CN103740854A - 一种肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程和医药领域，涉及一种新的结直肠癌早期诊断的肿瘤标记物，更具体地说公开了一种与结直肠癌相关的肿瘤标记物及其应用。该标志物为CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)的组合。该标志物及其引物、抗体可用于诊断试剂盒应用，用于结直肠癌的辅助诊断。

Description

一种肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂中的应用
技术领域
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与结直肠癌相关的血清/组织肿瘤标记物及其应用。
背景技术
结肠癌、直肠癌是常见的恶性肿瘤，进展期占大多数，其发病率已居恶性肿瘤的第4位。随着经济发展、生活方式、生活环境及膳食结构的改变，结直肠癌的发病率呈不断上升趋势。虽然结直肠癌的诊断水平有了提高，但早期结直肠癌的检出率仍然较低而死亡率较高。据统计显示，早期结肠癌根治后5年生存率约为80%，而进展期结肠癌术后5年生存率仅为50%。因此，早期诊断是提高结肠癌治愈率的关键因素，寻找敏感性、特异性高的肿瘤标志物成为临床科学研究的重点目标。
血清肿瘤标志物是结肠癌诊断常用方法之一，CEA、CA19-9、CA242等。其中以CEA为主，有40%～70%结肠癌患者中CEA增高。但这些标记物单独作为诊断胰腺癌的指标尚不精确，敏感性较低，并且在其他消化道肿瘤及良性疾病中也有升高，因此对结肠癌早期诊断的价值有限。另外，一些基因肿瘤标志物如p53,k-ras等也用于临床结肠癌的早期诊断，但始终未能达到诊断的目的。因此，寻找敏感性高、特异性强、结果稳定的肿瘤标志物仍是结肠癌早期诊断中亟待解决的问题。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatins,CSTs）能抑制细胞内外的半胱氨酸蛋白酶，在肿瘤的生长、血管生成、浸润和转移起重要作用，可作为肿瘤诊断和预后估计的标志物。Cystatins最早是由Anastasi等采用亲和层析的方法首次在鸡蛋清中分离得到的对半胱氨酸蛋白酶有抑制作用的一种蛋白质，作为一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂的超家族，依据其分子结构主要分成三大类：⑴胞内cystatin也称stefis,包括A和B2个成员；⑵分泌型cystatins,包含有C、D、E/M、F、G、S、Sv和SA等成员；⑶血浆中的激肽原,包含低分子质量和高分子质量激肽原。目前这个家族中，研究较多，并且与恶性肿瘤关系较为明确的主要是CystatinA、B、C和M等。CST1、CST4、CST2均属于Cystatin家族中的II型分泌蛋白，近年来有研究发现，Cyatatin SN在胃癌组织中呈现高表达，并与胃癌细胞的侵袭转移相关。又有研究结果表明，其在直肠癌细胞中和患者血液中有高表达。基于Cystatin家族的功能，将其作为临床肿瘤标记物具有很大的临床应用价值及前景。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与结直肠癌相关的组织肿瘤标记物。
本发明的第二个目的是提供上述组织肿瘤标记物的mRNA引物及抗体。
本发明的第三个目的是提供上述组织肿瘤标记物的mRNA引物及抗体在制备结直肠癌诊断剂中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种检测结直肠/直肠癌的试剂盒。
本发明的目的通过以下技术方案得以实施：
发明提供了一种与结直肠癌相关的组织基因标记物，该标记物为CystatinSN、CystatinS和CystatinSA中的一种或多种的组合。
优选地，所述的标记物为CystatinSN、CystatinS和CystatinSA的组合。
本发明同时提供了CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA在制备结直肠癌诊断试剂或结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
更具体地说，本发明提供了CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA检测试剂在制备结直肠癌诊断试剂或结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
所述的检测试剂包括检测引物，序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2。
或者，所述的检测试剂包括CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA蛋白抗体。
所述的抗体可以通过商品化的途径获得。
发明同时提供给了一种用于诊断结直肠癌的试剂盒，含有CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA基因检测试剂。
或者，用于诊断结直肠癌的试剂盒含有CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA蛋白检测试剂。
或者，用于诊断结直肠癌的试剂盒含有基因检测试剂和蛋白检测试剂中的一种或多种。
更优选地，上述的诊断试剂或诊断试剂盒含有CystatinSN、CystatinS和CystatinSA基因的组合检测试剂；或CystatinSN、CystatinS和CystatinSA蛋白的组合检测试剂。
发明同时提供了一种用于检测结直肠癌的引物，序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示。
表1CystatinSN,S,SA引物序列
Actin基因检测是RT-PCR检测的参比基因，相对定量时采用的参比基因。
发明人发现，将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA检测引物具有良好的特异性，用于诊断结直肠癌具有很高的准确率，在已有病例中，其准确率达100%。由于CystatinSN、CystatinS和CystatinSA三者具有高度同源性，上述引物针对三者的同源序列涉及，其扩增产物为CystatinSN、CystatinS和CystatinSA三者的混合物。
为了验证本发明的诊断有效性，发明通过以下方法进行验证：（1）肿瘤标记物mRNA及蛋白水平在结直肠癌细胞系中的表达。（2）收集病人及对照组资料及组织样本和临床资料。（3）血清/组织肿瘤标记物mRNA及蛋白水平验证：设计标记物引物，使用引物及抗体，采用qRT-PCR及western blot通过mRNA及蛋白水验证标记物。
本发明人以标准操作程序（SOP）采集符合标准的组织样本，系统收集完整的临床资料等，采用qRT-PCR及western blot方法验证。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择：
（1）经病理学明确诊断的结直肠癌病例；
（2）患者结直肠癌组织样本收集；
（3）正常对照组织样本收集。
2.Real-Time RT-PCR(qRT-PCR)验证差异表达基因核酸表达：
（1）结直肠癌细胞系，癌灶及正常组织样本总RNA提取，随后总RNA逆转录得到cDNA样品；
（2）设计引物；
（3）荧光染料体系进行PCR反应；
（4）检测并比较结直肠癌细胞，患者与正常对照样本中CST1、CST4、CST2mRNA量的变化。
3.western-blot验证标记物蛋白表达：
（1）癌灶及正常组织样本蛋白质提取；
（2）western blot检测并比较结直肠癌患者与正常对照样本中CST1、CST4、CST2蛋白量的变化。
4.统计分析方法：
进行变化差异基因验证时，我们采用student t检验细胞和组织中mRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。
作为对照试验，本发明还选取了肝癌组织样本进行平行试验。结果证实CST仅在结直肠癌样本中大量表达，而在肝癌样本中或正常组织样本中，其表达量非常低或者不表达。
在结直肠组织中，CST在结直肠癌样本中及正常样本中的表达差异非常明显（前者的表达量是后者的10倍以上，甚至15倍以上），可作为可靠的诊断结直肠癌的指标。
附图说明
图1为细胞中qRT-PCR检测CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)mRNA表达差异；
图2为临床样本中qRT-PCR检测CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)mRNA表达差异；*代表P<0.05；
图3为western blot检测CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)蛋白质表达差异（N：正常组织，T：肿瘤组织）。
具体实施方式
实施例一样本收集及处理
临床收集结肠癌癌患者7例及对照组组织样本10例，系统收集病人临床资料。
实施例二结肠癌和正常细胞中mRNA的检测
1.细胞总RNA提取，使用氯仿抽提法提取细胞的总RNA，具体步骤如下：
（1）取中皿的结肠癌，肝癌及正常细胞，加入1ml Trizol试剂对组织进行裂解，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
（2）将上述细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15～30℃下放置5分钟；（3）在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（4℃）离心30分钟；
（4）离心后取上层水相置于新EP管中,按照1份上层水相体积加入1体积异丙醇的量，加入等体积异丙醇，在低温下（-20℃）放置30分钟，12000g（2℃～8℃）离心30分钟；
（5）弃去上清，EP管中加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（4℃）离心15分钟，弃去上清；
（6）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
（7）用RNase-free water溶解RNA沉淀。
（8）取2ul RNA样品，加入Nanodrop2000微量紫外分光光度计测定RNA浓度
2.逆转录获取cDNA样本，按照TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis KitReverTra Ace-α-TM（code No.FSK-100）说明书操作。
在20μl反应体系中加入下列组分：2μg组织总RNA，1μl oligo（dT）20，4μl5×RT buffer、1μl10mM的dNTP Mix和1μl RNase inhibitor（10U/μl）,1μl ReverTra Ace，其余用RNase free H2O补平，然后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42℃反应20min，99℃热处理5min，降温到4℃处理5min，然后瞬时离心后，-40℃保存。
用于合成定量PCR分析所需cDNA一链的总RNA需预先用DNAase I处理。取总RNA20-50μg，10×DNase I Buffer5μl，DNase I（RNase-free，5U/μl）0.5μl，RNase Inhibitor（40U/μl）1μl，用DEPC H2O补平至50μl后37℃反应20-30min；加入50μl的DEPC H2O和100μl的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀；离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中；加入100μl（等量）的氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀；离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中；加入10μl（1/10量）的3M NaOAc（pH5.2）；加入250μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30-60min；离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，干燥后用适量的DEPC H2O溶解。
3.qPCR
荧光定量Real-time PCR采用Kapa公司的Real-time PCR Master Mix kit（SYBR Green）进行，其Real-time PCR反应体系和条件如下：
Figure BDA0000463795120000051
PCR反应程序：
95℃3min→95℃10sec→60℃15sec→72℃20sec→72℃5min共40cycles，每个样品做3个平行重复，另以β-actin为内部参照物。
4.数据处理与分析：两组样本mRNA表达量比值可用方程2-△Ct表示，其中△Ct=靶基因Ct值-actin Ct值，我们将Actin作为参比基因，计算相对表达量。（Actin引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4见表1）
5.两组样本进行t检验，发现实验结果P=0.001<0.05，差异具有统计学意义。
（图2）
实施例三组织中CST1、CST4、CST2mRNA qRT-PCR实验
1.根据细胞结果对CST1、CST4、CST2用qRT-PCR方法进一步验证。
2.组织样本总RNA提取，使用氯仿抽提法提取组织样本的总RNA，具体步骤如下：
（9）取病人冻存结肠组织样品，敲取大小约2mm×2mm×2mm组织块，加入1ml Trizol试剂对组织进行裂解，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解组织；（10）将上述组织的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15-30℃下放置5分钟；
（11）在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（4℃）离心30分钟；
（12）离心后取上层水相置于新EP管中,按照1份上层水相体积加入1体积异丙醇的量，加入等体积异丙醇，在低温下（-20℃）放置30分钟，12000g（2℃～8℃）离心30分钟；
（13）弃去上清，EP管中加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（4℃）离心15分钟，弃去上清；
（14）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
（15）用RNase-free water溶解RNA沉淀。
（16）取2ul RNA样品，加入Nanodrop2000微量紫外分光光度计测定RNA浓度
3.逆转录获取cDNA样本，按照TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis KitReverTra Ace-α-TM（code No.FSK-100）说明书操作。
在20μl反应体系中加入下列组分：2μg组织总RNA，1μl oligo（dT）20，4μl5×RT buffer、1μl10mM的dNTP Mix和1μl RNase inhibitor（10U/μl）,1μl ReverTra Ace，其余用RNase free H2O补平，然后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42℃反应20min，99℃热处理5min，降温到4℃处理5min，然后瞬时离心后，-40℃保存。
用于合成定量PCR分析所需cDNA一链的总RNA需预先用DNAase I处理。取总RNA20-50μg，10×DNase I Buffer5μl，DNase I（RNase-free，5U/μl）0.5μl，RNase Inhibitor（40U/μl）1μl，用DEPC H2O补平至50μl后37℃反应20-30min；加入50μl的DEPC H2O和100μl的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀；离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中；加入100μl（等量）的氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀；离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中；加入10μl（1/10量）的3M NaOAc（pH5.2）；加入250μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30-60min；离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，干燥后用适量的DEPC H2O溶解。
4.qPCR：
荧光定量Real-time PCR采用Kapa公司的Real-time PCR Master Mix kit（SYBR Green）进行，其Real-time PCR反应体系和条件如下：
Figure BDA0000463795120000071
95℃3min→95℃10sec→60℃15sec→72℃20sec→72℃5min共40cycles，每个样品做3个平行重复，另以β-actin为内部参照物。
5.数据处理与分析：两组样本mRNA表达量比值可用方程2-△Ct表示，其中△Ct=靶基因Ct值-actin Ct值，我们将Actin作为参比基因，计算相对表达量。（Actin引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4见表1）
6.两组样本进行t检验，发现实验结果P=0.004<0.05，差异具有统计学意义。（图2）
实施例四组织中CST1、CST4、CST2蛋白western blot实验
1.组织样本蛋白提取
（1）取病人冻存结肠癌结肠组织样品及对照组织样本，敲取大小约2mm×2mm×2mm组织块，加入蛋白提取液400ul，碾磨均匀，倒入离心管，超声粉碎机粉碎1min×3次，静置消化30min，以上操作均在冰上进行。
（2）4℃环境下离心13000rpm，20min。
（3）取上清，分装后保存于-80oC冰箱备用。
（4）样品蛋白定量：
按照上表配好各样品后，用酶标仪检测各样品吸光度，从而算出各样品蛋白浓度。
（5）依据蛋白浓度确定每孔上样量，公式如下：
V总体积=V样品总体积+Vloading buffer
V样品总体积=VddH2O+V样品
V样品=（每孔蛋白质量X孔数）/蛋白浓度
（6）各样本100oC加热5min，分装备用。
2.western blot检测CST1、CST4、CST2蛋白表达
（1）配胶
2）将胶倒入平板灌胶模具内，再轻轻加入1～2ml异丙醇。
3）待下层胶凝固，直接倒弃上层异丙醇，用滤纸吸干液滴。
4）按比例配制浓缩胶，倒入模具，立即插入梳子。
Figure BDA0000463795120000091
（2）上样
1）待胶凝固后，将模具放入电泳槽，于电泳槽内加入电泳缓冲液。
2）空跑5min，加入样品和marker，调整电压至60V，待条带穿过分离胶，调整电压至120V。
（3）转膜
Figure BDA0000463795120000092
2）取胶，放入转膜液30min（上层浓缩胶弃取）
3）取滤纸、NC膜放入转膜液中，浸泡30min。
4）30min后，将各层按以下顺序从下向上铺设：滤纸、NC膜、胶、滤纸、滤纸。稳压12V，转膜时间40-55min，依测定蛋白大小而定。
5）取出NC膜，放入丽春红染色，观察蛋白是否已转至NC膜上。
（4）封闭
1）配制5%脱脂奶封闭液
2）倒掉丽春红，加入5%脱脂奶20ml，室温下轻轻振荡1.5-2小时。
（5）一抗杂交
1）倒弃奶液，PBST10min×3润洗。
2）用5%BSA抗体稀释液稀释抗体
3）取稀释袋，剪片，压边，放入NC膜，加入稀释的抗体，封口。
4）4℃摇床，过夜。
（6）二抗杂交
1）过夜后，剪开杂交袋，倒出一抗稀释液。
2）用PBST润洗NC膜一遍，放于摇床10min×3遍。
3）用5%BSA抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗
4）将NC膜放入新杂交袋，注入二抗，室温下轻轻振荡1h。
5）1h后，用TBS润洗，10min×5遍。
（7）显影
1）在暗室中，将4.5μL H2O2加入ECL并倒入皿中，将NC膜从TBS中取出，用滤纸吸干背面TBS，放入ECL液，即可见荧光发出。
2）将NC膜放入压片盒，盖上塑料薄膜。
3）取胶片，沿压片盒下缘放入，压片。压片时间视信号强弱而定。
4)
Figure BDA0000463795120000101
CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)蛋白的在正常组织和结肠癌患者组织中的表达结果分别如图3所示。由结果可知，相对于参照蛋白（在两类组织中均有表达），CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)在正常组织中不表达，而在结肠癌患者组织中高度表达，两组结果差异非常明显。说明CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)作为结肠癌相关的肿瘤标记物，在诊断结肠癌方面具有非常高的特异性、准确率和应用价值。
总结：
以结肠癌细胞HCT116，肝癌细胞，正常细胞为探索性细胞，qRT-PCR检测标记物基因mRNA，获得了相关结果。根据实验结果，CystatinSN、CystatinS和CystatinSA的mRNA在正常细胞中表达较低，在结肠癌中表达远高于肝癌细胞及正常细胞且差异具有统计学意义。本发明同时探索了CystatinSN、CystatinS和CystatinSA在肝癌细胞中的表达，与结肠癌不同的是，在肝癌细胞中其表达水平较低。
以7例结肠癌病例及10例健康人对照为探索性样本，我们运用中qRT-PCR和western-blot检测mRNA及蛋白的表达，获得了相关结果。正常人标记物mRNA表达较低，癌症患者较正常人标记物的mRNA大幅度增高，且差异具有统计学意义。标记物的蛋白表达在肿瘤患者中明显高于正常患者。

Claims (10)

1.CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA在制备结直肠癌诊断试剂或结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
2.CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA检测试剂在制备结直肠癌诊断试剂或结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的检测试剂包括检测引物，序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的检测试剂包括CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA蛋白抗体。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的抗体为与CystatinSN、CystatinS和CystatinSA蛋白特异性识别的抗体。
6.一种用于诊断结直肠癌的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA基因检测试剂；或者所述试剂盒含有CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA蛋白检测试剂。
7.一种如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有CystatinSN、CystatinS和CystatinSA基因检测试剂；或者所述试剂盒含有CystatinSN、CystatinS和CystatinSA蛋白检测试剂。
8.一种引物，其特征在于序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
9.一种与结直肠癌相关的基因标记物，其特征在于该标记物为CystatinSN、CystatinS和CystatinSA中的一种或多种的组合。
10.如权利要求1所述的基因标记物，其特征在于为结直肠组织基因标记物。
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