CN112725456A - 一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及其应用和对应的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及其应用和对应的试剂盒，所述肿瘤标志物为lncRNA，定位于第5号染色体NC_000005.10(51372736..51383332,complement)，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为LOC642366。根据LOC642366序列，设计并合成特异性实时荧光定量PCR引物，制备用于结直肠癌的早期诊断、病程进展或者疗效预测的制剂。从上述可知，本发明的一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及其应用和对应的试剂盒，利用实时荧光定量PCR技术，在64例不同分期的结直肠癌临床病例标本中检测LOC642366的表达水平，发现LOC642366在结直肠癌中的表达显著下调，有显著统计学意义（P＜0.01），随着肿瘤进程的发展表达更低；表明LOC642366可以作为结直肠癌肿瘤标志物，可制备用于结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的制剂或试剂盒。

Description

一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及其应用和对应的试剂盒
技术领域
本发明属于肿瘤标志物的分子生物学领域，具体涉及一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及其应用和对应的试剂盒。
背景技术
结直肠癌（colorectal,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，并在全球造成重大的卫生负担。根据美国国家癌症登记处公布的最新数据，在所有癌症中，2018年CRC的发病率(180多万新病例)排名第三，死亡率(86万多死亡)排名第二。在过去十年中，结直肠癌的诊断和治疗都有了很大的提升。但是，结直肠癌的发病机制至今尚未完全明确，许多患者由于错过早期最佳治疗时间以及癌症的转移、复发、耐药等原因，使结直肠癌的发病率和死亡率仍呈上升趋势。
长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，LncRNAs）是一类长度＞200个核苷酸的非编码RNA。lncRNA虽然本身不参与蛋白质的编码，却以RNA的形式参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，激活转录，转录后调控等多种重要过程。越来越多的证据表明，lncRNA在生物过程中起着重要的作用，包括肿瘤的发生发展。最近研究显示，lncRNA与CRC的发生和发展也密不可分，lncRNAs通过上皮-间充质转化，血管的生成、侵袭、迁移和增殖等过程在结直肠癌中发挥作用。lncRNA已被鉴定为致癌基因或者肿瘤抑制基因或预后预测因子，lncRNAs在CRC的临床相关性很大程度上仍然没有探索。目前尚未有LOC642366的相关研究报道。因此找到结直肠癌特异性更高的分子诊断标志物和相关的检测技术尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有诊断技术的不足，提供一种结直肠癌相关的肿瘤标志物。所述肿瘤标志物为lncRNA，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为LOC642366，定位于第5号染色体NC_000005.10 (51372736..51383332, complement)，含有2个外显子，转录本序列长度为6699bp。本发明研究证实LOC642366在结直肠癌组织中表达下调，提示LOC642366可作为结直肠癌的肿瘤标记物，LOC642366有成为结直肠癌诊断和预后判断标志物的潜能，以及有望成为结直肠癌疾病进程和疗效判断的新的靶点。因此，LOC642366可用于制备结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的制剂，还可用于制备结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的试剂盒。
所述结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的试剂盒中包括LOC642366和内参基因GAPDH的特异性引物，所述LOC642366和内参基因GAPDH的特异性引物的上游引物和下游引物，所述LOC642366的特异性上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述LOC642366下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述GAPDH的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述GAPDH的下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。
所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述特异性引物适用于SYBR Green的检测。另外，试剂盒中还包括PCR反应体系和荧光定量PCR参比染料，PCR反应体系中的PCR反应液为实时荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量PCR反应液包括TaKaRa Ex Taq® HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR® Green I 等。
本发明所采取的技术方案是：
一种结直肠癌相关的肿瘤标志物，所述肿瘤标志物为lncRNA，定位于第5号染色体NC_000005.10 (51372736..51383332， complement)，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为LOC642366。可应用于辅助结直肠癌诊断的试剂盒中。
如上所述的肿瘤标志物用于作为结直肠癌相关的肿瘤标志物的用途。
如上所述的肿瘤标志物在制备结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的制剂中的应用。
如上所述的肿瘤标志物在制备结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的试剂盒中的应用。
利用上所述的肿瘤标志物制备得到的结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的试剂盒，所述试剂盒中包括LOC642366和内参基因GAPDH的特异性引物，所述LOC642366和内参基因GAPDH的特异性引物的上游引物和下游引物，所述lnc的特异性上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述LOC642366下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述GAPDH的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述GAPDH的下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。
所述结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的试剂盒包括：
从结直肠癌组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水；
将总RNA逆转录为cDNA所用试剂，包括5 X gDNA buffer、gDNA Eraser、RNaseFree dH2O、PrimeScript RT Enzyme Mix I、RT Primer Mix、5 x PrimeScript Buffer 2(for Real Time)；
将cDNA实时荧光定量PCR所需试剂，包括lnc实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、DEPC水；
lnc特异性PCR引物包括：a、lnc上游引物 b、lnc下游引物；
GAPDH内参特异性PCR引物包括：a、GAPDH上游引物b、GAPDH下游引物。
在利用上述试剂盒检测LOC642366的过程如下：
1）提取组织样本总RNA；
2）制备组织样本cDNA；
3）定量扩增lnc。
本发明的有益效果在于：
本发明的一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及其应用和对应的试剂盒，本发明为结直肠癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学诊断方法，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
附图说明：
图1为LOC642366在结直肠癌中的表达水平图。
图2 LOC642366在结直肠癌不同分期中的表达差异图。
图3为LOC642366和临床病理信息在64例CRC患者标本中的相关性分析表图。
图4为根据图3所绘制的ROC曲线图。
具体实施方式：
所述结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的试剂盒中包括：
从结直肠癌和癌旁组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水。
将总RNA逆转录为cDNA所用试剂：TAKARA RR047A 逆转录试剂盒 ，包括5 X gDNAEraser buffer、gDNA Eraser、RNase Free dH2O、PrimeScript RT Enzyme Mix I、RTPrimer Mix、5 x PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)、EASY Dilution（for RealTime PCR）。
将cDNA进行实时荧光定量PCR所用试剂，包括LOC642366实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参特异性引物、实时荧光定量SYBR染料、DEPC水。
检测过程如下：
结直肠癌和配对的正常结直肠组织总RNA提取：
（1）新鲜或-80℃冻存组织取约20mg左右，加入1ml PBS洗两遍；
（2）将组织转移至加有1ml Trizol的去酶EP管内，于冰上用组织匀浆仪研磨，待研磨充分，静置1-2min；
（3）按Rrizol与氯仿5:1的比例加入氯仿，上下震荡15s，冰上放置15min；
（4）4℃离心，12000rpm，15min，吸取约400ul上层水相至一去酶EP管，避免吸取中间固体层；
（5）加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，切勿剧烈震荡，静置15min；
（6）4℃离心，12000rpm，15min，弃上清；
（7）加入1ml预冷的75%乙醇，轻弹（使片状沉淀悬浮即可）；
（8）4℃离心，12000rpm，离心5min，弃上清；
（9）重复上述两步；
（10）弃上清，吸去多余乙醇，开盖放置30min，加入适量约60ul左右的DEPC水溶解RNA，-80℃冰箱保存；
（11）用1%的琼脂糖凝胶，按1ug的RNA加1ul 6X LoadingBuffer混匀，电泳20敏左右，凝胶电泳成像系统照相保存，分析；
（12）仪器检测RNA浓度和纯度，用DEPC水调零，将RNA样品充分混匀，滴加1ul样品在仪器的检测探头上，放置测量臂，测量RNA的浓度，记录260/280的比值。
2、将总RNA逆转为cDNA
采用TAKARA RR047A 逆转录试剂盒。
配置如下体系：
体系I：
试剂2 5*gDNA Eraser Buffer 2ul *2
试剂1 gDNA Eraser 1ul *2
总RNA 1ug*2
Rnase FreeH2O（高压过水） 补至10ul*2
将体系I混匀，瞬时离心后，放入PCR仪，程序为42℃，2min；室温5min。
体系II：
试剂3 PrimScript RT Enzyme Mix1 1ul *2
试剂5 RT Primer Mix 1ul *2
试剂4 5*PrimScript Buffer 2 4ul *2
试剂6 Rnase FreeH2O（高压过水） 4ul *2
将体系II与上完仪器的体系I混合，瞬时离心后，放入PCR仪，程序为37℃，15min；85℃ 5sec；4℃保存（5min）。
3、实时荧光定量PCR检测LOC642366的表达量
实时荧光定量PCR采用SYBR Premix Ex Taq II (宝生物染料法荧光定量试剂盒)RR820A。
反应体系如下：
名称 体积
SYBR GREEN 5ul
DEPC水 3.6ul
上游引物 0.2ul
下游引物 0.2ul
cDNA 1ul
采用仪器BioRad，实时荧光定量PCR程序为：95℃预变性30s；接45个循环：95℃5s，60℃30s；融解曲线为60-95℃，以0.5℃升高。
本实验数据采用相对定量的分析方法，将GAPDH作为内参基因计算公式为：
△CT=△CTLOC642366-△CTGAPDH
相对表达量=2-△CT
利用软件Graphpad Prism分析实时荧光定量PCR lnc的相对表达量，发现64例结直肠癌组织和配对正常组织相比，发现结直肠癌组织的lnc的表达明显下调，结果如图1和图2所示。
LOC642366表达与病例临床特征的关系：
将64个病例根据目标lncRNA在肠癌与配对正常组织的相对表达值2-△CT从低到高进行排列，根据中位数将样本分为低表达组和高表达组。根据上述分组情况，分析目标lnc高低表达与病例性别、年龄、病灶部位、肿瘤大小、分化级别、有无淋巴结转移、TNM分期等的关系。通过分析发现，肠癌中lnc低表达与结直肠癌与肿瘤大小、侵袭转移密切相关，如图3所示。
根据定量结果绘制ROC曲线，可见曲线下面积为0. 9221（如图4所示），95%可信区间为0.8723 ~0.9719，特异度为89.80%,敏感度为75.51% （P< 0.0001），提示LOC642366作为结直肠癌新型生物学标志物具有重大的潜在价值。
以上结果表明，LOC642366可作辅助结直肠癌诊断的新型分子标志物。为结直肠癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述内容进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述内容进行变更和修改，或利用本发明说明书及附团内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护。

Claims (6)

1. 一种结直肠癌相关的肿瘤标志物，其特征在于：所述肿瘤标志物为lncRNA，定位于第5号染色体NC_000005.10 (51372736..51383332， complement)，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为LOC642366。
2.如权利要求1所述的肿瘤标志物用于作为结直肠癌相关的肿瘤标志物的用途。
3.如权利要求1所述的肿瘤标志物在制备结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的制剂中的应用。
4.如权利要求1所述的肿瘤标志物在制备结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的试剂盒中的应用。
5. 利用如权利要求1所述的肿瘤标志物制备得到的结直肠癌辅助诊断、疗效预测和预后判断的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括LOC642366和内参基因GAPDH的特异性引物，所述LOC642366和内参基因GAPDH的特异性引物的上游引物和下游引物，所述lnc的特异性上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述LOC642366下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述GAPDH的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述GAPDH的下游引物的序列如SEQID NO.5所示。
6.如权利要求1所述的肿瘤标志物用于作为结直肠癌药物靶点的用途。
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