CN113564257B - 肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用,属于微生物及肿瘤学领域。本发明中提供了一种新的肿瘤标记物,由20种微生物Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium组成。该标志物可用于诊断试剂盒的制备,用于结直肠癌的辅助诊断,分期及预后生存情况的分析。
Description
技术领域
本发明公开了肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用,属于微生物及肿瘤学领域。
背景技术
结直肠癌(CRC)是全球第三大最常见的癌症,也是癌症相关死亡的第二大原因。及时的诊断是CRC的治疗及预后的关键。
细胞毒性T细胞(CTC)的高浸润与CRC患者的无复发和总生存期改善相关。CTC中趋化因子受体的表达及其配体在肿瘤组织中的表达对于将CTC定位于肿瘤组织至关重要。据报道,具有较高趋化因子受体CXCR3表达的CTC可以通过配体CXCL9、CXCL10和CXCL11募集到肿瘤部位,这些配体被称为IFNγ诱导趋化因子。此外,研究已确定CCL5及其受体(C-C基序)受体5(CCR5)作为T细胞趋化性的另一个关键组23成部分,与CTC浸润和更高的存活率密切相关。因此,影响肿瘤中特定趋化因子的表达的因素也可能与CTC的相关。
现有研究表明,结直肠肿瘤的发生发展与肿瘤微环境和粘膜屏障之间的相互作用密切相关。肠道菌群在其中扮演重要角色,其中的部分机理可能通过其对趋化因子的影响。小鼠模型的体内研究发现,微生物混合物可通过在肿瘤组织中诱导干扰素-γ产生趋化因子等来改变肿瘤组织的抗癌免疫力。此外,从CRC组织中分离的细菌可以在体外上调CRC细胞系中大多数类型的细胞毒性T细胞运输趋化因子(CTTC)的表达。然而,从正常粘膜向恶性病变转变过程中微生物组谱的变化,以及CTTC与CRC肿瘤微环境中确定的微生物群落之间的相关性仍有待阐明。
发明内容
发明人在研究中发现,CRC患者肿瘤黏膜和邻近正常黏膜中有20种微生物存在明显差异,此20种微生物丰度的差异与CTTC之间存在关联。通过这20种微生物的丰度可以为结直肠癌的诊断提供新的方法,并有效地预测肿瘤的临床分期及预后生存情况。
本发明提供了检测或评估结直肠癌的产品,所述产品含有检测微生物组合物丰度的试剂,所述微生物组合物包含菌株Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium。
在一种实施方式中,所述产品包括试剂盒。
在一种实施方式中,所述产品包含引物对505F和806R,
505F:5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 3′,
806R:5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3′。
本发明提供了微生物组合物在评估或诊断结直肠癌中的应用,所述微生物组合物包含微生物Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium。
在一种实施方式中,待检测的样本来自于乙状结肠、横结肠、降结肠、升结肠和/或直肠。
在一种实施方式中,检测待测样品中微生物的相对丰度,检测或诊断结直肠癌。
在一种实施方式中,对待检测样品的16S rRNA的V4区进行扩增,用以测定微生物的相对丰度。
在一种实施方式中,根据下述方式评价样品:
n=1.010+0.310x1+0.046x2-6.878x3-1.904x4+2.833x5-11.871x6-11.826x7+3.161x8+2.270x9+40.189x10+1.204x11-8.842x12-32.158x13-4.558x14+5.706x15-12.465x16-1.711x17+32.927x18-5.785x19-4.988x20;
x1~x20分别为Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium的相对丰度;
当P1>0.406时该样品为肿瘤样品。
在一种实施方式中,利用下述方式对样品进行分期评价;
m=0.252-0.204x1+5.181x2+24.832x3-1.507x4+0.212x5+27.003x6-65.951x7-3.238x8+7.721x9+66.619x10-34.985x11-48.658x12-4.415x13+16.242x14+74.813x15+22.354x16-3.764x17+11.457x18-22.707x19-47.524x20;x1~x20分别为Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium的相对丰度;
P2>0.648诊断为高分期。
本发明提供了一种评估或诊断结直肠癌的方法,所述方法为选取样本,对样本肠粘膜组织提取DNA,利用引物对鉴定微生物丰度,根据微生物的丰度进行判定。
在一种实施方式中,利用引物505F和806R,对16S rRNA的V4区进行扩增,用以测定微生物的相对丰度。
在一种实施方式中,根据下述方式来评估或诊断样品:
n=1.010+0.310x1+0.046x2-6.878x3-1.904x4+2.833x5-11.871x6-11.826x7+3.161x8+2.270x9+40.189x10+1.204x11-8.842x12-32.158x13-4.558x14+5.706x15-12.465x16-1.711x17+32.927x18-5.785x19-4.988x20;
x1~x20分别为Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium的相对丰度;
当P1>0.406时该样品为肿瘤样品。
在一种实施方式中,利用如下方式对样品进行分期评价:
m=0.252-0.204x1+5.181x2+24.832x3-1.507x4+0.212x5+27.003x6-65.951x7-3.238x8+7.721x9+66.619x10-34.985x11-48.658x12-4.415x13+16.242x14+74.813x15+22.354x16-3.764x17+11.457x18-22.707x19-47.524x20。
x1~x20分别为Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium的相对丰度;
P2>0.648诊断为高分期。
本发明的有益效果:
本发明筛选到20种与结直肠癌显著相关的微生物,这20种微生物分别为Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium。通过对这20种微生物丰度的检测,即可对肿瘤进行诊断,同时可进行分期评价。此方法检测方便、精确度高,可有效应用于结直肠癌的评估和诊断。
附图说明
图1为20种微生物在84个病人的结直肠癌组织和正常组织中相对丰度图,p<0.05;
图2为ROC曲线分析显示20种微生物的组合在结直肠癌组织和癌旁正常组织中诊断的表现图;
图3为ROC曲线分析显示20种微生物的组合在预测高分期和低分期病人结直肠癌组织的分组中的表现图;
图4为以20种微生物作为指标建立Cox回归模型图,p<0.05;
图5为肿瘤组织中CTTC和20种微生物的相关性分析热图。
具体实施方式
实施例1:样本收集及处理
临床收集结直肠癌患者84例,分别取其结直肠癌组织(具体肿瘤部位见表1)及正常组织(新鲜肿瘤组织和手术区域内距离肿瘤最远位置(大于5cm)的癌旁正常组织),取得活检组织后立即将一部分装入冷冻管中置于液氮进行冻存,液氮中冻存的组织转移至-80℃冰箱进行长期保存,系统收集病人临床资料。
表1结直肠癌患者情况统计表
患者特征 | 数量 |
患者数量 | 84 |
年龄,岁(中位数,范围) | 64,21-88 |
性别(男/女) | 51/33 |
Dukes’分期(Ⅰ-Ⅱ/Ⅱ-Ⅳ) | 36/48 |
分化程度(高分化/中分化/中低分化/低分化) | 2/43/31/8 |
肿瘤位置(乙状结肠/横结肠/降结肠/升结肠/直肠) | 15/6/13/24/26 |
粘液性(胶质)腺癌(否/是) | 0/84 |
实施例2:肿瘤与微生物丰度间的关系
(1)肿瘤组织和正常组织中微生物丰度的检测
1、肠黏膜组织DNA提取,具体步骤如下:
将冻存于-80℃冰箱的CRC患者的活检组织(实施例1中的提取的样本)取出,放置在生物安全柜中,置于冰上融解,待组织溶解后使用经DEPC水浸泡后高压灭菌的镊子和剪刀剪取部分组织置于平皿上。在平皿上刮取CRC患者肠黏膜后将黏膜放入2ml EP管中,置于冰上保存。进行下一个样品刮取前,将镊子和剪刀置于75%乙醇中浸泡,后在酒精灯上烧灼,待镊子和剪刀冷却后再剪取下一个活检组织。
使用TIANamp Stool DNA试剂盒提取细菌DNA,具体步骤如下:
(1)将500μl缓冲液SA,100μl缓冲液SC,15μl Proteinase K,0.25g的研磨珠加入样本中,并将混合样品进行1min间歇振直至样本充分混匀;
(2)在95℃条件下孵育15min,裂解细菌,该期间进行2-3次震荡;
(3)涡旋15sec,12,000rpm离心3min,转移上清液至新的EP管中,加入10μl的RNaseA,震荡混匀后室温放置5min;
(4)加入200μl缓冲液SH,震荡混匀,置冰上5min;
(5)12,000rpm离心3min;
(6)将上一步所得上清液转移至新的1.5ml离心管,加入等体积缓冲液GFA;
(7)将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CR2放入收集管中;
(8)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CR2放入收集管中;
(9)向吸附柱CR2中加入700μl漂洗液PW,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,吸附柱CR2放入收集管中;
(10)重复操作步骤9;
(11)将吸附柱CR2放回收集管中,12,000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;
(12)将吸附柱CR2转入一个干净的EP管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TB,室温放置2-5min,12,000rpm离心2min,将溶液收集到EP管中。
2、16S rRNA高通量测序
(1)以肠黏膜组织DNA为模板,对16S rRNA基因的V4区进行PCR扩增(引物505F/806R),用Ion S5XL平台测序,
505F:5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 3′(SEQ ID NO.1),
806R:5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3′(SEQ ID NO.2);
(2)使用QIIME2软件2019.1版本进行DNA序列的质量过滤,按操作分类单元(OTU)(99%相似性)对序列进行肠道菌群的物种分类和注释;
(3)使用PyNAST将读数与Greengenes Core参考序列进行比对;
(4)GG分类法用于生成OTU在不同级别(门,阶,科,属和种)的分类分布;
(5)使用FastTree构建系统树,用于估计α多样性(Simpson,Chao1,Shannon等)和β多样性(未加权的UniFrac)。
3、通过提取肠黏膜组织DNA,通过16S rRNA基因高通量测序获得其中所含有的肠肠黏膜菌群中前述20种微生物的相对丰度,将肿瘤组织与正常组织的微生物丰度进行比较,结果如图1所示,20种微生物在肿瘤组织和正常组织中的丰度具有显著差异。
(2)利用上述得到的肿瘤组织和正常组织中微生物丰度的数据,制作ROC曲线:首先使用SPSS软件对20种微生物相对丰度进行logistics回归求得预测值,将预测值设置为检验变量,状态变量设置为0和1,在肿瘤和非肿瘤组织分析中将肿瘤组织组设置为1,使用SPSS软件制作得出ROC曲线,得到图2,ROC曲线下面积AUC为0.850,最接近左上角一点即约登指数最大值处,灵敏度为92.9%,特异度为63.1%。
(3)利用上述得到的肿瘤组织不同时期微生物丰度的数据,制作ROC曲线:将预测值设置为检验变量,状态变量设置为0和1,在分期分析中将高分期组设置为1,使用SPSS软件制作得出ROC曲线,得到图3,如图3所示,ROC曲线下面积AUC为0.846,最接近左上角一点即约登指数最大值处,灵敏度为66.7%,特异度为91.7%。
(4)利用上述得到的肿瘤组织和正常组织中微生物丰度的数据,以20种微生物作为指标建立Cox回归模型:使用SPSS软件对测序结果中20种微生物相对丰度通过Cox回归分析获得风险函数,通过中位数将其分为高风险系数组和低风险系数组,使用Kaplan Meier生存分析,将患者生存时间,状态及因子作为数据导入,状态用0和1表示,患者死亡为1,删失为0,定义事件为1,因子为风险系数,输出生存曲线,得到图4,如图4所示,高风险系数总生存期低于低风险系数组,且差异具有统计学意义(p=0.018<0.05)。
实施例3:结直肠癌和正常组织中mRNA的检测
1、组织总RNA提取,具体步骤如下:
(1)使用组织研磨器对浸泡在Trizol中的组织进行研磨,直至组织与Trizol充分融合,再在EP管中加入800ul Trizol进行混匀,待组织进一步溶解于Trizol后,进行RNA提取;
(2)按照20%的体积在溶有组织的Trizol中加入核酸提取液,盖紧离心管盖,混合至溶液乳化呈乳白色,室温静置5分钟;
(3)按照12000g 4℃条件离心15分钟,从离心机中取出EP管;
(4)接着吸取上清液,并将其转移到新的EP管中(千万不要吸出白色中间层),在吸取出来的上清里加入Trizol体积一半的异丙醇,把EP管进行上下颠倒充分混匀后,在室温下静置10min,12000g 4℃离心10分钟;
(5)丢弃上清液后,加入与Trizol同样体积的75%乙醇,上下颠倒洗涤离心管管壁,7500g 4℃离心5min后小心弃去上清;
(6)在超净工作台中把EP管盖打开,在室温下进行干燥,待酒精完全挥发后加入适量的DEPC水溶解RNA沉淀物。
2、逆转录获取cDNA样本,本研究采用上海碧云天生物技术有限公司的BeyoRTTMIII cDNA合成试剂盒(with gDNA EZeraser)进行反转录反应,具体步骤如下:
(1)去除RNA样品中的基因组DNA。按表2成分于冰上配制反应混合液。37℃孵育2min后立即置于冰上。
表2基因组DNA去除反应混合液配置表
(2)反转录反应:向步骤(1)中的反应液中加入6μl DEPC-treated Water和4μlBeyoRTTM III cDNA第一链合成预混液,42℃孵育30min,80℃孵育10min。
(3)反转录完成的cDNA于-20℃保存。
3、qPCR,采用QIAGEN公司的QuantiNova SYBR Green PCR Kit试剂盒进行qPCR反应,按表3成分于冰上配制反应混合液。按表4设置qPCR反应条件。所有qPCR反应所用引物如表5所示。
表3 qPCR反应试剂配置表
表4 qPCR反应条件
表5 qPCR引物表
4、数据处理:两组样本mRNA表达量比值可用方程2-ΔCt表示,
其中ΔCt=靶基因Ct值-GAPDH Ct值,我们将GAPDH作为参比基因,计算相对表达量。
5、数据分析:分别将肿瘤组织及正常组织中CTTC与20种微生物相关性分析。
结果如图5所示,肿瘤组织中CTTC和20种微生物的相关性分析热图指示20个微生物标记物与CRC组织中募集CTC趋化因子存在相关性。
实施例4:微生物组合物对肿瘤因子的诊断
1、通过对20种微生物相对丰度分别在肿瘤及非肿瘤,高低分期中进行logistics回归分析,得到公式:
(1)肿瘤和非肿瘤诊断:
n=1.010+0.310x1+0.046x2-6.878x3-1.904x4+2.833x5-11.871x6-11.826x7+3.161x8+2.270x9+40.189x10+1.204x11-8.842x12-32.158x13-4.558x14+5.706x15-12.465x16-1.711x17+32.927x18-5.785x19-4.988x20;
截断值:P1=0.406,大于该值诊断为肿瘤;
x1~x20分别为Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium的相对丰度。
(2)分期判断:
m=0.252-0.204x1+5.181x2+24.832x3-1.507x4+0.212x5+27.003x6-65.951x7-3.238x8+7.721x9+66.619x10-34.985x11-48.658x12-4.415x13+16.242x14+74.813x15+22.354x16-3.764x17+11.457x18-22.707x19-47.524x20。
截断值:P2=0.648,大于该值诊断为高分期;
x1~x20分别为Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium的相对丰度。
2、利用上述得到的公式,判断组织中是否含有肿瘤组织或是否为高分期
按照上述方法,分别对多名受试者进行检测,将各微生物的丰度代入上面的公式中,对其进行肿瘤及分期的诊断。结果显示,采用本申请的方法进行检测获得的结果与病理学诊断结果一致。
例1:选取病人1的组织样本,提取肠黏膜组织DNA,检测微生物的相对丰度,并带入公式,求得P1=0.507,大于截断值0.406,判断为肿瘤,与实际情况相符,P2=0.642,小于截断值0.648,诊断为低分期,与实际情况相符。
例2:选取病人2的组织样本,提取肠黏膜组织DNA,检测微生物的相对丰度,并带入公式,求得P1=0.608,大于截断值0.406,判断为肿瘤,与实际情况相符,P2=0.426,小于截断值0.648,诊断为低分期,与实际情况相符。
例3:选取病人3的组织样本,提取肠黏膜组织DNA,检测微生物的相对丰度,并带入公式,求得P1=0.749,大于截断值0.406,判断为肿瘤,与实际情况相符,P2=0.660,大于截断值0.648,诊断为高分期,与实际情况相符。
例4:选取病人4的组织样本,提取肠黏膜组织DNA,检测微生物的相对丰度,并带入公式,求得P1=0.727,大于截断值0.406,判断为肿瘤,与实际情况相符,P2=0.683,大于截断值0.648,诊断为高分期,与实际情况相符。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 肿瘤标记物及其在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用
<130> BAA211142A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgccagcmg ccgcggtaa 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggactachvg ggtwtctaat 20
Claims (4)
1.微生物组合物在制备评估或诊断结直肠癌的产品中的应用,其特征在于,所述微生物组合物包含微生物Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium;
所述应用包括利用引物505F和806R,对16S rRNA的V4区进行扩增,用以测定微生物的相对丰度;
所述应用包括利用以下公式来评估或诊断样品:
n=1.010+0.310x1+0.046x2-6.878x3-1.904x4+2.833x5-11.871x6-11.826x7+3.161x8+2.270x9+40.
189x10+1.204x11-8.842x12-32.158x13-4.558x14+5.706x15-12.465x16-1.711x17+32.927x18-5.785x19-4.988x20;
x1~x20分别为Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium的相对丰度;当P1>0.406时该样品为肿瘤样品。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,待检测的样本来自于乙状结肠、横结肠、降结肠、升结肠和/或直肠。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,选取样本,对样本肠粘膜组织提取DNA,利用引物对鉴定微生物丰度,根据微生物的丰度进行判定。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,利用如下方式对样品进行分期评价:
m=0.252-0.204x1+5.181x2+24.832x3-1.507x4+0.212x5+27.003x6-65.951x7-3.238x8+7.721x9+6
6.619x10-34.985x11-48.658x12-4.415x13+16.242x14+74.813x15+22.354x16-3.764x17+11.457x18-22.707x19-47.524x20。
x1~x20分别为Stenotrophomonas、Allobaculum、Kaistobacter、Phyllobacterium、Rhodoplane、Phenylobacterium、Cytophagaceae、Koribacteraceae、Psychrobacter、Enhydrobacter、Chryseobacterium、Thermomonas、Cloacibacterium、Cetobacterium、Geobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Flavisolibacter、Brochothrix和Symbiobacterium的相对丰度;P2>0.648诊断为高分期。
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GR01 | Patent grant | ||
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