray芯片的研究结果发现有5种lncRNAs与胃癌发病情况有显著关联。个体lncRNAs检测的不同表达水平以2-ΔCt表示，其中ΔCt＝CT样本-CT内参，我们在每一个样本提取时加入GAPDH作为参照，计算相对表达量。对有统计学显著差异的lncRNAs在3例胃癌病例和3例对照中进行单个验证，进而观察本研究结果的稳定程度。
以下是本发明进一步说明：
在上述3例符合条件的胃癌病例及3例健康人对照中，两组年龄按个体精确匹配。我们将这两组人群作为探索性样本lncRNA芯片检测获得相关结果。
根据lncRNA芯片检测，检测到在胃癌病例组和健康人对照组的血清中存在差异表达(ΔΔCT＞2)的长链非编码RNA：MALAT1、HOTAIR、H19。
选择在胃癌病例组和健康人对照组中CT值均小于35的lncRNA，以提高检测效率，满足上述条件的lncRNAs包括：MALAT1，HOTAIR，H19和MEG3。SYBR染料法qRT-PCR结果发现在3例胃癌病例和3例健康人对照中，HOTAIR和MALAT1在胃癌病例组和健康对照组中表达情况存在显著性差异。多因素Logistic回归分析结果表明，这两种lncRNAs的表达水平均与胃癌的发病存在着显著关联，即MALAT1和HOTAIR在病例组中均明显高表达。
根据上述结果，将这两种与胃癌发病相关的lncRNAs在60例胃癌病例和60例健康人对照中进一步的单个验证。发现血清/血浆高表达MALAT1和HOTAIR的高表达与胃癌发病相关联。如图1(A)所示，胃癌病例组血清MALAT1表达明显较对照组增高近三倍；如图1(B)所示，胃癌病例组血清HOTAIR表达明显较对照组增高近五倍。以上均提示，MALAT1和HOTAIR表达在胃癌病人血清中明显增高，可用于区别胃癌患者和健康对照。
进一步分析这2种lncRNA的组合用于胃癌诊断的效果，发现其组合对胃癌发病诊断的AUC[AreaundertheROCcurve，ROC曲线(ReceiverOperatingCharacteristiccurve，受试者工作特征曲线)下面积]与单个lncRNA相比增加。如图2(A)所示为胃癌患者MALAT1的AUC曲线，曲线下面积为0.849；图2(B)为胃癌患者HOTAIR的AUC曲线，曲线下面积为0.752；图2(C)为胃癌患者MALAT1和HOTAIR联合AUC曲线，曲线下面积为0.869。由图可知，两种lncRNAs的结合检测将显著提高早期胃癌检出率。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于胃癌诊断的试剂盒，包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟MALAT1和HOTAIR的引物和其他检测试剂。
具体而言，这两种lncRNAs，或者这两种lncRNAs的引物组合构成的相关诊断试剂盒有助于胃癌的诊断，为临床医生快速准确掌握患者疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个体化的防治方案提供支持，从而最大限度提高胃癌患者的生存率。
实施例1样品的收集和样品资料的整理
病例为2010年6月至2014年12月在江苏省人民医院及靖江市人民医院收集的新发胃癌病例，均经病理组织学确诊。对照为同期进行社区疾病筛查的健康个体，按性别和年龄与病例进行频数匹配。用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了6例符合下列标准的样本作为lncRNA芯片检测和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品：
1.新发胃癌病例
2.采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗
3.与病例年龄、性别匹配的健康人对照
并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。
实施例2血清/血浆中lncRNA的lncRNA芯片检测
将3例胃癌患者和3例健康人对照经lncRNA芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、分别取“胃癌病例”组和“健康人对照”组患者的血清1ml，加入等体积的Trizol试剂1ml，冰上放置5min；
2、加入氯仿1ml/管，用力振摇15s。15-30℃下孵育2-3min，离心(4℃，12，000g，15min)。离心后液体分为三层(上层-无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质)，小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。
3、加入等体积异丙醇，0.4-0.5ml，混匀，15-30℃下孵育10-30min，离心(4℃，12，000g，10min)。去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，漩涡振荡30s，离心(4℃，7，500g，5min)。小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。加入20ulDEPC水溶解。
4、测量浓度：一般浓度为2.0mg/1ml血清。
5、用逆转录试剂盒通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括0.8ul逆转录引物(10×)，0.2ul100mMdNTPs混合物，1.5ul逆转录酶(50U/ul)，0.8ul10×逆转录缓冲液，0.9ul25mM氯化镁，0.1ulRNA抑制剂以及0.2ul无核酸酶水。加入3ul的总RNA。反应步骤为16℃孵育2分钟，42℃反应1分钟，50℃反应1秒，上述3步经40个循环反应，再85℃孵育5分钟。
6、对待进行芯片检测的RNA进行预扩增以增加表达所需的cDNA的量。预扩增的反应体系包括：12.5ul预扩增MasterMix(2×)，2.5ul预扩增引物(10×)，7.5ul无核酸水，2.5ulcDNA。反应步骤为95℃10分钟，55℃2分钟，72℃2分钟，95℃15秒，60℃4分钟，12个循环，99.9℃10分钟，反应结束后加入75ul0.1×TE稀释。
7、取9ul稀释后的预扩增产物，加入450ul基因表达MasterMix，441ul无核酸酶水，充分混匀后，在芯片上加入100ul/孔，1000rpm离心1分钟，离心2次。该芯片实验使用的是ABIPrism7900荧光定量PCR仪。选择384-wellTaqmanLowDensityArray特定程序进行反应。
8、数据分析与处理：将CT阈值设为0.2，ΔCT＝CT样本-CTGAPDH，两组样品血清lncRNAs的表达量比值可用方程ΔΔCT表示，ΔΔCT＝ΔCT病例-ΔCT对照。通过芯片检测发现“胃癌病例”组和“健康人对照”组中血清表达差异的微小核糖核酸已列出。
实施例3血清/血浆中lncRNA的qRT-PCR实验
根据上述芯片结果，选择满足下列条件的lncRNAs用qRT-PCR方法进一步验证：
1)芯片中两组研究对象的CT值均不大于35以提高检测效率；
2)芯片中ΔΔCT大于2。对所选择的MALAT1、HOTAIR两个lncRNAs设计qRT-PCR的引物(见表1)。对“胃癌病例”组和“健康人对照”组的血清单个个体进行lncRNA的qRT-PCR检测。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。用SYBR染料法进行qRT-PCR检测。
表1相关lncRNA引物信息
(1)制备RNA样品：具体步骤同上述；
(2)SYBR染料法：a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。染料法的逆转录的反应体系包括4ul5×AMV缓冲液，2ul10mMdNTP混合物(Takara公司)，0.5ulRNase抑制剂(Takara公司)，2ulAMV(Takara公司)以及1.5ullncRNA特异性反向引物一种或几种的混合物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。
(3)qRT-PCR：将cDNA按1/5体积稀释，取0.5ul稀释后的cDNA，加入0.15ulTaq酶(Takara公司)，0.5ul20×EVAGREEN，0.1ul10uM正向引物一种，0.1ul10uM反向引物一种，0.6ul25mMMgCl2，0.8ul2.5mMdNTP混合物(Takara公司)，1ul10×PCR缓冲液，6.75ul双蒸水，10ul体系进行qRT-PCR。仪器使用的是ABIPrismStepOne荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃，5分钟进行1个循环，95℃，15秒，60℃，1分钟进行45个循环。
(4)数据处理与分析：两组样品血清lncRNAs的表达量比值可用方程2-ΔCt表示，其中ΔCt＝CT样本-CT内参，我们在每一个样本提取时加入GAPDH的RNA作为参照，计算相对表达量。
染料法qRT-PCR结果发现在120例样本中，有2种lncRNAs(MALAT1和HOTAIR)在两组间的表达情况存在显著性差异。
实施例4利用ROC曲线方法进一步分析2种lncRNA的组合对胃癌发病的诊断
根据上述qRT-PCR结果，本发明人通过对2组血浆样品(“胃癌病例组”和“健康人对照组”)的lncRNAs表达水平的分析，以对照组MALAT1和HOTAIR表达量为标准，绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这两种lncRNAs对胃癌发病的判断能力。就单个lncRNA而言，MALAT1以84.9％的AUC将对照组和病例组分开，最佳临界点的灵敏度为68.3％，特异度为85.0％；HOTAIR以75.2％的AUC将对照组和病例组分开，最佳临界点的灵敏度为58.3％，特异度为81.7％。对2个标志物的联合分析发现，这2种lncRNAs的组合以86.3％的AUC将健康人对照组和胃癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为76.7％，特异度为86.7％(图2)。因此，本发明人证明了采用MALAT1和HOTAIR的组合能够很好地将健康人对照和胃癌患者区分。
实施例5用于胃癌辅助诊断的lncRNA试剂盒的制作
LncRNA试剂盒的制作和操作流程是基于lncRNA芯片检测，RT-PCR和real-timePCR等技术。试剂盒包括血清/血浆lncRNA引物(包括下列引物：MALAT1的引物为SEQNo.1和SEQNo.2；HOTAIR的引物为SEQNo.3和SEQNo.4)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，去核酸水，荧光染料，Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其他组织样品，通过最精简的荧光法检测lncRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助诊断胃癌，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。

Claims (4)

1.一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物试剂盒，其特征在于血清/血浆IncRNA标志物为MALAT1和HOTAIR的组合。
2.根据权利要求1所述的一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物试剂盒，其特征在于该引物为MALAT1和HOTAIR的引物，其中MALAT1的上下游引物序列是SEQNo.1和SEQNo.2；HOTAIR的上下游引物序列是SEQNo.3和SEQNo.4。
3.根据权利要求1所述的一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测血清/血浆中MALAT1和HOTAIR。
4.根据权利要求1所述的一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PGR反应常用的酶和试剂。
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