CN112442535A - 原发性肺腺癌分子分型及生存风险基因群及诊断产品和应用 - Google Patents

原发性肺腺癌分子分型及生存风险基因群及诊断产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一组可以对原发性肺腺癌分子分型及生存风险进行评估的基因群；公开了由检测这些基因群的基因表达水平的试剂在制备用于评估原发性肺腺癌分子分型及生存风险的体外诊断产品中的应用；所述体外诊断产品包括二代测序(NGS)检测试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒、基因芯片和蛋白质阵列。本发明还公开了利用所述检测试剂盒对原发性肺腺癌分子分型及生存风险进行评估的方法。本发明所述方法对原发性肺腺癌亚型分型及生存风险的评估具有较高的准确性。

Description

原发性肺腺癌分子分型及生存风险基因群及诊断产品和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及肺腺癌亚型分型及评估生存风险基因群及其体外诊断产品和应用。
背景技术
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。肺癌的发病率和死亡率在我国恶性肿瘤中均居于首位。根据中国医学科学院肿瘤医院、国家癌症中心、全国肿瘤登记中心在《CA：ACancer Journal for Clinicians》(影响因子144.8)发表的2015年中国癌症统计数据显示，我国2015年肺癌新发病例为73.3万，死亡病例为61.0万。同期美国的发病率和死亡率分别为22.1万和15.8万(https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics)。两者之间发病率相似，但死亡率存在显著差异，显示肺癌诊治水平两者优一定差距。尽管近年来肺癌的诊断和治疗水平不断提高，但其总体生存情况仍然较差，5年生存率在美国为15％，而在发展中国家为8.9％。肺癌存活率除了取决于被诊断出肺癌时疾病所处的阶段外，还因性别以及肿瘤大小各异。对于晚期、丧失手术机会的患者，尽管部分患者可获益于靶向治疗，但总体治疗效果不理想，5年生存率极低。但对于早期、手术切除率较高的非小细胞肺癌，其5年的成活率可达49-70％。对于这部分患者，如何判断手术后是否需要预防性化疗，以及如果需要化疗，如何做到更加精准、有效，进而进一步提升这部分患者的5年、10年生存率，是本发明的主要目标之一。同时对于不可手术的晚期肺癌患者，目前有多种治疗方法，包括化疗、靶向及针对免疫检查点的免疫治疗。然而，同样的治疗方案，不同的患者治疗有效率差异极大。如何识别治疗可获益患者，提高治疗有效率，同时降低无效治疗比例，减少无效治疗所造成的毒副作用和医疗资源的浪费，是本发明的另一主要目标。
目前，肺癌治疗最常用的指征是病理分型、临床分期。然而，即使是相同病理组织类型、同一临床分期的患者，采用同样的治疗手段，其预后也各不相同。个体在对于药物的反应、药物毒副作用及癌症的结局等方面也存在很大差异，提示不同的肺癌患者个体对治疗的敏感性和发生毒副反应的情况不同。肺癌的发生发展侵袭和转移是由多因素多阶段综合作用演变的过程，因此，如何选择稳定的生物标志物预测病人的预后和毒副反应的发生，进行治疗效果和死亡危险度的评价，并据此进行个体化治疗的研究已成为近年来的热门课题。随着新的预后因素的发现，同时尽可能的将相关的因素联合起来分析，建立一个预测肺癌预后的准确模型，为制定确实有效的临床治疗方案提供准确的信息，以达到提高患者的生命质量的目的。近年来，基于基因表达谱和分子生物学特征为基础提出的肿瘤分子生物学分型，能较好地反映肿瘤的生物学行为，具有重要的临床治疗指导意义。对预测肺癌预后的相关基因，需要进一步地筛选，并合并其他方法进行验证试验，然后构建一个预测肺癌成活率的数学模型。目前，世界上较为推广的新方法是，利用组织芯片和免疫组织化学技术对肺癌可能影响预后的相关基因进行检测，结合病人临床病理特征和预后资料，用统计学方法筛选构建肺癌个体化预后预测模型，并进行验证。肺癌病人手术后，可借此预测肺癌的5年或更远期的生存情况。属于复发风险低的就不必再做放疗化疗，减少不良反应的发生和治疗的经济负担；复发风险高的病人则要及时辅做化疗、放疗或者生物治疗，以期收到最大临床获益。对于无法手术的晚期患者，基于表达谱的分子诊断则可帮助识别一种治疗方案可获益群体，提高治疗效率，避免无效治疗。有研究结果显示，结合了基因组学的预后模型，比单一使用临床参数可以对肺癌患者更好地进行风险分层和预后评估。
肺癌主要分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)两大类。后者包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，占全部肺癌的80％以上。而其中又以腺癌为主，其发病分子机制最为复杂，靶向治疗也相对丰富。本项目的研究结果显示，基于基因表达的预测模型可以很好地预测肺腺癌患者的生存概率并有效评估肿瘤的增殖和免疫状况，预计对临床治疗有重要指导意义。本发明拟通过分析肺腺癌的基因表达数据，结合临床生存资料，建立一套肺腺癌的基因测试组合，进行分子分型并预测复发风险，指导临床治疗。最终目标为创建具有自主知识产权的肺癌分子分型诊断产品。
发明内容
在一方面，本发明涉及一种用于肺腺癌分子分型和/或评估其生存风险的基因群(在本文中又称为为普瑞泰(Precitype))，其包括186个基因，即180个分子分型及生存风险评估相关基因以及6个看家基因，其中：
(1)69个增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、DLGAP5、KPNA2、CCNA2、RRM2、HMMR、KIF20A、FOXM1、MKI67、KIF14、TK1、HJURP、TPX2、EXO1、KIF11、NEK2、KIF23、CDCA3、CDK1、SPAG5、KIF4A、GTSE1、CDKN3、CDC25C、PRR11、CCNB2、MAD2L1、PKMYT1、CENPE、ASPM、CENPF、BUB1、NDC80、NUSAP1、CEP55、NCAPG、BIRC5、ZWINT、TTK、ESPL1、DEPDC1、MELK、CDC20、CDC6、AURKA、NEIL3、CDT1、KIF2C、KIFC1、NCAPH、KIF18B、AURKB、UBE2C、TYMS、TOP2A、PBK、CDC45、CDCA8、CENPA、MYBL2、SKA1、MCM10、TRIP13、TROAP、POLQ、GINS1和RAD54L；
(2)73个免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FGL2、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、LCP1、SPIB、CD53、CD3E、SLCO2B1、MS4A6A、CYBB、CD4、SH2D1A、TFEC、LYZ、ITGAM、TLR8、CSF1R、CXCL13、GPNMB、CCR5、HK3、CMKLR1、IL2RG、TYROBP、HCK、ITGB2、LAPTM5、SIGLEC1、AOAH、C3AR1、MSR1、IL2RA、CCL5、ADAMDEC1、LILRB4、CXCL11、FPR3、SELL、CXCL10、UBD、C1QB、PDCD1LG2、C1QA、SLAMF8、VSIG4、CD163、LAIR1、SLAMF7和MS4A4A；
(3)38个细胞间质相关基因：LOXL2、SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2、COL5A1、COL11A1、COL5A2、COL1A2、MXRA5、THBS2、INHBA、VCAN、ADAMTS12、GREM1、COL3A1、SULF1、ADAMTS2、PRRX1、COL15A1、SPARC、THY1、FAP、DIO2、FN1、COL6A3、FBN1、SYNDIG1、AEBP1、LRRC15、CILP、ISLR、GAS1、COL10A1、ASPN、MMP2和EPYC；
所述看家基因包括GAPDH、GUSB、MRPL19、PSMC4、SF3A1、TFRC。
在一实施方案中，本发明的基因群中的基因的信息还参见表1。
在另一方面，本发明涉及一种用于肺腺癌分子分型和/或评估其生存风险的基因群，其包括70个分子分型及生存风险评估相关基因以及6个看家基因，其中，所述70个分子分型及生存风险评估相关基因包括：
(1)增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、DLGAP5、KPNA2、CCNA2、RRM2、FOXM1、MKI67、KIF14、HJURP、TPX2、NEK2、CDK1、CDKN3、ASPM、CEP55、BIRC5、MELK、CDC20、TYMS、AURKA和TOP2A；
(2)免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、SPIB、CD53、CD4和LYZ；
(3)细胞间质相关基因：SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2、COL5A1、COL11A1、COL5A2、COL1A2、MXRA5、THBS2、INHBA、VCAN、ADAMTS12、GREM1、COL3A1和SULF1；
所述看家基因包括GAPDH、GUSB、MRPL19、PSMC4、SF3A1、TFRC。
在又一方面，本发明涉及一种用于肺腺癌分子分型和/或评估其生存风险的基因群，其包括24个分子分型及生存风险评估相关基因以及1个看家基因，其中，所述24个分子分型及生存风险评估相关基因包括：
(1)增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、MKI67、TPX2、MELK、CDC20、TYMS和TOP2A；
(2)免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R和CD4；
(3)细胞间质相关基因：SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2和COL5A1；
所述看家基因包括ACTB。
在另一方面，本发明涉及所述基因群在进行肺腺癌分子分型和/或评估生存风险中的应用。
在又一方面，本发明还涉及所述基因群在制备对肺癌进行分子分型和/或评估生存风险的诊断产品中的应用。
在进一步的方面，本发明还涉及一种对肺癌进行分子分型和/或评估生存风险的诊断产品，其包含检测本发明的基因群中基因的表达水平的相关试剂。在优选的实施方案中，所述诊断产品为体外诊断产品的形式，优选诊断试剂盒的形式。在进一步优选的实施方案中，所述诊断产品还包括总RNA抽提试剂、逆转录试剂、二代测序试剂和/或定量PCR试剂。
在进一步的实施方案中，所述试剂为探针或引物。
在本发明的一优选实施方案中，所述肺癌分子亚型包括LAD1型、LAD2型、LAD3型、LAD4型、LAD5型和混合型。
附图说明
图1表示根据肺癌组织中基因表达水平，将肺腺癌分为LAD1型、LAD2型、LAD3型、LAD4型、LAD5型和混合型(Mixed)。
图2表示肺腺癌每种亚型生存风险有不同。其中，LAD1亚型5年生存率较好，LAD2亚型及LAD4亚型5年生存率相对较差，LAD3亚型和LAD5亚型预后中等。
图3表示增殖指数对肺腺癌预后有重要影响。根据增殖指数可将肺腺癌分为增殖快和增殖慢两组。其中增殖快组5年生存率低。
图4表示免疫指数对肺腺癌的预后有重要影响，其免疫功能强，则预后相对好。
图5表示根据亚型、增殖指数、免疫指数所计算出的肺腺癌生存指数。分为三个风险组，低风险(0-30)、中等风险(31-70)和高风险(71-100)。
具体实施方式
一般定义和术语
以下将对本发明进一步详细说明，应理解，所述用语旨在描述目的，而非限制本发明。
除非另有说明，本文使用的所述技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同的含义。若存在矛盾，则以本申请提供的定义为准。当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及优选的数值下限的形式表述某个量、浓度或其他值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另有说明，本文所列出的数值范围旨在包括范围的端点和该范围内的所有整数和分数(小数)。
术语“约”、“大约”当与数值变量并用时，通常指该变量的数值和该变量的所有数值在实验误差内(例如对于平均值95％的置信区间内)或在指定数值的±10％内，或更宽范围内。
术语“任选”或“任选存在”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，当某个基团描述为任选地被取代时，其可以是未被取代的，也可以是被取代的，例如被一个或多个独立地选自本文所述的那些取代基取代。本领域技术人员应当理解，任选还涵盖取代基的种类和数目可以任意选择和组合的含义，只要形成的化合物是稳定的。
表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由…组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由…组成”和“由…组成”。
本文所述的基因表达水平的检测可以例如通过检测RNA转录物来实现，也可以例如通过蛋白组学方法检测蛋白表达水平来实现。术语“RNA转录物”是指总RNA，即编码或者非编码RNA，包括直接来自于组织或外周血样本中，也包括间接来自于细胞裂解后的组织或血液样本中的RNA。总RNA包含tRNA、mRNA和rRNA，其中，mRNA包括目标基因转录的mRNA，也包括来自于其他非目标基因的mRNA。
在本文中，RNA转录物可以例如通过杂交、扩增或者测序的方法来检测和量化。比如，将RNA转录物与探针或者引物杂交。
术语“杂交是指在适当条件下，两个核酸片段通过稳定且特异的氢键结合，形成双螺旋复合物的过程。
术语“扩增引物”或“引物”，是指包含5～100个核苷酸的核酸片段，优选地，包含能起始酶促反应(如，酶促扩增反应)的15～30个核苷酸。
术语“(杂交)探针”是指包括至少5个核苷酸的核酸序列，比如，包含5～100个核苷酸，其能在指定条件下与目标基因的表达产物或者该表达产物的扩增产物杂交形成复合物。杂交探针上还可以包括用于检测的标志物。
术语“生存风险”是指通过这样的指标体现的风险：处于不同风险组患者的5年生存概率。生存概率大，表示生存风险低，反之，生存概率小，表示生存风险高。
本发明的基因群
针对本领域中的临床需求和产品不足，本发明提供了一组基因群，其在本文中又称为普瑞泰(Precitype)。该基因群包括186个基因，即180个分子分型及生存风险评估相关基因以及6个看家基因。
所述180个分子分型及生存风险评估相关基因包括：
(1)增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、DLGAP5、KPNA2、CCNA2、RRM2、HMMR、KIF20A、FOXM1、MKI67、KIF14、TK1、HJURP、TPX2、EXO1、KIF11、NEK2、KIF23、CDCA3、CDK1、SPAG5、KIF4A、GTSE1、CDKN3、CDC25C、PRR11、CCNB2、MAD2L1、PKMYT1、CENPE、ASPM、CENPF、BUB1、NDC80、NUSAP1、CEP55、NCAPG、BIRC5、ZWINT、TTK、ESPL1、DEPDC1、MELK、CDC20、CDC6、AURKA、NEIL3、CDT1、KIF2C、KIFC1、NCAPH、KIF18B、AURKB、UBE2C、TYMS、TOP2A、PBK、CDC45、CDCA8、CENPA、MYBL2、SKA1、MCM10、TRIP13、TROAP、POLQ、GINS1和RAD54L；
(2)免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FGL2、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、LCP1、SPIB、CD53、CD3E、SLCO2B1、MS4A6A、CYBB、CD4、SH2D1A、TFEC、LYZ、ITGAM、TLR8、CSF1R、CXCL13、GPNMB、CCR5、HK3、CMKLR1、IL2RG、TYROBP、HCK、ITGB2、LAPTM5、SIGLEC1、AOAH、C3AR1、MSR1、IL2RA、CCL5、ADAMDEC1、LILRB4、CXCL11、FPR3、SELL、CXCL10、UBD、C1QB、PDCD1LG2、C1QA、SLAMF8、VSIG4、CD163、LAIR1、SLAMF7和MS4A4A；
(3)细胞间质相关基因：LOXL2、SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2、COL5A1、COL11A1、COL5A2、COL1A2、MXRA5、THBS2、INHBA、VCAN、ADAMTS12、GREM1、COL3A1、SULF1、ADAMTS2、PRRX1、COL15A1、SPARC、THY1、FAP、DIO2、FN1、COL6A3、FBN1、SYNDIG1、AEBP1、LRRC15、CILP、ISLR、GAS1、COL10A1、ASPN、MMP2和EPYC；
所述看家基因包括GAPDH、GUSB、MRPL19、PSMC4、SF3A1和TFRC。
在一实施方案中，所述基因群如表1所示。
表1肺腺癌分子分型和/或生存风险的基因群
Figure BDA0002181293020000061
Figure BDA0002181293020000071
Figure BDA0002181293020000081
Figure BDA0002181293020000091
Figure BDA0002181293020000101
Figure BDA0002181293020000111
Figure BDA0002181293020000121
在一具体的实施方案中，本发明的基因群可用于肺腺癌分子分型(亚型分型)和/或评估其生存风险。
本发明的诊断产品
本发明涉及一种对肺腺癌进行分子分型和/或评估其生存风险的诊断产品，其包含检测本发明的基因群中基因的表达水平的相关试剂。
在一实施方案中，诊断产品包含的本发明的基因群如表1所示。
在一实施方案中，所述诊断产品为基于二代测序(NGS)的诊断产品。在另一实施方案中，诊断产品包含的本发明的基因群包括76个基因，即70个分子分型及生存风险评估相关基因以及6个看家基因，其中
所述70个分子分型及生存风险评估相关基因包括：
(1)增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、DLGAP5、KPNA2、CCNA2、RRM2、FOXM1、MKI67、KIF14、HJURP、TPX2、NEK2、CDK1、CDKN3、ASPM、CEP55、BIRC5、MELK、CDC20、TYMS、AURKA和TOP2A；
(2)免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、SPIB、CD53、CD4和LYZ；
(3)细胞间质相关基因：SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2、COL5A1、COL11A1、COL5A2、COL1A2、MXRA5、THBS2、INHBA、VCAN、ADAMTS12、GREM1、COL3A1和SULF1；
所述看家基因包括GAPDH、GUSB、MRPL19、PSMC4、SF3A1、TFRC。
在又一实施方案中，所述诊断产品为基于荧光定量PCR的诊断产品。在另一实施方案中，诊断产品包含的本发明的基因群包括25个基因，即24个分子分型及生存风险评估相关基因以及1个看家基因，其中
所述24个分子分型及生存风险评估相关基因包括：
(1)增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、MKI67、TPX2、MELK、CDC20、TYMS和TOP2A；
(2)免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R和CD4；
(3)细胞间质相关基因：SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2和COL5A1；
所述看家基因包括ACTB。
在一实施方案中，所述诊断产品为体外诊断产品。在一具体的实施方案中，所述诊断产品为诊断试剂盒。
在一实施方案中，所述诊断产品用于肺腺癌亚型分型和/或其生存风险评估。
在一实施方案中，所述试剂为检测所述基因转录的RNA，特别是mRNA的量的试剂。在又一实施方案中，所述试剂为检测与所述mRNA互补的cDNA的量的试剂。
在一优选的实施方案中，所述诊断产品还包括总RNA抽提试剂、逆转录试剂、二代测序试剂和/或定量PCR试剂。
所述总RNA抽提试剂可以为本领域常规的总RNA抽提试剂。其实例包括但不限于RNA storm CD201、Qiagen 73504、Invitrogen和ABI AM1975。
所述逆转录试剂可以为本领域常规的逆转录试剂，并且优选地包括dNTP溶液和/或RNA逆转录酶。逆转录试剂的实例包括但不限于NEB M0368L、Thermo K1622、ABI4366596。
所述二代测序试剂可以为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。二代测序试剂可以为市售产品，其实例包括但不限于Illumina公司
Figure BDA0002181293020000131
Reagent Kit v3(150cycle)(MS-102-3001)、
Figure BDA0002181293020000133
Targeted RNA Index KitA-96Indices(384Samples)(RT-402-1001)。二代测序为本领域常规的二代测序，例如为靶向RNA-seq技术。因此，二代测序试剂还可以包括可供构建靶向RNA-seq的文库Illumina定制的试剂，例如
Figure BDA0002181293020000132
Targeted RNA Custom Panel Kit(96Samples)(RT-102-1001)。
在优选的实施方案中，所述试剂为探针或引物。在可选的实施方案中，所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂，优选地，所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。
在优选的实施方案中，所述试剂为引物。在一实施方案中，引物为高特异性的合成寡聚核苷酸片段，只要能与本发明的基因群中的基因部分序列互补，并扩增出其中的基因即可。引物可以是人工合成的。更优选地，所述引物的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.152所示。引物的具体方案可以参见表2所示。
所述定量PCR试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行定量PCR的要求即可。所述定量PCR试剂较佳地为市售可得。所述定量PCR为本领域常规的定量PCR，较佳地，为Taqman-实时荧光定量PCR技术。所述PCR试剂较佳地还包括可供构建定量PCR的文库的试剂。检测平台为ABI7500实时荧光定量PCR仪或罗氏
Figure BDA0002181293020000141
480II实时荧光定量PCR仪或其他所有可进行实时荧光定量检测的PCR仪。
在优选的实施方案中，所述试剂为探针或引物。在可选的实施方案中，所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂，优选地，所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。
在优选的实施方案中，所述试剂为引物和探针。在一实施方案中，引物为高特异性的合成寡聚核苷酸片段，只要能与本发明的基因群中的基因部分序列互补，并扩增出其中的基因即可。引物可以是人工合成的。更优选地，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.153-SEQ ID NO.227所示。引物的具体方案可以参见表3所示。
本发明的诊断产品(优选试剂盒的形式)还优选地包括从受试者对象提取检测样本的器械；例如从受试者体内提取组织或血液的器械，优选任何能用于取血的釆血针、注射器等。所述受试者对象为哺乳动物，优选为人，特别是患有肺腺癌的患者。
本发明的方法和应用
在又一方面，本发明还涉及一种用于确定受试者对象的肺腺癌分子分型和/或生存风险的方法，所述方法包括
(1)提供受试者对象的样本，
(2)测定所述样本中本发明的基因群中基因的表达水平，
(3)确定所述受试者的肺腺癌分子分型和/或生存的风险。
本发明的方法可以用于诊断或非诊断目的。
用于本发明的方法的受试者对象为哺乳动物，优选为人，特别是患有肺癌的患者。
在步骤(1)中使用的样本没有特别的限制，只要能从其中获得基因群中的基因的表达水平即可，例如可以从所述样本提取受试者对象的总RNA。所述样本优选地为组织、血液、血浆、体液或其组合的样本，优选为组织样本，特别是石蜡组织样本。在优选的实施方案中，样本为肿瘤组织样本或包含肿瘤细胞的组织样本。
在步骤(2)中，采用二代测序方法测定本发明的基因群中基因的表达水平。该基因群如上文所述，并且还可以参见表2的描述。
在一优选的实施方案中，步骤(2)可以包括
(2-1)提取样本中的总RNA；
(2-2)将任选地进行纯化的总RNA转化为cDNA，然后将其制备成可用于二代测序的文库；
(2-3)对步骤(2-2)获得的文库进行测序。
步骤(2-1)的提取可以通过本领域常规方法进行，优选地利用RNA提取试剂盒提取检测受试者的新鲜冷冻组织或石蜡包埋组织的总RNA。在更优选的实施方案中，可以使用RNA storm CD201或Qiagen 73504进行提取。
在一优选的实施方案中，步骤(2-2)文库的构建方法可以包括以下步骤：
将提取的总RNA反转录生成如表1所述的76个基因的cDNA。末端补平并进行5’端磷酸化，将30μ1DNA、45μl纯水、10μ1具有10mM ATP的T4 DNA连接酶缓冲液、4μ1包含10mM dNTPMix、5μ1T4 DNA聚合酶、1μ1Klenow酶、5μ1Τ4连接酶混合后，在20℃下温浴30分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬液A:将上步的产物溶解在32μ1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μ1，1mM dATP 10μ1、KlenowΕχο-3μ1，在37℃下保持30分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒)。产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(part#28004)连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2χ25μ1、PE Adapter Oligo Mix 10μl，DNA连接酶5μ1，在20℃下保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquickPCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA，即得文库。
步骤(2-3)可以通过RNA测序完成。所述的测序的方法可以为本领域常规的用于确定基因表达水平的RNA-seq测序方法。优选地利用Illumina NextSeq/MiSeq/MiniSeq/iSeq系列测序仪进行二代测序。利用试剂盒中的引物对表1所示的基因进行扩增，根据步骤(2-2)所制备的文库的不同，可以对所得基因序列进行二代测序。优选地，二代测序为靶向RNA-seq技术，用Illumina NextSeq/MiSeq/MiniSeq/iSeq测序仪进行双端测序。这样的过程可以由仪器本身自动完成。
在步骤(2)中，还可采用荧光定量PCR方法测定本发明的基因群中基因的表达水平。该基因群如上文所述，并且还可以参见表3的描述。
在一优选的实施方案中，步骤(2)可以包括
(2-1)提取样本中的总RNA；
(2-2)将所提取总RNA进行一步法实时多重荧光定量RT-PCR检测。
步骤(2-1)的提取可以通过本领域常规方法进行，优选地利用RNA提取试剂盒提取检测受试者的新鲜冷冻组织或石蜡包埋组织的总RNA。在更优选的实施方案中，可以使用RNA storm CD201或Qiagen 73504进行提取。
其中，步骤(2-2)所述一步法实时多重荧光定量RT-PCR检测的方法为Taqman实时多重荧光定量RT-PCR，对24个靶基因(即24个分子分型及远处转移风险评估相关基因)和1个看家基因分成12个反应体系，分别进行荧光定量RT-PCR检测。每个反应体系包含2个靶基因和1个看家基因，每个反应体系中包含3个探针，3个探针分别标记不同荧光。其中，每个反应体系配制如下：
如上所述RNA样本2μl(总量100-400ng)，如上所述的3对正向、反向两条特异性引物(10μM)各0.4μl，3个Taqman荧光探针(10μM)各0.2μl，反应混合液6μl，酶混合液4μl，DEPC水4μl；其中，逆转录反应在50℃15-20分钟，预变性95℃5分钟；扩增反应包括变性95℃10秒，退火、延伸及荧光检测60℃45-60秒，进行45个循环，其中60℃荧光检测通道为FAM/HEX/VIC/ROX/Cy5；扩增反应结束后，记录每个基因的Ct值，代表了各个基因的表达水平。
在本发明的一实施方案中，步骤(3)可以通过将所得测序结果进行统计分析完成。可以任选地根据Hu等开创的单一样品预测法SSP(Single Sample Predictor)和Parker等优化的方法来进行肺癌分型和风险预测。对将所得测序结果基因表达数据进行分析获得单一样品的亚型分型，并可以计算生存风险。
本发明的检测方法可用于诊断目的或非诊断目的。
相应地，本发明还提供了本发明的基因群在对肺腺癌进行分子分型和/或评估其生存风险中的应用。
本发明还提供了本发明的基因群在制备对肺腺癌进行分子分型和/或评估其生存风险的产品中的应用。在优选的实施方案中，所述产品为检测试剂盒的形式。
本发明还进一步提供了检测本发明的基因群中的基因表达水平的试剂在制备对肺腺癌进行分子分型和/或评估其生存风险的体外诊断产品中的应用。在优选的实施方案中，所述产品为检测试剂盒的形式。在一实施方案中，所述试剂为检测所述基因转录的RNA，特别是mRNA的量的试剂。在又一实施方案中，所述试剂为检测与所述mRNA互补的cDNA的量的试剂。在可选的实施方案中，所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂，优选地，所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。在另一实施方案中，所述试剂为探针或引物，特别是引物。更优选地，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.227所示。引物和探针的具体方案还可以参见表2和表3所示。
所述肺腺癌的亚型包括LAD1型、LAD2型、LAD3型、LAD4型、LAD5型。
本发明所用的检测样本优选为来自检测对象(受试者对象)的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的总RNA即可。所述检测样本优选地为组织样本、血液、血浆和体液中的一种或几种，更优选地为组织样本，例如石蜡组织样本。在优选的实施方案中，检测样本为肿瘤细胞含量高的组织。
本发明还涉及一组免疫相关基因，其包括免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FGL2、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、LCP1、SPIB、CD53、CD3E、SLCO2B1、MS4A6A、CYBB、CD4、SH2D1A、TFEC、LYZ、ITGAM、TLR8、CSF1R、CXCL13、GPNMB、CCR5、HK3、CMKLR1、IL2RG、TYROBP、HCK、ITGB2、LAPTM5、SIGLEC1、AOAH、C3AR1、MSR1、IL2RA、CCL5、ADAMDEC1、LILRB4、CXCL11、FPR3、SELL、CXCL10、UBD、C1QB、PDCD1LG2、C1QA、SLAMF8、VSIG4、CD163、LAIR1、SLAMF7和MS4A4A(还可参见表1中的相关信息)。
本发明还涉及所述免疫相关基因(免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FGL2、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、LCP1、SPIB、CD53、CD3E、SLCO2B1、MS4A6A、CYBB、CD4、SH2D1A、TFEC、LYZ、ITGAM、TLR8、CSF1R、CXCL13、GPNMB、CCR5、HK3、CMKLR1、IL2RG、TYROBP、HCK、ITGB2、LAPTM5、SIGLEC1、AOAH、C3AR1、MSR1、IL2RA、CCL5、ADAMDEC1、LILRB4、CXCL11、FPR3、SELL、CXCL10、UBD、C1QB、PDCD1LG2、C1QA、SLAMF8、VSIG4、CD163、LAIR1、SLAMF7和MS4A4A)用于检测所述免疫相关基因用于不同肺腺癌免疫评估并用于指导肺癌的细胞免疫治疗。本发明还涉及所述免疫相关基因在进行肺癌评估生存风险中的应用。
实施例
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本文的实施例中所用的试剂和仪器均是可商购的。
实施例1：评估肺腺癌亚型分型及生存风险相关基因群的筛选
方法：通过EPIG基因表达谱分析程序(参见Zhou,Chou et al,2006.EnvironHealth Perspect 114(4),553-559；Chou,Zhou et al,2007.BMC Bioinformatics 8,427)分析TCGA数据库中504例具有完整临床信息的肺腺癌基因表达量，筛选出与肺腺癌生存风险密切相关的增殖相关基因、免疫相关基因、细胞间质相关基因，并在每组基因中计算并优选对分型及生存风险贡献率大的基因。
结果：共筛选获得了与肺腺癌亚型分型及生存风险相关的180个基因及6个看家基因，即186个基因测试组合。基因列表见表1。
将所筛选的186个基因在1346例肺腺癌的Affymatrics基因芯片表达谱的数据中进行有效性和稳定性验证。
实施例2：二代测序法肺腺癌分子分型及生存风险评估
实验方法：采用76基因测试组合，其中70个肺腺癌亚型分型及生存风险相关基因群(增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、DLGAP5、KPNA2、CCNA2、RRM2、FOXM1、MKI67、KIF14、HJURP、TPX2、NEK2、CDK1、CDKN3、ASPM、CEP55、BIRC5、MELK、CDC20、TYMS、AURKA和TOP2A；免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、SPIB、CD53、CD4和LYZ；细胞间质相关基因：SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2、COL5A1、COL11A1、COL5A2、COL1A2、MXRA5、THBS2、INHBA、VCAN、ADAMTS12、GREM1、COL3A1和SULF1)用于分子分型及生存风险评估，6个内参基因(包括GAPDH、GUSB、MRPL19、PSMC4、SF3A1和TFRC)作为内标。计算生存风险指数时采用表2中除6个内参基因外的其他所有70个基因。
实验结果：
1、肺腺癌分子分型
如上所述，利用表1所示76基因中的70个基因(增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、DLGAP5、KPNA2、CCNA2、RRM2、FOXM1、MKI67、KIF14、HJURP、TPX2、NEK2、CDK1、CDKN3、ASPM、CEP55、BIRC5、MELK、CDC20、TYMS、AURKA和TOP2A；免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、SPIB、CD53、CD4和LYZ；细胞间质相关基因：SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2、COL5A1、COL11A1、COL5A2、COL1A2、MXRA5、THBS2、INHBA、VCAN、ADAMTS12、GREM1、COL3A1和SULF1)对504例肺腺癌病例进行分子分型，将肺癌肿瘤分为5个亚型(LAD1型、LAD2型、LAD3型、LAD4型和LAD5型)，不属于LAD1型、LAD2型、LAD3型、LAD4型、LAD5型的肺腺癌为混合型(图1)。
通过计算不同亚型生存的数量和时间，绘制Kaplan-Meier生存曲线可以获得相应的生存风险。如图2所示，上述5个亚型的生存风险不同，表示肺腺癌每种亚型生存风险有不同。
LAD1亚型主要特征为增殖基因低表达，免疫基因高表达，细胞间质相关基因低表达，5年生存率最高。
LAD2亚型主要特征为增殖基因高表达，免疫基因低表达，细胞间质相关基因中等表达，5年生存率低。
LAD3亚型主要特征为增殖基因低表达，免疫基因中等表达，细胞间质相关基因高表达，5年生存率中等。
LAD4亚型主要特征为增殖基因中等表达，免疫基因低表达，细胞间质相关基因高表达，5年生存率低。
LAD5亚型主要特征为增殖基因高表达，免疫基因中等表达，细胞间质相关基因低表达，5年生存率中等。
2、增殖指数
通过23个细胞增殖相关基因PLK1、PRC1、CCNB1、DLGAP5、KPNA2、CCNA2、RRM2、FOXM1、MKI67、KIF14、HJURP、TPX2、NEK2、CDK1、CDKN3、ASPM、CEP55、BIRC5、MELK、CDC20、TYMS、AURKA和TOP2A的表达水平计算出增殖指数，可将肺腺癌分为2组，增殖快和增殖慢(图3)。
Figure BDA0002181293020000191
3、免疫指数
根据30个免疫相关基因P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、SPIB、CD53、CD4和LYZ的表达水平计算免疫指数，根据免疫指数可将每个亚型进一步分为两组，免疫强组和免疫弱组，并观察两组之间的生存差异。结果显示免疫指数对肺腺癌的预后有重要影响，其免疫功能强，则预后相对好(图4)。
Figure BDA0002181293020000192
5、生存风险评估
肿瘤生存风险的计算采用Cox模型，以死亡是否发生及发生时间作为观察终点，根据肿瘤的亚型、增殖指数和免疫指数对于生存发生影响的相对危险度确定相应系数，计算方法如下：
生存风险评分(Risk of Death,RD)的计算：0-100
0-30，低风险；31-70，中风险；71-100，高风险；
RD＝(-0.18*LAD1)+(0.09*LAD2)+(0.04*LAD3)+(0.17*LAD4)+(-0.17*LAD5)+(-0.05*免疫指数)+(0.12*增殖指数)
其中，“LAD1”代表该肿瘤与LAD1型肿瘤的pearson相关系数；
“LAD2”代表该肿瘤与LAD2型肿瘤的pearson相关系数；
“LAD3”代表该肿瘤与LAD3型肿瘤的pearson相关系数；
“LAD4”代表该肿瘤与LAD4型肿瘤的pearson相关系数；
“LAD5”代表该肿瘤与LAD5型肿瘤的pearson相关系数；
根据所计算得出的生存风险评分，可将肿瘤生存的风险分为三组，低风险(0-30)、中等风险(31-70)和高风险(71-100)(图5)。
实施例3：定量PCR法肺腺癌分子分型及生存风险相评估
实验方法：采用25基因测试组合，其中24个肺腺癌亚型分型及生存风险相关基因群(增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、MKI67、TPX2、MELK、CDC20、TYMS和TOP2A；免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R和CD4；细胞间质相关基因：SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2和COL5A1)用于分子分型及生存风险评估，1个内参基因(ACTB)作为内标。计算生存风险指数时采用表3中除内参基因外的其他所有24个基因。
实施例4：评估肺腺癌分子分型及生存风险基因群的二代测序检测试剂盒分析
步骤1：取检测对象肿瘤或石蜡包埋组织，利用检测试剂盒中的方法获取检测对象含肿瘤细胞高的区域为原始材料。
步骤2：提取组织中总RNA。可以使用RNA storm CD201RNA或者Qiagen RNeaseFFPE kit RNA抽提试剂盒来提取。
步骤3：将所得RNA制成可供测序的文库。将所得组织的RNA制成可供靶向RNA-seq技术二代测序的文库，文库的制备方法包括以下步骤：
将提取组织的RNA在专一引物的指导下用反转录酶生成感兴趣的多种基因(如表2所述的68个基因)cDNA。末端补平并进行5’端磷酸化，将30μ1DNA、45μ1纯水、10μ1具有10mMATP的T4 DNA连接酶缓冲液、4μ1包含10mM dNTP Mix、5μ1T4 DNA聚合酶、1μ1Klenow酶、5μ1Τ4连接酶混合后，在20℃温浴30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬A:将上步的产物溶解在32μ1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μ1，1mM dATP 10μ1、KlenowΕχο-3μ1，在37℃保持30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(part#28004)连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2χ25μ1、PE AdapterOligo Mix 10μl，DNA连接酶5μ1,在20℃保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA即得文库。
步骤4：利用实施例3表2中的引物序列对所得DNA文库进行用NextSeq/MiSeq/MiniSeq/iSeq进行二代测序。用Illumina NextSeq/MiSeq/MiniSeq/iSeq测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成(Illumina公司)。
步骤5：结果统计分析。将所得测序结果进行统计分析，根据Hu等提出的单一样品预测法SSP(Single Sample Predictor)或Parker等优化的方法来进行肺腺癌分型和风险预测。对所得测序结果基因表达数据进行分析。
表2:本发明的基因群的基因及其扩增引物
Figure BDA0002181293020000201
Figure BDA0002181293020000211
Figure BDA0002181293020000221
Figure BDA0002181293020000231
Figure BDA0002181293020000241
实施例5：评估肺腺癌分子分型及生存风险基因群的定量PCR检测试剂盒分析
步骤1：取检测对象肿瘤或石蜡包埋组织，利用检测试剂盒中的方法获取检测对象含肿瘤细胞高的区域为原始材料。
步骤2：提取组织中总RNA。可以使用RNA storm CD201RNA或者Qiagen RNeaseFFPE kit RNA抽提试剂盒来提取。
步骤3：一步法多重荧光定量RT-PCR检测。所述一步法实时多重荧光定量RT-PCR检测的方法为Taqman实时多重荧光定量RT-PCR，将表1中24个靶基因和1个看家基因分成12个反应体系，分别进行荧光定量RT-PCR检测。每个反应体系包含2个靶基因和1个看家基因，采用3个探针分别标记不同荧光。每个反应体系配制如下：
RNA样本2μl(总量100-400ng)，如上所述的4对正向、反向两条特异性引物(10μM)各0.4μl，3个Taqman荧光探针(10μM)各0.2μl，反应混合液6μl，酶混合液4μl，DEPC水4μl；其中，逆转录反应在50℃15-20分钟，预变性95℃5分钟；扩增反应包括变性95℃10秒，退火、延伸及荧光检测60℃45-60秒，进行45个循环，其中60℃荧光检测通道为FAM/HEX/VIC/ROX/Cy5；扩增反应结束后，记录每个基因的Ct值，代表了各个基因的表达水平。
步骤4：结果统计分析。将所得测序结果进行统计分析，根据Hu等提出的单一样品预测法SSP(Single Sample Predictor)或Parker等优化的方法来进行肺癌分型和风险预测。对所得测序结果基因表达数据进行分析。
表3：本发明的基因群的基因及其扩增引物和探针
Figure BDA0002181293020000251
Figure BDA0002181293020000261
Figure BDA0002181293020000271

Claims (19)

1.一种用于肺腺癌分子分型和/或评估其生存风险的基因群，其特征在于，
所述基因群包括180个分子分型及生存风险评估相关基因以及6个看家基因，其中，所述180个分子分型及生存风险评估相关基因包括：
(1)增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、DLGAP5、KPNA2、CCNA2、RRM2、HMMR、KIF20A、FOXM1、MKI67、KIF14、TK1、HJURP、TPX2、EXO1、KIF11、NEK2、KIF23、CDCA3、CDK1、SPAG5、KIF4A、GTSE1、CDKN3、CDC25C、PRR11、CCNB2、MAD2L1、PKMYT1、CENPE、ASPM、CENPF、BUB1、NDC80、NUSAP1、CEP55、NCAPG、BIRC5、ZWINT、TTK、ESPL1、DEPDC1、MELK、CDC20、CDC6、AURKA、NEIL3、CDT1、KIF2C、KIFC1、NCAPH、KIF18B、AURKB、UBE2C、TOP2A、TYMS、PBK、CDC45、CDCA8、CENPA、MYBL2、SKA1、MCM10、TRIP13、TROAP、POLQ、GINS1和RAD54L；
(2)免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FGL2、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、LCP1、SPIB、CD53、CD3E、SLCO2B1、MS4A6A、CYBB、CD4、SH2D1A、TFEC、LYZ、ITGAM、TLR8、CSF1R、CXCL13、GPNMB、CCR5、HK3、CMKLR1、IL2RG、TYROBP、HCK、ITGB2、LAPTM5、SIGLEC1、AOAH、C3AR1、MSR1、IL2RA、CCL5、ADAMDEC1、LILRB4、CXCL11、FPR3、SELL、CXCL10、UBD、C1QB、PDCD1LG2、C1QA、SLAMF8、VSIG4、CD163、LAIR1、SLAMF7和MS4A4A；
(3)细胞间质相关基因：LOXL2、SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2、COL5A1、COL11A1、COL5A2、COL1A2、MXRA5、THBS2、INHBA、VCAN、ADAMTS12、GREM1、COL3A1、SULF1、ADAMTS2、PRRX1、COL15A1、SPARC、THY1、FAP、DIO2、FN1、COL6A3、FBN1、SYNDIG1、AEBP1、LRRC15、CILP、ISLR、GAS1、COL10A1、ASPN、MMP2和EPYC；
所述看家基因包括GAPDH、GUSB、MRPL19、PSMC4、SF3A1和TFRC。
2.一种用于肺腺癌分子分型和/或评估其生存风险的基因群，其特征在于，
所述基因群包括70个分子分型及生存风险评估相关基因以及6个看家基因，其中，所述70个分子分型及生存风险评估相关基因包括：
(1)增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、DLGAP5、KPNA2、CCNA2、RRM2、FOXM1、MKI67、KIF14、HJURP、TPX2、NEK2、CDK1、CDKN3、ASPM、CEP55、BIRC5、MELK、CDC20、TYMS、AURKA和TOP2A；
(2)免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R、SPN、SASH3、CSF2RB、CD37、IKZF1、CD48、IL10RA、EVI2B、IGSF6、CD52、DOCK2、CD84、FOLR2、NCKAP1L、TRAC、MNDA、MRC1、PLEK、SPIB、CD53、CD4和LYZ；
(3)细胞间质相关基因：SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2、COL5A1、COL11A1、COL5A2、COL1A2、MXRA5、THBS2、INHBA、VCAN、ADAMTS12、GREM1、COL3A1和SULF1；
所述看家基因包括GAPDH、GUSB、MRPL19、PSMC4、SF3A1、TFRC。
3.一种用于肺腺癌分子分型和/或评估其生存风险的基因群，其特征在于，
所述基因群包括24个分子分型及生存风险评估相关基因以及1个看家基因，其中，所述24个分子分型及生存风险评估相关基因包括：
(1)增殖相关基因：PLK1、PRC1、CCNB1、MKI67、TPX2、MELK、CDC20、TYMS和TOP2A；
(2)免疫相关基因：P2RY13、CCR2、PTPRC、IRF8、CLEC10A、TLR7、CCR4、IL7R和CD4；
(3)细胞间质相关基因：SPOCK1、COL1A1、POSTN、ADAM12、COL6A2和COL5A1；所述看家基因包括ACTB。
4.如权利要求1-3中任一项所述的基因群在进行肺腺癌分子分型和/或评估生存风险中的应用。
5.如权利要求1-3中任一项所述的基因群在制备对肺腺癌进行分子分型和/或评估生存风险的诊断产品中的应用。
6.检测权利要求1-3中任一项所述的基因群中的基因的表达水平的试剂在制备对肺腺癌进行分子分型和/或评估生存风险的诊断产品中的应用。
7.一种对肺腺癌进行分子分型和/或评估生存风险的诊断产品，其包含检测权利要求1-3中任一项的基因群中基因的表达水平的相关试剂。
8.如权利要求6或7所述的应用或诊断产品，其特征在于，所述诊断产品为体外诊断产品的形式，优选诊断试剂盒的形式。
9.如权利要求6-8之一所述的应用或诊断产品，其特征在于，所述试剂为检测所述基因转录的RNA，特别是mRNA的量的试剂。
10.如权利要求6-9之一所述的应用或诊断产品，其特征在于，所述试剂为检测与所述mRNA互补的cDNA的量的试剂。
11.如权利要求6-10之一所述的应用或诊断产品，其特征在于，所述诊断产品还包括总RNA抽提试剂、逆转录试剂、二代测序试剂和/或定量PCR试剂。
12.如权利要求6-11之一所述的应用或诊断产品，其特征在于，所述试剂为检测所述基因编码的多肽的量的试剂，优选地，所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。
13.如权利要求6-11之一所述的应用或诊断产品，其特征在于，所述试剂为探针或引物，优选引物。
14.如权利要求13所述的应用或诊断产品，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO.1-SEQID NO.152所示。
15.一组用于评估肺腺癌分子分型和/或生存风险的引物，其中所述引物的序列如SEQID NO.1-SEQ ID NO.152所示。
16.如权利要求13所述的应用或诊断产品，其特征在于，所述引物和探针如SEQ IDNO.153-SEQ ID NO.227所示。
17.一组用于评估肺腺癌分子分型和/或生存风险的引物和探针，其中所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.153-SEQ ID NO.227所示。
18.如权利要求14-17所述的引物及探针组在用于制备对肺腺癌进行分子分型和/或评估生存风险的产品中的应用。
19.如权利要求1-18所述的基因群、应用、诊断产品或引物组，其特征在于，所述肺腺癌包括LAD1型、LAD2型、LAD3型、LAD4型、LAD5型和混合型，其中混合型包括所述不属于LAD1型、LAD2型、LAD3型、LAD4型、LAD5型的肺腺癌。
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