CN110669841A - lncRNA HOXD-AS2作为胃癌诊断标志物的应用 - Google Patents

lncRNA HOXD-AS2作为胃癌诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了lncRNA HOXD‑AS2作为胃癌诊断标志物的应用，涉及医学生物检测技术领域，本发明提供了lncRNA HOXD‑AS2在作为胃癌诊断标志物的应用，本发明还构建了的包含一对特异性检测引物的胃癌诊断试剂或试剂盒，用于检测组织标本或血浆、血清、血小板等血液样本。本发明具有良好的临床应用价值，在对胃癌诊断具有较好的检测效果。

Description

lncRNA HOXD-AS2作为胃癌诊断标志物的应用
技术领域
本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及lncRNA HOXD-AS2作为胃癌诊断标志物的应用。
背景技术
中国是胃癌发病率最高的国家之一，胃癌的新发病例占全世界的40％以上，胃癌是恶性肿瘤死亡率的第三位病因。近年来，随着诊疗技术不断提高，虽然胃癌的死亡率有所下降，预后明显改善，在我国大的医疗中心胃癌5年的生存率已有显著提高。但相对于日本的数据，仍有相当大的差距。如何有效提高胃癌的诊治水平，一直是临床医生关注的热点和难点问题。虽然诊疗技术在不断提高，但胃癌患者的生存率仍然很低，主要是由于大多数的病人确诊已处于中晚期。
表达谱基因芯片是近年兴起应用于研究标本之间目标基因表达谱的一种常用技术，在芯片的定制、数据的采集和结果的分析已形成比较完善的体系。因此，基因芯片在研究疾病发生发展的机制与基因改变之间的关系占据重要的地位，为研究基因在疾病的致病过程、诊断和治疗等方面提供一种有效的方法。目前，已有很多研究组利用这一技术研究各种肿瘤相关联的lncRNA，并筛选出与肿瘤进展及预后相关的lncRNA。
lncRNA是新发现的一类非编码RNA，其长度超过200bp，并且缺乏明显的开放阅读框(Open Reading Frames,ORF)，根据其染色体的位置可分为5类即：正义lncRNA，反义lncRNA，基因间lncRNA，双向lncRNA和基因内lncRNA。目前，有大量的证据显示lncRNA通过转录水平到转录后水平的不同机制在肿瘤的生物学特性中起着重要的调控作用，如干扰转录、蛋白的活化或失活、转录因子的运输或活化、染色体的修饰、表观遗传的调节等等。
近来，胃癌相关lncRNA的研究已取得了明显的成果，现已成为一个国内外研究的热点。如：lncRNA GHET1通过和胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白1(insulin-like growthfactor2mRNA binding protein 1,IGF2BP1)的协同作用，加强c-Myc mRNA的稳定性，从而增加其表达量而促进胃癌细胞的增殖。lncRNA TINCR通过结合STAU1(staufen1)蛋白作用于KLF2，保护其mRNA而防止降解，表达增加的KLF2直接作用于依赖的cyclin激酶基因A(cyclin-dependent kinase gene A,CDKN1A/P21)和依赖的cyclin激酶基因B(cyclin-dependent kinase gene B,CDKN2B/P15)，从而调节胃癌细胞的增殖和凋亡。此外，lncRNAPVT1通过和EZH2的协同作用调节p15和p16，从而促进胃癌细胞的增殖。然而，还有大量胃癌相关lncRNA异常调节信号通路尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于：提供lncRNA HOXD-AS2作为胃癌诊断标志物的应用，具体为提供lncRNA HOXD-AS2在作为胃癌诊断标志物中的应用，以及检测lncRNA HOXD-AS2表达量的试剂在制备用于胃癌诊断的试剂或试剂盒中的应用。
本发明采用的技术方案如下：
lncRNA HOXD-AS2在作为胃癌诊断标志物中的应用。
检测上述lncRNA HOXD-AS2的试剂在制备胃癌诊断的检测试剂或试剂盒中的应用。
进一步地，检测试剂或试剂盒用于检测生物样品中lncRNA HOXD-AS2的表达量。
进一步地，试剂或试剂盒包括：对lncRNA HOXD-AS2具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
进一步地，对lncRNA HOXD-AS2具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-AGGAACTGCTCTGGTGAACTCC-3'；
下游引物：5'-TGGGCATCTCTTTCAGGAAGGT-3'。
lncRNA HOXD-AS2在筛选人胃癌诊治药物中的应用。
lncRNA HOXD-AS2在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。
进一步地，药物组合物包括lncRNA HOXD-AS2和/或其表达产物的促进剂。
许多血清标志物如CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、癌抗原242(CA242)和CA50被广泛用于胃癌的检测。然而，低灵敏度或低特异度降低了其对胃癌的临床诊断价值。
检测循环lncRNA，相较于胃镜等有创检查手段，只需采集体液，具有非侵入性的检测特点，大大减轻了患者痛苦和检测的繁琐。相较于常规肿瘤标志物，如CA19-9、CA125、CA72-4、CA242、CA50、CEA和胃蛋白酶原，lncRNA具有更高的灵敏度和特异度，尤其是血浆外泌体型lncRNA。因此，lncRNA可作为胃癌早期诊断的标志物。
综上所述，本发明提供的lncRNA HOXD-AS2作为胃癌诊断标志物，特异性好，能准确鉴别胃癌患者；敏感性高，能早期检测出癌症患者且诊断效率高，可靠性有保障，为诊断胃癌提供了新的临床手段，检测方法简单易操作，具有良好的转化医学前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为胃癌组织和其对应的癌旁组织中lncRNA HOXD-AS2相对表达水平图；
图2为胃癌细胞系中lncRNA HOXD-AS2相对表达水平图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
lncRNA HOXD-AS2在作为胃癌诊断标志物中的应用。
检测上述lncRNA HOXD-AS2的试剂在制备胃癌诊断的检测试剂或试剂盒中的应用。
所述的检测试剂或试剂盒用于检测生物样品中lncRNA HOXD-AS2的表达量；通过实时定量PCR技术检测lncRNA HOXD-AS2的表达量。
所述的生物样品选自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液等。
试剂或试剂盒包括：对lncRNA HOXD-AS2具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
所述对lncRNA HOXD-AS2具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-AGGAACTGCTCTGGTGAACTCC-3'；
下游引物：5'-TGGGCATCTCTTTCAGGAAGGT-3'。
lncRNA HOXD-AS2在筛选人胃癌诊治药物中的应用。
lncRNA HOXD-AS2在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。
药物组合物包括lncRNA HOXD-AS2和/或其表达产物的促进剂
本发明用于检测血清中lncRNA HOXD-AS2的检测方法，具体步骤如下：
(1)组织标本采集
胃癌组织：于肿瘤上切取直径为0.5-1.0cm左右的胃癌组织。
癌旁组织：距肿瘤边缘大于5cm以上，切取0.5-1.0cm大小正常胃组织。
为防止RNA的降解，在手术切下时立即切取标本，用PBS清洗两次后放入冻存管立即置入液氮，最后转运至-80℃冰箱长期保存。
(2)总RNA的抽提
1)组织匀浆
取出待测样本放于冰上解冻，称取5g胃癌组织样本，将其绞碎加入1mL Trizol，于冰上组织均浆机8000r/min，均浆2min，使组织充分磨碎；
2)于冰上静置10-15min，使细胞充分裂解；
3)按5:1的比例，加入200μL氯仿，充分混匀后在室温下静置15min；
4)4℃，12000rpm离心15min至液体分层；
5)吸取约700μL上清液至新的EP管中；
6)加入700μL异丙醇，充分混匀室温静置30min；
7)4℃，12000rpm离心10min，至管底出现沉淀，弃去上清液；
8)加入1mL 75％乙醇，混匀，室温静置5min；
9)4℃，8000rpm离心10min，弃去上清液；
10)打开EP管盖，于室温放置10min，使乙醇充分挥发；
11)加入50-100μL 0.01％DEPC水，轻柔吹打使RNA完全溶解于DEPC水中；
12)使用分光光度计检测RNA的浓度和纯度，经紫外分光光度计检测，A260/A280在1.9～2.1视为提取的RNA的纯度很高。经测定符合实验要求。
(3)cDNA第一链合成
Ribonuclease Inhibitor1μL；
5×ReactionBuffer缓冲液5μL；
dNTPs 1.25μL；
Reverse TranscriPtase 1μL；
Mgcl2 4μL；
Oligo(dT)15Primer1μL；
Random Primer1μL；
无核酸酶的双蒸水至总体积25ul。
(4)定量PCR实验及结果分析
RT-qPCR采用2×SYBR Green Master Mix，采用20μL体系，其中cDNA1.5μL，正向引物0.4μL，反向引物0.4μL，2×SYBR Green Master Mix10μL，无核酸酶的双蒸水7.7μL。
PCR反应条件：95℃30s；60℃30s；70℃30s扩增45个循环。以β-actin为内参照。结果分析采用经典的2-△△Ct法进行基因表达的相对定量。目的基因Ct值用内参基因来进行统一标准化(△Ct＝Ct目的-Ct内参)。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
分别对于胃癌组织和其对应的癌旁组织中lncRNA HOXD-AS2的相对表达水平进行测试，结果如图1所示，由图可知，胃癌组织中lncRNA HOXD-AS2相对表达水平明显低于其对应的癌旁组织。
实施例2
分别对于5株胃癌细胞系AGS、MGC-803、SGC-7901、BGC-823、SNU-1和正常胃粘膜细胞GES-1中的lncRNA HOXD-AS2的相对表达水平进行测试，结果如图2所示。
由图可知，胃癌细胞系AGS、MGC-803、SGC-7901、BGC-823、SNU-1中HOXD-AS2相对表达水平明显低于正常胃粘膜细胞GES-1。
实施例3
检测79名胃癌患者的lncRNA HOXD-AS2的表达水平，其lncRNA HOXD-AS2的表达水平与胃癌患者临床资料的关系如下表1所示。
表1 lncRNA HOXD-AS2的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系
Figure BDA0002262664420000051
Figure BDA0002262664420000061
HOXD-AS2低表达与淋巴结转移(P＝0.009)和TNM分期(P＝0.040)有关，而与胃癌患者的性别、年龄、是否吸烟、是否饮酒、肿瘤直径、分化程度、肿瘤浸润深度、远处转移、脉管浸润、神经浸润、肝脏转移、有无腹水及脂肪结节是否转移均无关(P>0.050)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> lncRNA HOXD-AS2作为胃癌诊断标志物的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggaactgct ctggtgaact cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgggcatctc tttcaggaag gt 22
<210> 3
<211> 692
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggaaatgta ggggagcagc cggactgagc tgcccaaggg ggtcggcgcc ccaggcttct 60
tggtggcatg ctggggagcg gggagggggc gattcttacc cgaaggctgc cgagctacag 120
gcggcggtcg gtccgggcgt ctgctgtaat ccactaggcg ctgcccggct gcgctcactc 180
tcggacgcag agacccgctc atgttggtga agaagccgcg ccagaaccgc gcggctgcag 240
tcacctcgag caggccggct gctcctggca ggcggtgtcg gcgccggcgg gggactcggc 300
gcccagggcc ccttccaggc cctccctcgc cgggctcccc accagctccg gaggtggcgg 360
cgatgcggac cgagtgagcg gcggtggggc caggccgggc gccgggcggg agccgaggcc 420
gcggcggact ccgcaatccc gcagccggtg actggagccc acctctgcag agacaaagga 480
actgctctgg tgaactcccc ctgaaagtaa atgtccttgg ctggcctcca gcattcccct 540
catgggcata gccatgcagc cttcagaacc ttcctgaaag agatgcccaa ggattcagca 600
aacacggggg aagcagagga cacaagaagc ttggatgtga aatagcactt ccttctgtgt 660
tacagaataa aacaatattt taaattacac aa 692

Claims (8)

1.lncRNA HOXD-AS2在作为胃癌诊断标志物中的应用。
2.检测权利要求1所述lncRNA HOXD-AS2的试剂在制备胃癌诊断的检测试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的检测试剂或试剂盒用于检测生物样品中lncRNA HOXD-AS2的表达量。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒包括：对lncRNAHOXD-AS2具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的对lncRNA HOXD-AS2具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-AGGAACTGCTCTGGTGAACTCC-3'；
下游引物：5'-TGGGCATCTCTTTCAGGAAGGT-3'。
6.lncRNA HOXD-AS2在筛选人胃癌诊治药物中的应用。
7.lncRNA HOXD-AS2在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物组合物包括lncRNA HOXD-AS2和/或其表达产物的促进剂。
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