CN111733242A - lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用。lncRNA在肿瘤的发生发展过程中具有重要的生理作用，为了进一步明确lncRNA在卵巢癌中的调节机制，开发具有卵巢癌诊断意义的lncRNAs对于有望提高卵巢癌患者早期诊断概率，提高生存几率。具体的，本发明通过高通量深度测序表达验证证明，lncRNA AK024561可作为诊断卵巢癌的生物标志物，开发了相应的检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高、特异性高、检测方便，满足诊断卵巢癌病人的检测需求，经临床验证诊断准确率高，具有良好的实际应用之价值。

Description

lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用

技术领域

本发明属于诊断标志物技术领域，具体涉及长链非编码RNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是女性最常见的恶性肿瘤之一，也是近年来造成全球肿瘤死亡的第八大常见原因。随着医疗技术的迅猛发展，人们对卵巢癌的认识取得巨大进步，但该病发病率和致死率仍较高，全世界范围内每年125000人因此死亡。目前，卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤首位。卵巢癌具有较强的恶性生物学行为，易发生腹腔种植转移，75％的患者甚至出现了卵巢外的播散病灶。现在采用常规治疗早期卵巢癌5年生存率高达90％，但是晚期卵巢癌即便采取多种积极治疗5年生存率也不超过20％。因此，要提高患者的长期存活率和生活质量，卵巢癌的早期诊断和治疗就显得尤其重要。但早期卵巢癌患者并没有特异性症状和体征。现阶段卵巢癌的诊断大多依靠体格检查、影像学检查、腹腔镜检查、细胞学检查、血液学检查、生物标记物的检测、病理活检等，它们虽各有优势，但或为有创检查，或敏感性或特异性不足，不能满足临床需要。因此，寻找敏感度、特异性高的标志物用于卵巢癌无创性早期诊断是目前临床亟待解决的难题。

lncRNA是一类长度为200个核苷酸的非编码的RNA分子，后来随着研究的深入发现lncRNA虽然不具备蛋白的编码，但其在肿瘤发生发展的过程中起到重要作用。癌组织中异常表达的lncRNAs，如LSINCT5、HOTAIR等，其不仅能区分肿瘤组织和正常组织，而且参与侵袭、迁移等生物学行为，提示lncRNAs可能是一类新的卵巢癌标志物。但目前关于lncRNAs的研究主要集中于卵巢癌组织或细胞，而组织切片属有创检测，很难实现早期诊断，如何利用无创手段对lncRNAs进行分析已成为该领域的研究热点。研究显示人血液循环中存在丰富的lncRNAs，其室温放置24h仍稳定。另外，循环lncRNAs可用RT-PCR等方法检测及定量，表明其具备充当标志物的基本条件。LncRNAs参与调控多种细胞信号传导途径和组织特异性表达，LncRNAs可用于定制特制癌症诊断和靶向治疗的新策略。因此，对lncRNAs进行进一步的探索具有重要的意义，如能发现更加敏感和特异的卵巢癌早期诊断标志物，则可以做到早发现、早诊断、早治疗，显著增加患者的生存机会。

综上所述，目前有必要开发新的lncRNA标志物以用于卵巢癌临床诊断检测。

发明内容

针对背景技术中提出的问题，本发明目的在于探索非编码RNA与卵巢癌的调控关系，进一步筛选具有诊断价值的诊断标志物。为了实现该技术目的，本发明通过高通量深度测序及临床样本表达验证证明，血清样本中的lncRNAAK024561在卵巢癌样本与健康样本中的表达含量差异显著，有望作为卵巢癌诊断的标记物，具有良好的临床检测价值。

针对上述研究结果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供lncRNA AK024561(SEQ ID No.1)作为卵巢癌诊断标志物的应用。

本发明以卵巢癌及健康志愿者血液样本作为研究对象，提取血液中RNA进行高通量分析，分析结果表明lncRNA AK024561在卵巢癌中的表达高于健康对照。依据临床诊断试验结果，lncRNA AK024561作为诊断标志物具有良好的敏感性和特异性及良好的诊断价值。

本发明提供的诊断标志物可满足以血清为检测对象进行检验，对患者创伤小，基于PCR方法进行检测，方法成熟，普适性强。

因此，本发明第二方面，提供lncRNA AK024561检测试剂在制备卵巢癌诊断产品中的应用。

本发明第三方面，提供一种卵巢癌诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中包括如SEQ IDNo.2及SEQ ID No.3所示的序列。

本发明第四方面，提供一种诊断或和/或辅助诊断卵巢癌的方法，所述方法包括对受试对象血浆/血清来源的lncRNA AK024561进行检测。

本发明第五方面，提供lncRNA AK024561作为卵巢癌治疗靶点的应用。

本发明研究结果证实了lncRNA AK024561在卵巢癌患者中的表达含量高于健康人群。基于本领域常规研究思路，采取抑制lncRNA AK024561表达的方式有望实现对卵巢癌的治疗效果。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

(1)本发明经过高通量深度测序及临床样本表达验证，筛选得到lncRNAAK024561能够作为卵巢癌血清lncRNAs的诊断标志物。

(2)本发明为将来研制提高lncRNA AK024561应用提供了依据。

(3)本发明以lncRNA AK024561作为卵巢癌血清lncRNAs检测，开发了相应的检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高、特异性高、检测方便，满足诊断卵巢癌病人的检测需求，经临床验证诊断准确率高。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例中测序结果显示候选lncRNAs分子在对照组(Control)和卵巢癌组(Ovarian cancer)血清中的表达水平热图。

图2为实施例中血清lncRNA AK024561在对照组(Control)、卵巢癌组(Ovariancancer)表达图。

图3为本发明实施例中血清中lncRNA AK024561对卵巢癌诊断ROC分析图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，为了解决如上的技术问题，本发明提出了lncRNAAK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用。

本发明第一方面，提供lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用。

优选的，所述lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用，所述应用方式如下：获取待测对象的病理样本，检测所述病理样本中lncRNA AK024561的表达含量与阈值进行对比从而确定待测对象是否患卵巢癌。

进一步优选的，所述病理样本包括但不限于血液、病理组织及排泄物等；更为优选的，所述病理样本为血液，具体的，为血清或血浆。

进一步优选的，所述检测病理样本中lncRNA AK024561的表达含量包括但不限于通过PCR方法、免疫印迹方法、酶联免疫吸附方法及基因工程方法等。

上述优选的技术方案的一些具体实施方式中，所述lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物应用方式如下：获取待检测对象的血液样本，提取所述血液样本中的RNA，通过PCR方法检测所述血清样本中lncRNA AK024561，通过扩增所述条带的长度判断待检测对象是否患病。

优选的，所述lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用，还包括将lncRNAAK024561的提取、检测试剂应用于制备卵巢癌诊断产品等。

本发明第二方面，提供lncRNA AK024561检测试剂在制备卵巢癌诊断产品中的应用。

优选的，所述lncRNA AK024561检测试剂包括但不限于通过PCR方法、抗原抗体结合方法及基因工程方法检测病理样本中lncRNA AK024561表达情况所需的试剂。

优选的，所述卵巢诊断产品包括但不限于卵巢癌诊断试剂盒、卵巢癌诊断药品或卵巢癌诊断器械。

本发明第三方面，提供一种卵巢癌诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中包括如SEQ IDNo.2及SEQ ID No.3所示的序列。

优选的，所述诊断试剂盒的使用方法如下：以SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示的序列作为引物扩增待测对象的血清中的RNA，能够扩增得到138bp产物(SEQID No.4)的判断为卵巢癌患者。

优选的，所述试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和/或用于配制qPCR反应体系的试剂。

进一步优选的，用于配制反转录反应体系的试剂至少包括反转录缓冲液(MLV-5×buffer)、dNTP混合液、RNA酶蛋白质抑制剂(RNAsin)、反转录酶液(M-MLV)和多聚胸腺嘧啶(OligodT)。

进一步优选的，用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括针对lncRNAAK024561的正向引物液和反向引物液，还包括SYBR Green混合液、无核酸酶纯水。

本发明第四方面，提供一种诊断或和/或辅助诊断卵巢癌的方法，所述方法包括对受试对象血浆/血清来源的lncRNA AK024561进行检测。

本发明第五方面，提供lncRNA AK024561作为卵巢癌治疗靶点的应用。

优选的，lncRNA AK024561作为卵巢癌治疗靶点的应用包括所述lncRNA AK024561抑制剂作为抗卵巢癌活性成分的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

实施例1

一、实验对象纳入与排除标准：

(一)病例来源

全部病例均来源于2017年1月至2017年12月山东大学齐鲁医院住院病人。正常对照组血样均来自于山东大学齐鲁医院健康查体者，为无心、脑、肺、肝、肾疾病和癌症疾病，无已知影响研究指标疾病。

(二)诊断标准

卵巢癌诊断根据组织病理学检查，分期根据国际妇产科联盟(FIGO)分期2013版。

(三)病例排除标准

(1)卵巢外肿瘤；(2)病理、病历资料未完整登记者；(3)伴凝血功能障碍、传染性疾病和感染性疾病者；(4)妊娠期、哺乳期女性。排除标准：不愿参与本研究。

(四)健康对照纳入标准

纳入标准：(1)体格检查正常；(2)血、尿、便、血沉、肝功能、肾功能、电解质、血糖、血脂指标正常(3)心电图、腹部超声、胸部X片未见异常。

二、高通量检测

1、RNA质控

2、RNA文库制备及测序

根据供应商说明，使用Ribo-Zero rRNA Removal Kits(Illumina，美国)移除总RNA中的rRNAs。使用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(Illumina，美国)预处理RNA，构建测序文库。使用BioAnalyzer 2100仪器(Agilent Technologies，美国)进行文库质控和定量。根据Illumina测序说明，将10pM文库变性为单链DNA分子，在Illuminaflowcell上捕获，原位扩增为簇(cluster)，并在Illumina HiSeq测序仪上采用双端模式(PE mode)进行150cycle测序。

Illumina平台是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的测序方法。由于可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列，称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储。利用hisat2将Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。一个基因表达水平的直接体现就是其转录本的丰度情况，转录本丰度程度越高，则基因表达水平越高。在转录组测序分析中，可以通过定位到转录本外显子区的测序序列(reads)的计数来估计基因的表达水平。转录本表达量的计算使用FPKM法(Fragments Per kb PerMillion Reads)，是每百万fragments中来自某一转录本每千碱基长度的fragments数目。FPKM同时考虑了测序深度和转录本长度对fragments计数的影响，是目前最为常用的转录本表达水平估算方法。FPKM计算公式如下：

3、数据分析

经过Illumina HiSeq 4000测序仪测序，收获双端reads。利用Q30进行质控，使用cutadapt(v1.9.3)软件去接头，去低质量reads，获得高质量reads。

LncRNA：使用hisat2软件(v2.0.4)，将高质量reads比对到人类参考基因组(UCSCHG19)上。然后，在gtf基因注释文件指导下，使用cuffdiff软件(cufflinks软件套件的一部分)获得转录本水平LncRNA的FPKM(Fragments per kilobase of exon per millionfragments mapped)值，作为LncRNA的表达谱，并计算两个/组样品间的倍数变化和p-value以筛选差异表达LncRNA。

4、结果

根据测序结果，设定标准(在样本中表达均稳定表达，两组间差异倍数5，P<0.05)，筛选出5个lncRNAs分子(SCARNA10、Linc00910、CTD-3051D23.4、RP11-403B2.7、AK024561)见图1。

图1测序结果显示候选lncRNAs分子在卵巢癌组(Ovarian cancer)和对照组(Control)血清中的表达水平。

三、qRT-PCR验证lncRNAs表达

1、收集卵巢患者81例及健康人静脉血40例，提取血清RNA

提取步骤根据miRNeasy-SerumPlasma-217184试剂盒说明书进行，血清标本为200ul。

2、设计上述lncRNAs的特异性引物

3、lncRNAs的逆转录及PCR

lncRNAs的逆转录及PCR过程分别根据试剂盒进行，逆转录(mRNA检测-QP006+QP001)。计算方法为2^-ΔΔCt方法。扩增条件为95℃10min,40个循环(95℃15s,62℃20s,72℃10s)。

4、验证结果

去除表达水平较低(Ct值大于35)的lncRNAs分子，分子SCARNA10、Linc00910、RP11-403B2.7在两组间表达无差异。

LncRNA AK024561表达

F：5'-CTGACCTTTCCCCCTCTTGG-3'(SEQ ID No.2)

5'-AAGGCATCCACAGCCTTCTC-3'(SEQ ID No.3)。产物大小为138bp。扩增条件同lncRNA AK024561。

结果显示lncRNA AK024561在卵巢癌中的表达高于健康对照(图2)，对卵巢癌具有诊断价值(图3)，AUC为0.942(95％CI:0.885-0.977)，敏感性为93.8％(95％CI:86.2％-97.9％)，特异性为80.0％(95％CI:64.3％-90.9％)。

sanger测序，结果如下：

CTGACCTTTCCCCCTCTTGGCAGGACTGGCCCCCAGGGCTTTGCTCTTGCCATCCCCACTGCTGCCAGCTGGGCCTGCCAGGGTTACCATAGAATTGGGCTGGTAAGTTCCCGGACCTGAGAAGGCTGTGGATGCCTT(SEQ IDNo.4)

6.统计学分析：

采用SPSS 25.0软件(SPSS Inc.,USA)。连续变量采用中位数(Median)和平均值±标准差(x±SD)表示；两组比较采用t检验或Mann-Whitney U检验。通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线和计算相应的曲线下面积(AUC)来判断诊断能力。最佳cutoff值选取为灵敏度和特异性之和最大所对应的值。P<0.05(双侧)为有统计学差异。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学齐鲁医院

<120> lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用

<130> 2010

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttttgagac gaagtcttgc tctgtcgcca ggctggagtg cagtggcgcg atcttggctc 60

actgcaagct ccgcctcccg ggttcacgcc cttctcctgc ctcagcctcc tgagtagctg 120

ggactacagg tgcctgccac cacgcccggc taattttttg tatttttaat agagacggga 180

tttcaccgtg ttaggatggt ctcgatctcc tgacctcgtg atccacccac ctcggcctcc 240

catagtgctg agattatagg cctgagacac ctcgcccggc cccaatctgg tagactttcg 300

aaatccttct ttccttgttg tatcatacag ctcgtgacct tggttccaca atggcccatg 360

ctctactttc ctgttttcct ccatgcttct ctgctgccta cagcagcaag aaaaccaaac 420

ccctccctga atcagggtac ctgctccata tcttctggac cagttctcca aactggctgg 480

gcattgggaa cagtggggaa gttgttgaaa cactcagata cgtgcagatt ctgattcact 540

aggttaccac caaatatgcg tggtgacatg gcacacttta gctggacgaa ctcacctcca 600

actggaagat gtaaggaaca actcattttt cctttatctc actttgcgtg tcttctgagg 660

accccatttt cttctatgta ctctaagtca ctggacataa tcttagtctt cttgctcttc 720

tgatgactaa ctcttggctt tccctagagc ctccagcatg ccaaatcaca ctggttctca 780

aaaaactttc ttcagctctc atgttcctcc ctcttccatc tcttttctct gaacttgaag 840

cagctattcc ttctcctctc ccctgcatgc cctccagacc tctcttccaa ccaggtgcac 900

tggaaggccc ctctgggttc ctgtctctgc actatcctca gtgtggtcac atcctctccc 960

tgccttgaca ttcctgctgg ccttggttgc tacagtaata tcatctcctg gtttgcctcc 1020

aaccgcataa aaaatgtagt gagagctggt tgcctgcctg ggctccagcc ctggcctgac 1080

ctttccccct cttggcagga ctggccccca gggctttgct cttgccatcc ccactgctgc 1140

cagctgggcc tgccagggtt accatagaat tgggctggta agttcccgga cctgagaagg 1200

ctgtggatgc cttctggcct ccgatcccac tttggagcca gctcagctgc a 1251

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgacctttc cccctcttgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaggcatcca cagccttctc 20

<210> 4

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgacctttc cccctcttgg caggactggc ccccagggct ttgctcttgc catccccact 60

gctgccagct gggcctgcca gggttaccat agaattgggc tggtaagttc ccggacctga 120

gaaggctgtg gatgcctt 138

Claims (10)

1.lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用。

2.如权利要求1所述lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用，其特征在于，所述应用方式如下：获取待测对象的病理样本，检测所述病理样本中lncRNA AK024561的表达含量与阈值进行对比从而确定待测对象是否患卵巢癌。

3.如权利要求2所述lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用，其特征在于，所述病理样本包括但不限于血液、病理组织及排泄物等；优选的，所述病理样本为血液，具体的，为血清或血浆；

或所述检测病理样本中lncRNA AK024561的表达含量包括但不限于通过PCR方法、免疫印迹方法、酶联免疫吸附方法及基因工程方法。

4.如权利要求3所述lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用，其特征在于，所述lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物应用方式如下：获取待检测对象的血液样本，提取所述血液样本中的RNA，通过PCR方法检测所述血清样本中lncRNA AK024561，通过扩增所述条带的长度判断待检测对象是否患病。

5.如权利要求1所述lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用，其特征在于，所述lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用，还包括将lncRNA AK024561的提取、检测试剂应用于制备卵巢癌诊断产品。

6.lncRNA AK024561检测试剂在制备卵巢癌诊断产品中的应用。

7.如权利要求6所述lncRNA AK024561检测试剂在制备卵巢癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述lncRNA AK024561检测试剂包括但不限于通过PCR方法、抗原抗体结合方法及基因工程方法检测病理样本中lncRNA AK024561表达情况所需的试剂；

或所述卵巢诊断产品包括但不限于卵巢癌诊断试剂盒、卵巢癌诊断药品或卵巢癌诊断器械。

8.一种卵巢癌诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒中包括如SEQ ID No.2及SEQID No.3所示的序列；

优选的，所述诊断试剂盒的使用方法如下：以SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示的序列作为引物扩增待测对象的血清中的RNA，能够扩增得到138bp产物的判断为卵巢癌患者；

优选的，所述试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和/或用于配制qPCR反应体系的试剂。

9.一种诊断或和/或辅助诊断卵巢癌的方法，其特征在于，所述方法包括对受试对象血浆/血清来源的lncRNA AK024561进行检测。

10.lncRNA AK024561作为卵巢癌治疗靶点的应用；

优选的，lncRNA AK024561作为卵巢癌治疗靶点的应用包括所述lncRNA AK024561抑制剂作为抗卵巢癌活性成分的应用。

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