CN111808961A - 一种用于检测肝癌的生物标志物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测肝癌的生物标志物组，由BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因组成。本发明还提供了另一种用于检测肝癌的生物标志物组，由ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因组成。本发明还提供了检测生物标志物组的试剂在制备用于检测肝癌的产品中的应用。本发明还提供了一种用于检测肝癌的产品，包括检测生物标志物组的试剂。本发明的生物标志物组具有灵敏性高、特异性高和准确性高的优点。

Description

一种用于检测肝癌的生物标志物组及其应用

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体地，本发明涉及一种用于检测肝癌的生物标志物组及其应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是全球第二大癌症致死病因[1,2]。在亚洲，慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染和肝硬化是与HCC最相关的因素[3,4,5]。手术切除是唯一能够给早期HCC患者带来生存益处的治疗方式[6,7]。不幸的是，HCC通常发现时已是晚期，此时原本有效的治疗性手术方案已经不可行。而化疗干预基本上对HCC无效。因此，晚期HCC患者的总体预后都是较差的[8]。

血清甲胎蛋白(AFP)是检测HCC最常用的生物标志物。不幸的是，据估计有30-50％的HCC患者在确诊时，AFP水平却低于20ng/mL[9]，而在非恶性慢性肝病患者中可观察到AFP水平升高[10,11]。因此，有人报道AFP的敏感性为41-65％，特异性为80-90％，不足以作为早期HCC筛查的标志物[12,13]。其他血清标志物也都被筛选过，但都被认为不能满足临床使用需求[12,14]。用于HCC诊断的腹部超声(US)、计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)等影像学技术价格昂贵，需依赖专业技术人员检测，并会使患者暴露于辐射中[8,13]。因此，新的、可靠的、低成本的、非侵入性的并且对HCC早期诊断具有高灵敏性和高特异性的生物标志物是目前需要解决的临床需求。

发明内容

本发明的发明目的是针对现有技术的缺陷，提供了一种用于检测肝癌的生物标志物组及其应用。

具体地，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种用于检测肝癌的生物标志物组，由BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因组成。

另一方面，本发明提供了检测所述生物标志物组的试剂在制备用于检测肝癌的产品中的应用。

进一步，所述试剂包括通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂。

进一步，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂包括BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因的特异性引物。

进一步，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂还包括HPRT1基因的特异性引物。

进一步，BTBD19基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；FOSB基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SCUBE1基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6；SHE基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；PM20D1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；ZFP57基因的特异性引物是序列SEQID NO:11和SEQ ID NO:12；HPRT1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

进一步，检测肝癌包括：

步骤S1：获得受试者样本中的循环免疫细胞；

步骤S2：获得BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因在循环免疫细胞中的标准化表达量，计算肝癌检测概率；

步骤S3：将肝癌检测概率与截止值进行比较以确定受试者是否患有肝癌。

进一步，在步骤S2中，根据公式1/(1+e^(-(4.36+83.19×BTBD19+41.53×FOSB+17.65×SCUBE1+3.25×SHE-27.5×PM20D1-6.75×ZFP57)))计算肝癌检测概率，其中，BTBD19、FOSB、SCUBE1、SHE、PM20D1和ZFP57分别表示BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因相对于HPRT1基因的标准化表达量。

进一步，在步骤S3中，截止值是0.76；当肝癌检测概率大于0.76时，确定受试者患有肝癌。

另一方面，本发明提供了一种用于检测肝癌的产品，包括检测所述生物标志物组的试剂。

进一步，所述产品是试剂盒、药物、基因芯片或检测试纸。

进一步，所述产品是试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂。

进一步，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂包括BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因的特异性引物。

进一步，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂还包括HPRT1基因的特异性引物。

进一步，BTBD19基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；FOSB基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SCUBE1基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6；SHE基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；PM20D1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；ZFP57基因的特异性引物是序列SEQID NO:11和SEQ ID NO:12；HPRT1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

另一方面，一种用于检测肝癌的生物标志物组，由ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因组成。

另一方面，本发明提供了检测所述生物标志物组的试剂在制备用于检测肝癌的产品中的应用。

进一步，所述试剂包括通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂。

进一步，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂包括ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因、和SHE基因的特异性引物。

进一步，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂还包括HPRT1基因的特异性引物。

进一步，ABCA1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；BTBD19基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；FOS基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18；SHE基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；HPRT1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

进一步，检测肝癌包括：

步骤S1：获得受试者样本中的循环免疫细胞；

步骤S2：获得ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因在循环免疫细胞中的标准化表达量，计算肝癌检测概率；

步骤S3：将肝癌检测概率与截止值进行比较以确定受试者是否患有肝癌。

进一步，在步骤S2中，根据公式1/(1+e^(-(-2.47+0.092×ABCA1+21.75×BTBD19+0.752×FOS-10.544×SHE)))计算肝癌检测概率，其中，ABCA1、BTBD19、FOS、和SHE分别表示ABCA1、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因相对于HPRT1基因的标准化表达量。

进一步，在步骤S3中，截止值是0.5；当肝癌检测概率大于0.5时，确定受试者患有肝癌。

另一方面，本发明提供了一种用于检测肝癌的产品，包括检测权利要求1所述的生物标志物组的试剂。

进一步，所述产品是试剂盒、药物、基因芯片或检测试纸。

进一步，所述产品是试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂。

进一步，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂包括ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因的特异性引物。

进一步，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂还包括HPRT1基因的特异性引物。

进一步，ABCA1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；BTBD19基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；FOS基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18；SHE基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；HPRT1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

相比于现有技术，本发明的技术方案至少具有如下有益效果：

本发明的生物标志物组的检测性能不依赖于患者的疾病状态，也不依赖于患者的AFP水平，具有灵敏性高、特异性高和准确性高的优点，改善了目前诊断肝癌主要采用AFP和影像学技术的手段，降低了AFP阴性肝癌的漏检，能够用于早期HCC和AFP阴性HCC的检测。

使用本发明的生物标志物组对患者进行检测的操作方法简单、成本低廉，并且不会对患者或使用者造成任何危害。

附图说明

图1是本发明实施例的研究流程图。

图2显示了主成分分析表明循环免疫细胞内具有识别肝细胞癌的特异性RNA表达。

图3显示了在500例患者样本的训练组中，ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因作为单一生物标志物可以准确的检测出肝细胞癌样本，灵敏度为55-84％，特异性为70-92％。

图4显示了在500例患者样本的训练组中，HIR-肝癌检测由四个生物标志物组成,分别为ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因。HIR-肝癌检测以92％的灵敏度和92％的特异性检测出肝细胞癌患者的样本。血清甲胎蛋白的灵敏度和特异性分别为50％和64％。

图5显示了在200例患者样本的验证组中，HIR-肝癌检测以91％的灵敏度和95％的特异性检测出肝细胞癌患者的样本。血清甲胎蛋白的灵敏度和特异性分别为26％和81％。

图6显示了在总共156例肝细胞癌的样本里面的亚型分析，有83例肝细胞癌病人样本为甲胎蛋白检测阴性，血清甲胎蛋白浓度低于20ng/ml。在544个慢性肝炎患者样本的背景下，HIR-肝癌诊断检出甲胎蛋白阴性的肝细胞癌的灵敏度为94％，特异性为93％；甲胎蛋白针对超早期和早期肝细胞癌的灵敏度为0％，特异性为70％。

图7显示了在总共156例肝细胞癌的样本里面的亚型分析，有51例肝细胞癌病人样本为甲胎蛋白检测阳性，血清甲胎蛋白浓度高于20ng/ml。在544个慢性肝炎患者样本的背景下，HIR-肝癌诊断检出甲胎蛋白阳性的肝细胞癌的灵敏度为90％，特异性为93％；甲胎蛋白针对超早期和早期肝细胞癌的灵敏度为100％，特异性为70％。

图8显示了在总共156例肝细胞癌的样本里面的亚型分析，有71例超早期或早期的肝细胞癌病人样本。超早期肝细胞癌为BCLC分期为0期，早期肝细胞癌为BCLC分期A期。在544个慢性肝炎患者样本的背景下，HIR-肝癌诊断检出超早期和早期肝细胞癌的灵敏度为91％，特异性为93％；甲胎蛋白针对超早期和早期肝细胞癌的灵敏度为45％，特异性为70％。

图9显示了在总共156例肝细胞癌的样本里面的亚型分析，有74例中晚期的肝细胞癌病人样本。中晚期肝细胞癌为BCLC分期为B，C或者D期。在544个慢性肝炎患者样本的背景下，HIR-肝癌诊断检出超早期和早期肝细胞癌的灵敏度为94％，特异性为93％；甲胎蛋白针对超早期和早期肝细胞癌的灵敏度为38％，特异性为70％。

图10是本发明实施例中的96孔板建议上样排列方式。

具体实施方式

为了充分了解本发明的目的、特征及功效，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。本发明的方法除下述内容外，其余均采用本领域的常规方法或装置。

除非另有说明，否则本发明中涉及的技术和科学术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献将向本领域技术人员提供本发明所用许多术语的一般定义：Sambrook和Russel,分子克隆实验指南第4版,冷泉港出版社(冷泉港,NY 2012)(Sambrookand Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press(Cold Spring Harbor,NY2012))；Singleton等,微生物学与分子生物学词典第4版,约翰.威利出版社(纽约,NY 2012)(Singleton et al.,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology4th ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2012))；高等有机化学-反应、机理与结构第5版,约翰.威利出版社(纽约,NY 2001)(March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 5th ed.,J.Wiley&Sons(NewYork,NY 2001))。本领域的技术人员将认识到可用于本发明实践的与本文所述的那些方法和材料相似或等效的许多方法和材料。实际上，本发明决不限于所述的方法和材料。

在本发明中，“肝癌”是指肝脏恶性肿瘤，起源于肝脏的上皮或间叶组织，具有高发性并且危害极大。根据巴塞罗那肝癌临床分期系统(Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC)，肝癌分为0期(即最早期，一个肿瘤病灶，病灶直径不超过2厘米)，A期(即早期，单一病灶体积不超过5厘米，或者3个子灶，每个子灶不超过3厘米)，B期(即中期，单一病灶体积大于5厘米或者超过3个病灶)，C期(即晚期，门脉侵犯/肝外转移)，D期(即终末期，任何肿瘤)。应当说明的是，在本发明中，“肝癌”、“原发性肝癌”、“肝细胞癌”、“HCC”(HepatoCellular Carcinoma)具有相同的含义，可互换使用。

在本发明中，“甲胎蛋白阴性肝细胞癌”是指甲胎蛋白检测为阴性(即血清甲胎蛋白浓度低于20ng/ml)的肝细胞癌。在本发明中，“甲胎蛋白阴性肝细胞癌”与“AFP阴性HCC”具有相同的含义，可互换使用。

在本发明中，“循环免疫细胞”是指由所定居的免疫器官进入血液循环，并且经过血液循环之后重新分布于全身免疫器官的免疫细胞。在本发明中，循环免疫细胞主要是指外周血中的有核细胞，包括T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞、巨核细胞等的总称。

针对目前HCC诊断中缺少高灵敏性和高特异性的生物标志物，本发明的发明人对HCC患者和正常人血液样本RNA进行了全面的基因表达分析，最终获得了具有灵敏性高、特异性高和准确性高的优点并且尤其适合用于早期HCC(即0期和A期)和AFP阴性HCC检测的生物标志物组。

第一方面，本发明提供了用于检测肝癌的生物标志物组。本发明的用于检测肝癌的生物标志物组由BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因。

在本发明中，BTBD19基因(BTB domain containing 19；GeneBank数据库NM_001136537.1)属于BTB家族，基因序列如SEQ ID NO:19所示。应当说明的是，在本发明中，“BTBD19基因”包括BTBD19基因以及BTBD19基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在本发明中，FOSB基因(FosB proto-oncogene；GeneBank数据库NM_006732.3)是Fos基因家族的成员，基因序列如SEQ ID NO:20所示。应当说明的是，在本发明中，“FOSB基因”包括FOSB基因以及FOSB基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ IDNO:20所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在本发明中，SCUBE1基因(CUB domain and EGF like domain containing 1；GeneBank数据库NM_173050.5)编码细胞表面糖蛋白，其是SCUBE家族的成员，基因序列如SEQ ID NO:21所示。应当说明的是，在本发明中，“SCUBE1基因”包括SCUBE1基因以及SCUBE1基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在本发明中，SHE基因(Src homology 2domain containing E；GeneBank数据库NM_001010846.3)基因序列如SEQ ID NO:22所示。应当说明的是，在本发明中，“SHE基因”包括SHE基因以及SHE基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在本发明中，PM20D1基因(peptidase M20 domain containing 1；GeneBank数据库NM_152491.5)基因序列如SEQ ID NO:23所示。应当说明的是，在本发明中，“PM20D1基因”包括PM20D1基因以及PM20D1基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ IDNO:23所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在本发明中，ZFP57基因(ZFP57 zinc finger protein；GeneBank数据库NM_001109809.4)编码的蛋白质是含有KRAB结构域的锌指蛋白质，该基因的突变与1型短暂性新生儿糖尿病(TNDM1)有关，该基因的序列如SEQ ID NO:24所示。应当说明的是，在本发明中，“ZFP57基因”包括ZFP57基因以及ZFP57基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了检测生物标志物组的试剂在制备用于检测肝癌的产品中的应用。

优选地，检测生物标志物组的试剂包括通过RT-qPCR(逆转录定量PCR)技术检测所述生物标志物组的试剂。

更优选地，通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂包括扩增BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因的特异性引物。更优选地，通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂还包括扩增HPRT1基因的特异性引物。

在一种优选的具体实施方式中，检测生物标志物组的试剂是BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因，以及内参基因HPRT1的特异性引物SEQID NO:1至SEQ ID NO:14。具体如下：

在一种优选的具体实施方式中，应用本发明的生物标志物组检测癌症的方法包括：

步骤S1：获得受试者样本中的循环免疫细胞；

步骤S2：获得BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因在循环免疫细胞中的标准化表达量，计算肝癌检测概率；

步骤S3：将肝癌检测概率与截止值进行比较以确定受试者是否患有肝癌。

其中，步骤S1具体包括：

S11：从受试者获得样本，其中，样本可以是全血样本，例如，静脉外周血全血样本；

S12：对全血样本进行细胞裂解，离心、沉淀得到循环免疫细胞。

其中，步骤S2具体包括：

S21：提取循环免疫细胞的总RNA，进行反转录；

S22：以反转录产物cDNA为模板，采用特异性引物SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:14进行检测，使用比较循环阈值的方法将BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因的表达与内参基因HPRT1做标准化对比，得到BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因的标准化表达量BTBD19、FOSB、SCUBE1、SHE、PM20D1和ZFP57；

S23：根据公式1/(1+e^(-(4.36+83.19×BTBD19+41.53×FOSB+17.65×SCUBE1+3.25×SHE-27.5×PM20D1-6.75×ZFP57)))计算肝癌检测概率。其中，“^”后面的表达式位于e的平方处，例如，“e^A”表示“e^A”，即e的A次方。

其中，在步骤S3中，选择0.76作为截止值。当肝癌检测概率大于0.76时，认为受试者患有肝癌，反之则认为受试者未患有肝癌。

第三方面，本发明提供了用于检测肝癌的产品，包括检测上述生物标志物组的试剂。用于检测肝癌的产品可以是试剂盒、药物、基因芯片或检测试纸。

其中，试剂盒是基因检测试剂盒，包括通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂。

其中，药物可以是包括通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂并可用于检测生物标志物组表达水平的制剂。

其中，基因芯片包括固相载体和固定于固相载体的能够与上述生物标志物组的核酸序列杂交的探针。

其中，检测试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的核酸，该核酸能够检测上述生物标志物组的表达水平。

在一种优选的具体实施方式中，用于检测肝癌的产品是试剂盒，包括通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂。

优选地，通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂包括BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因的特异性引物。更优选地，通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂还包括扩增HPRT1基因的特异性引物。更优选地，特异性引物是BTBD19基因的特异性引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、FOSB基因的特异性引物SEQID NO:3和SEQ ID NO:4、SCUBE1基因的特异性引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SHE基因的特异性引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、PM20D1基因的特异性引物SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10、ZFP57基因的特异性引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、HPRT1基因的特异性引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:14的特异性引物可以采用PCR预混液的形式包括在试剂盒中。例如，特异性引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2与无核酸酶水组成BTBD19基因的PCR预混液；特异性引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4与无核酸酶水组成FOSB基因的PCR预混液；以此类推。

可选地，本发明的试剂盒还可以包括阴性对照和阳性对照。其中，阴性对照可以是无核酸酶水，阳性对照可以是人工配制的截止值大于0.76的人造样本。

应当说明的是，本发明的试剂盒还可以包括其它适用组分，例如，测量工具、稀释剂、缓冲剂、酶、药学上可接受的载体、注射器或将易于由本领域技术人员认识到的其它适用附件，本领域技术人员能够根据预定目的进行合理选择和配制。可选地，本发明的试剂盒还包括使用说明书。“使用说明书”通常包括描述在使用试剂盒的组分来实现所需结果时采用的技术的明确表述，所需结果例如是检测BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因的表达水平。

第四方面，本发明提供了用于检测肝癌的生物标志物组。本发明的用于检测肝癌的生物标志物组由ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因。

在本发明中，ABCA1基因(ATP Binding Cassette Subfamily A Member 1；GenBank数据库NM_005502.4)属于ABC家族，基因序列如SEQ ID NO:25所示。应当说明的是，在本发明中，“ABCA1基因”包括ABCA1基因以及ABCA1基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在本发明中，BTBD19基因(BTB domain containing 19；GenBank数据库NM_001136537.1)属于BTB家族，基因序列如SEQ ID NO:19所示。应当说明的是，在本发明中，“BTBD19基因”包括BTBD19基因以及BTBD19基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在本发明中，FOS基因(Fos proto-oncogene,AP-1transcription factorsubunit；GenBank数据库NM_005252.4)是Fos基因家族的成员，基因序列如SEQ ID NO:26所示。应当说明的是，在本发明中，“FOS基因”包括FOS基因以及FOS基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ IDNO:26所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在本发明中，SHE基因(Src homology 2domain containing E；GenBank数据库NM_001010846.3)基因序列如SEQ ID NO:22所示。应当说明的是，在本发明中，“SHE基因”包括SHE基因以及SHE基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

第五方面，本发明提供了检测生物标志物组的试剂在制备用于检测肝癌的产品中的应用。

优选地，检测生物标志物组的试剂包括通过RT-qPCR(逆转录定量PCR)技术检测所述生物标志物组的试剂。

更优选地，通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂包括扩增ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因的特异性引物。更优选地，通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂还包括扩增HPRT1基因的特异性引物。

在一种优选的具体实施方式中，检测生物标志物组的试剂是ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因，以及内参基因HPRT1的特异性引物具体如下：

在一种优选的具体实施方式中，应用本发明的生物标志物组检测癌症的方法包括：

步骤S1：获得受试者样本中的循环免疫细胞；

步骤S2：获得ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因在循环免疫细胞中的标准化表达量，计算肝癌检测概率；

步骤S3：将肝癌检测概率与截止值进行比较以确定受试者是否患有肝癌。

其中，步骤S1具体包括：

S11：从受试者获得样本，其中，样本可以是全血样本，例如，静脉外周血全血样本；

S12：对全血样本进行细胞裂解，离心、沉淀得到循环免疫细胞。

其中，步骤S2具体包括：

S21：提取循环免疫细胞的总RNA，进行反转录；

S22：以反转录产物cDNA为模板，采用特异性引物SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10进行检测，使用比较循环阈值的方法将ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因的表达与内参基因HPRT1做标准化对比，得到ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因的标准化表达量ABCA1、BTBD19、FOS和SHE；

S23：根据公式1/(1+e^(-(-2.47+0.092×ABCA1+21.75×BTBD19+0.752×FOS-10.544×SHE)))计算肝癌检测概率。其中，“^”后面的表达式位于e的平方处，例如，“e^A”表示“e^A”，即e的A次方。

其中，在步骤S3中，选择0.5作为截止值。当肝癌检测概率大于0.5时，认为受试者患有肝癌，反之则认为受试者未患有肝癌。

第六方面，本发明提供了用于检测肝癌的产品，包括检测上述生物标志物组的试剂。用于检测肝癌的产品可以是试剂盒、药物、基因芯片或检测试纸。

其中，试剂盒是基因检测试剂盒，包括通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂。

其中，药物可以是包括通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂并可用于检测生物标志物组表达水平的制剂。

其中，基因芯片包括固相载体和固定于固相载体的能够与上述生物标志物组的核酸序列杂交的探针。

其中，检测试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的核酸，该核酸能够检测上述生物标志物组的表达水平。

在一种优选的具体实施方式中，用于检测肝癌的产品是试剂盒，包括通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂。

优选地，通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂包括ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因的特异性引物。更优选地，通过RT-qPCR技术检测上述生物标志物组的试剂还包括扩增HPRT1基因的特异性引物。更优选地，特异性引物是ABCA1基因的特异性引物SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、BTBD19基因的特异性引物SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2、FOS基因的特异性引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、SHE基因的特异性引物SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8、HPRT1基因的特异性引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

特异性引物可以采用PCR预混液的形式包括在试剂盒中。例如，特异性引物SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16与无核酸酶水组成ABCA1基因的PCR预混液以此类推。

可选地，本发明的试剂盒还可以包括阴性对照和阳性对照。其中，阴性对照可以是无核酸酶水，阳性对照可以是人工配制的截止值大于0.5的人造样本。

应当说明的是，本发明的试剂盒还可以包括其它适用组分，例如，测量工具、稀释剂、缓冲剂、酶、药学上可接受的载体、注射器或将易于由本领域技术人员认识到的其它适用附件，本领域技术人员能够根据预定目的进行合理选择和配制。可选地，本发明的试剂盒还包括使用说明书。“使用说明书”通常包括描述在使用试剂盒的组分来实现所需结果时采用的技术的明确表述，所需结果例如是检测ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因的表达水平。

实施例

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1：用于检测肝癌的生物标志物的筛选

1.样本来源

研究对象分为慢性乙型肝炎患者(CHB患者)组和原发性肝癌患者(HCC患者)组，从这些研究对象的全血样本中通过红血细胞裂解法得到有核的白血细胞。

慢性乙型肝炎患者的全血样本在患者前往青岛大学附属医院就诊期间通过医院收集。慢性乙型肝炎患者是指在过去6个月携带HBsAg的慢性HBV携带者，HBV DNA血液浓度高于1x10³拷贝/mL，血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平持续或间歇性升高。肝硬化的状况根据具体临床环境下的检测结果评估：影像学(超声、CT扫描或MRI)；瞬时弹性成像；脾肿大；腹水或食管或胃静脉曲张。

原发性肝癌患者(治疗前)的血液样本收集自HCC患者在青岛大学附属医院诊断期间。通过术后组织病理学来证实可切除的HCC病例。根据EASL标准通过影像学方法确诊不可切除的HCC病例。

所有样本均按照相关机构审查委员会批准的方案采集，采集样本前需征得所有受试者的知情同意。

2.方法

按照图1所示的流程进行如下操作：

2.1在最初的发现阶段，有20个(10个HCC,10个CHB)样本用来筛选区别CHB和HCC患者的生物标志物。

血样收集和循环免疫细胞的纯化

由专业护士抽取3ml静脉血，装在EDTA-K2采血管中(BD 367861)，并马上颠倒混匀。全血采血后需在2小时内进行预处理。在预处理前，采好的血样必须在4℃保存。取1mlEDTA-K2处理过的全血与10ml ACK裂解缓冲液(A1049201,ThermoFisher)充分混匀，室温静置10分钟。室温离心300g，5分钟，沉淀循环免疫细胞。加5ml冷藏PBS，移液枪反复吹打5次，使沉淀充分混匀。再次室温离心300g，5分钟，沉淀循环免疫细胞。弃上清，把循环免疫细胞沉淀用700微升的RNAzol RT试剂(MRC,RN900)充分溶解，负80度冰箱保存至RNA提取。

RNA提取，制库和RNA-seq二代测序

循环免疫细胞的总RNA通过RNAzol-RT(MRC,USA)试剂进行提取。提取后的RNA通过ND1000 nanodrop分光分度仪(Thermo Scientific,USA)定量，并通过AgilentBioanalyzer 2100(Agilent,USA)对RNA的完整度(RIN)进行评估。浓度大于100纳克/微升和RIN评估大于8的RNA样本通过

Single Cell/Low Input RNA Library PrepKit for Illumina制备转录组文库，在illumina Novaseq测序仪上得到每个样本大于12Gb的转录组测序(RNA-Seq)数据。原始fastq数据通过Partek Flow(Partek，USA)的STAR分析流程，得到全转录组内的基因RNA表达的量化数据。通过ANOVA对肝细胞癌和慢性乙肝病毒患者的外周血内白血细胞RNA表达的分析，得到针对肝细胞癌患者的特异的RNA水平的生物标志物。候选基因(即候选生物标志物)要满足以下条件：HCC与CHB样本的对比中，上调基因的倍数要大于2，下调基因的倍数要小于-2，p值小于0.01。最终有7个基因被选择进行RT-qPCR验证。

2.2在500例患者(110例HCC和390例CHB)的训练组中建立了一种基于RT-qPCR的拷贝数量化检测方法，建立HIR-肝癌诊断方法(HIR即人类免疫应答(Human ImmuneResponse))；

通过RT-qPCR方法对于RNA-Seq所发现的候选生物标志物进行验证。

用于RT-qPCR验证的引物序列如下：

200纳克的总RNA通过高通量cDNA RT试剂盒(High Capacity cDNA RT kit)(LifeTechnologies，USA)逆转录成cDNA，并使用HIR-肝癌检测qPCR试剂盒对1/50的逆转录cDNA产物进行检测。使用比较循环阈值(Ct)方法，将候选基因的表达与细胞内参照基因(HPRT1)做标准化对比，在后续分析中应用-dCt作为候选基因的标准化表达量。候选基因的标准化表达，-dCt＝HPRT1基因的Ct值-候选基因的Ct值。

从110例HCC和390例CHB样本中得到的每个候选基因对比参照基因的相对于内参HPRT1的标准化表达量的RT-qPCR数据，通过SPSS软件生成受试者工作特征(ROC)曲线。ROC曲线的线下面积(AUC)作为评价单一候选基因作为分别HCC的生物标志物。通过倒退逐步法逻辑回归构建模型，计算多个候选基因的联合区别HCC的ROC曲线，从而得到一个最小集的HIR-肝癌诊断的概率值(0-1)。模型中包括BTBD19基因、FOSB基因和SCUBE1基因,SHE基因，PM20D1基因，ZFP57基因。HIR-肝癌诊断的概率算法为1/(1+e^(-(4.36+83.19×BTBD19+41.53×FOSB+17.65×SCUBE1+3.25×SHE-27.5×PM20D1-6.75×ZFP57))，其中BTBD19、FOSB和SCUBE1,SHE，PM20D1，ZFP57分别代表基因HPRT1标准化表达的-dCt值。

根据约登指数(Youden index)方法的建议，选择0.76为截止值来最优化应用于临床检测时的敏感性和特异性。HIR-肝癌诊断可能概率大于0.76表明该样本可以认为有肝细胞癌。

2.3在200例患者(46例HCC和154例CHB)的独立验证组中用该RT-qPCR方法进行了回顾性检测。

通过2.2所述方法,获得BTBD19基因、FOSB基因和SCUBE1基因,SHE基因，PM20D1基因，ZFP57基因在循环免疫细胞中的标准化表达量，并通过1/(1+e^(-(4.36+83.19×BTBD19+41.53×FOSB+17.65×SCUBE1+3.25×SHE-27.5×PM20D1-6.75×ZFP57)))算出HIR-肝癌检测的概率值。以0.76为截止值，计算灵敏度和特异性。

2.4AFP检测

作为对比，对上述训练组和验证组的患者进行AFP检测，具体是：采用临床ELISAAFP检测试剂盒(上海透景生命科技股份有限公司，货号AFP001)检测患者血清中APF浓度，血清AFP浓度大于20ng/ml被定义为AFP阳性样本，血清AFP浓度低于20ng/ml被定义为AFP阴性样本。

3.统计分析

采用事后检验(post hoc)配对Bonferroni校正t检验的方差分析(ANOVA)分析，分析CHB组和HCC组之间样本均值差异的显著性。

使用单变量二元逻辑回归分析确定单个生物标志物的预测准确性。各独立生物标志物的p值由Wald卡方检验确定，截止值为p<0.05。ROC分析还显示了每个生物标志物的区分能力。采用逐步正演的多因素二元逻辑回归方法，确定生物标志物联合使用时的预测精度。

表1示出了本实施例的样本的具体信息。

表1

“*”表示同一组样本中肝细胞癌与慢性乙肝的患者样本分布差异有统计学意义，p<0.05。“^”表明验证组与训练组肝细胞癌与慢性乙肝患者样本差异有统计学意义(p<0.05)。

4.结果

4.1循环免疫细胞识别肝细胞癌的HIR-肝癌诊断分子标志物的鉴定

为了筛选出循环免疫细胞来源的生物标志物，发明人对10人循环免疫细胞样本(其中10名HCC患者、10名CHB患者)进行了全转录组RNA测序(RNA-Seq)，比较他们的转录组差异以期找出能区分CHB和HCC的RNA标志物。

进行了主成分分析，结果表明循环免疫细胞内具有识别肝细胞癌的特异性RNA表达。具体地，主成份分析显示CHB和HCC两组循环免疫细胞样本转录产物差别很大。使用逆转录定量PCR(RT-qPCR)对这些转录产物进行定量，六个转录产物，BTBD19基因、FOSB基因和SCUBE1基因,SHE基因，PM20D1基因，ZFP57基因被证明在肝细胞癌和慢乙肝循环免疫细胞样本之间具有差异表达(p<0.05)。

4.2HIR-肝癌诊断分子标志物在训练组准确分别HCC样本

为了评估这六个基因的诊断价值，发明人对一组训练样本500例(110例HCC患者和390例CHB患者的循环免疫细胞RNA样本做了RT-qPCR，并以HPRT1作为内参计算-dCt的标准化表达值。

单因素ROC分析显示，AFP的ROC曲线(AUC)下面积为0.59，AFP是HCC临床诊断最常用的血清标志物。对于每个单独的生物标志物，如3所示，BTBD19基因、FOSB基因和SCUBE1基因,SHE基因，PM20D1基因，ZFP57基因的AUC值处于0.70-0.94之间。

然后，对上述检测样本进行多因素二元逻辑回归分析，分析这6个基因随机组合对区分CHB和HCC的诊断准确性。结果发现，在这组500人的训练组中，BTBD19基因、FOSB基因和SCUBE1基因,SHE基因，PM20D1基因，ZFP57基因所组成的HIR-肝癌诊断标志物，具有更高的AUC为0.95(CI:0.9-1.00)，明显优于单独的6个基因中的任何一个,。

在此基础上本发明建立了一种基于上述HIR-肝癌诊断标志物的标准化拷贝数定量RT-qPCR方法。HCC的发生概率＝1/(1+e^(-(4.36+83.19×BTBD19+41.53×FOSB+17.65×SCUBE1+3.25×SHE-27.5×PM20D1-6.75×ZFP57)))，其中BTBD19、FOSB，SCUBE1,SHE，PM20D1，ZFP57为用RT-qPCR检测，并以HPRT1作为内参计算-dCt的标准化表达值。根据约登指数(Youden index)方法的建议，选择0.76为截止值来最优化应用于临床检测时的敏感性和特异性。HCC可能概率大于0.76表明该样本可以认为有肝细胞癌。

在0.76的截止点处，基于HIR-肝癌检测方法在该训练组中区分HCC的敏感性为92％、特异性为92％，整体准确率为92％。相比之下，如表2所示，AFP，临床上使用阈值为20ng/ml，在同训练组中识别肝细胞癌的敏感性为50％，特异性为64％，整体准确率为57％。

在200例独立验证组患者中验证了该HIR-肝癌检测方法和逻辑方程的有效性，其中包括154例CHB和46例HCC。基于HIR-肝癌检测获得的AUC为0.97(CI:0.94-1.00)，显著优于血清AFP的AUC为0.49(CI:0.35-0.62)。如表2所示，以0.76为截止值，HIR-肝癌诊断方法检测在该组的灵敏度为91％，特异性为95％，总准确率为93％，明显优于AFP，灵敏度为26％，特异性为81％，总准确率为53％。

4.3评估HIR-肝癌诊断标志物对不同亚组HCC患者的检测性能

随后对来自训练组和验证组的700例样本进行汇总为156HCC和544CHB组成的病例组，通过HIR-肝癌诊断1/(1+e^(-(4.36+83.19×BTBD19+41.53×FOSB+17.65×SCUBE1+3.25×SHE-27.5×PM20D1-6.75×ZFP57))所得到的肝癌概率，对HIR-肝癌诊断标志物在其中不同亚组HCC患者的检测性能进行评估。

如表2所示，HIR-肝癌诊断标志物在该组合组中达到AUC0.97(CI:0.96-0.99)，敏感性为92％，特异性为93％，总体精确度为92％。在收集的所有HCC患者中有超过一半的患者AFP低于20ng/ml的阈值，因此AFP作为检测HCC的生物诊断标志物无法满足灵敏性和特异性的要求。在一组83位AFP阴性(血清AFP<20ng/ml)HCC患者和544位CHB患者中，如表2所示，HIR-肝癌诊断标志物能够区分CHB和AFP阴性HCC样本的AUC值为0.98(CI:0.978-0.99)。此外，在51例AFP阳性(血清AFP≥20ng/ml)HCC和相同的544例CHB样本中，如表2所示，HIR-肝癌诊断标志物区分AFP阳性HCC和CHB的AUC值为0.96(CI:0.94-0.99)，与以上类似。而在这个纯AFP阳性组中，AFP区分HCC和CHB样本的特异性只有70％。因此，HIR-肝癌诊断标志物的检测性能不依赖于患者的AFP水平。

根据BCLC指南，早期HCC患者才有治疗方案可供选择。因此，发明人评估了HIR-肝癌诊断标志物对检测早期HCC的有效性。早期肝癌患者被定义为BCLC分型0(一个肿瘤病灶，病灶直径不超过2厘米)、或A期(不超过三个子灶，每个子灶直径不超过3厘米)的患者。在71例早期肝细胞癌和544例CHB所组成的验证组中，计算HIR-肝癌诊断所得出的肝癌概率。如表2所示，HIR-肝癌诊断标志物可以检测出早期HCC的AUC值为0.98(CI:0.96-0.99)，而AFP的AUC则低得多，为0.56(CI:0.46-0.65)。在74例BCLC B期、C期或D期的晚期HCC患者和544例CHB患者中，如表2所示，HIR-肝癌诊断标志物能够检测出晚期HCC的AUC为0.98(CI:0.95-0.99)，而AFP的AUC为0.55(CI:0.46-0.64)。

表2单个或联合生物标志物检测HCC的诊断性能

HIR-肝癌诊断是由BTBD19基因、FOSB基因和SCUBE1基因,SHE基因，PM20D1基因，ZFP57基因组成的RNA信号；早期HCC，HCC BCLC 0期或A期；中晚期HCC，HCC BCLC B期、C期或D期；AFP阴性HCC，血清AFP<20ng/ml；AFP阳性HCC，血清AFP>20ng/ml；NPV，阴性预测值；PPV，阳性预测值。

实施例2：用于检测肝癌的试剂盒

用于检测肝癌的RT-qPCR试剂盒包括如下预混液

上述阳性对照为HIR-肝癌检测阈值为大于0.76的人造样本，其制作方法为通过把检测基因PCR的扩增子克隆在T-easy vector,然后根据肝癌病人样本检测基因分布的90％percentile(百分位)的拷贝值，在阳性对照样本中用扩增子的克隆制备出相对应的拷贝数。阳性对照样本得到的HIR-肝癌检测阈值是通过本文中所描述的RT-qPCR方法来确定的。

待测基因的定量PCR预混液的组成成分/25个测试的试剂盒为

2x定量PCR主预混液	137.5ul
		待测基因的正向引物10uM	6.875ul
待测基因的反向引物10uM	6.875ul
		无核酸酶水	68.75ul
总量	220ul

上述各引物由IDT公司(Integrated DNA Technologies,Inc.)合成，PCR主预混液购买自KAPA Biosystems公司。

实施例3：肝癌的检测

1.血样收集和循环免疫细胞的纯化

由专业护士从实施例1的训练组和验证组患者分别抽取3ml静脉血，装在EDTA-K2采血管中(BD 367861)，并马上颠倒混匀。全血采血后需在2小时内进行预处理。在预处理前，采好的血样必须在4℃保存。取1ml EDTA-K2处理过的全血与10ml ACK裂解缓冲液(A1049201,ThermoFisher)充分混匀，室温静置10分钟。室温离心300g，5分钟，沉淀循环免疫细胞。加5ml冷藏PBS，移液枪反复吹打5次，使沉淀充分混匀。再次室温离心300g，5分钟，沉淀循环免疫细胞。弃上清，把循环免疫细胞沉淀用700微升的RNAzol RT试剂(MRC,RN900)充分溶解，负80度冰箱保存至RNA提取。

2.RNA提取，制库和RNA-seq二代测序

循环免疫细胞的总RNA通过RNAzol-RT(MRC,USA)试剂进行提取。提取后的RNA通过ND1000 nanodrop分光分度仪(Thermo Scientific,USA)定量，并通过AgilentBioanalyzer 2100(Agilent,USA)对RNA的完整度(RIN)进行评估。浓度大于100ng/ul，RIN大于8的RNA样本进行逆转录。

3.逆转录

200ng总RNA通过High Capacity cDNA RT试剂盒(LifeTechnologies，USA)逆转录成cDNA。

逆转录反应体系：

组分	体积
		200ng总RNA	2.0ul
10X RT缓冲液	2.0μL
		25X dNTP Mix(100mM)	1.0μL
10X RT随机引物	2.0μL
		MultiScribeTM逆转录酶	1.0μL
无核酸酶水	12.0μL
		反应总体积	20.0μL

逆转录反应条件：

设置	步骤1	步骤2	步骤3	步骤4
					温度	25℃	37℃	85℃	4℃
时间	10分钟	120分钟	5分钟	∞

4.检测

采用实施例2的RT-qPCR试剂盒进行检测，5倍稀释的逆转录反应产物作为试剂盒的待测输入样本。96孔板建议上样排列方式如图10所示。

每个基因的定量PCR反应设置是：

基因特异性定量PCR预混液	8ul
		5x稀释的逆转录产物	2ul

每个基因的定量PCR反应条件是：

通过Biorad CFX96实时定量PCR仪，在荧光量达到150时的时候确定Ct值。通过-dCt的方法获得每个基因的标准化表达。并通过1/(1+e^(-(4.36+83.19×BTBD19+41.53×FOSB+17.65×SCUBE1+3.25×SHE-27.5×PM20D1-6.75×ZFP57))算出肝癌检测的概率值。以0.76为截止值，计算灵敏度和特异性。结果与实施例1中的结果一致。

实施例4：用于检测肝癌的生物标志物的筛选

1.样本来源

研究对象分为慢性乙型肝炎患者(CHB患者)组和原发性肝癌患者(HCC患者)组，从这些研究对象的全血样本中通过红血细胞裂解法得到有核的白血细胞。

慢性乙型肝炎患者的全血样本在患者前往青岛大学附属医院就诊期间通过医院收集。慢性乙型肝炎患者是指在过去6个月携带HBsAg的慢性HBV携带者，HBV DNA血液浓度高于1x10³拷贝/mL，血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平持续或间歇性升高。肝硬化的状况根据具体临床环境下的检测结果评估：影像学(超声、CT扫描或MRI)；瞬时弹性成像；脾肿大；腹水或食管或胃静脉曲张。

原发性肝癌患者(治疗前)的血液样本收集自HCC患者在青岛大学附属医院诊断期间。通过术后组织病理学来证实可切除的HCC病例。根据EASL标准通过影像学方法确诊不可切除的HCC病例。

所有样本均按照相关机构审查委员会批准的方案采集，采集样本前需征得所有受试者的知情同意。

2.方法

按照图1所示的流程进行如下操作：

2.1在最初的发现阶段，有20个(10个HCC,10个CHB)样本用来筛选区别CHB和HCC患者的生物标志物。

血样收集和循环免疫细胞的纯化

由专业护士抽取3ml静脉血，装在EDTA-K2采血管中(BD 367861)，并马上颠倒混匀。全血采血后需在2小时内进行预处理。在预处理前，采好的血样必须在4℃保存。取1mlEDTA-K2处理过的全血与10ml ACK裂解缓冲液(A1049201,ThermoFisher)充分混匀，室温静置10分钟。室温离心300g，5分钟，沉淀循环免疫细胞。加5ml冷藏PBS，移液枪反复吹打5次，使沉淀充分混匀。再次室温离心300g，5分钟，沉淀循环免疫细胞。弃上清，把循环免疫细胞沉淀用700微升的RNAzol RT试剂(MRC,RN900)充分溶解，负80度冰箱保存至RNA提取。

RNA提取，制库和RNA-seq二代测序

循环免疫细胞的总RNA通过RNAzol-RT(MRC,USA)试剂进行提取。提取后的RNA通过ND1000 nanodrop分光分度仪(Thermo Scientific,USA)定量，并通过AgilentBioanalyzer 2100(Agilent,USA)对RNA的完整度(RIN)进行评估。浓度大于100纳克/微升和RIN评估大于8的RNA样本通过

Single Cell/Low Input RNA Library PrepKit for Illumina制备转录组文库，在illumina Novaseq测序仪上得到每个样本大于12Gb的转录组测序(RNA-Seq)数据。原始fastq数据通过Partek Flow(Partek，USA)的STAR分析流程，得到全转录组内的基因RNA表达的量化数据。通过ANOVA对肝细胞癌和慢性乙肝病毒患者的外周血内白血细胞RNA表达的分析，得到针对肝细胞癌患者的特异的RNA水平的生物标志物。候选基因(即候选生物标志物)要满足以下条件：HCC与CHB样本的对比中，上调基因的倍数要大于2，下调基因的倍数要小于-2，p值小于0.01。最终有7个基因被选择进行RT-qPCR验证。

2.2在500例患者(110例HCC和390例CHB)的训练组中建立了一种基于RT-qPCR的拷贝数量化检测方法，建立HIR-肝癌诊断方法(HIR即人类免疫应答(Human ImmuneResponse))；

通过RT-qPCR方法对于RNA-Seq所发现的候选生物标志物进行验证。

用于RT-qPCR验证的引物序列如下：

200纳克的总RNA通过高通量cDNA RT试剂盒(High Capacity cDNA RT kit)(LifeTechnologies，USA)逆转录成cDNA，并使用HIR-肝癌检测qPCR试剂盒对1/50的逆转录cDNA产物进行检测。使用比较循环阈值(Ct)方法，将候选基因的表达与细胞内参照基因(HPRT1)做标准化对比，在后续分析中应用-dCt作为候选基因的标准化表达量。候选基因的标准化表达，-dCt＝HPRT1基因的Ct值-候选基因的Ct值。

从110例HCC和390例CHB样本中得到的每个候选基因对比参照基因的相对于内参HPRT1的标准化表达量的RT-qPCR数据，通过SPSS软件生成受试者工作特征(ROC)曲线。ROC曲线的线下面积(AUC)作为评价单一候选基因作为分别HCC的生物标志物。通过倒退逐步法逻辑回归构建模型，计算多个候选基因的联合区别HCC的ROC曲线，从而得到一个最小集的HIR-肝癌诊断的概率值(0-1)。模型中包括ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因。HIR-肝癌诊断的概率算法为1/(1+e^(-(-2.47+0.092×ABCA1+21.75×BTBD19+0.752×FOS-10.544×SHE)))，其中ABCA1、BTBD19、FOS和SHE分别代表基因HPRT1标准化表达的-dCt值。

根据约登指数(Youden index)方法的建议，选择0.5为截止值来最优化应用于临床检测时的敏感性和特异性。HIR-肝癌诊断可能概率大于0.5表明该样本可以认为有肝细胞癌。

2.3在200例患者(46例HCC和154例CHB)的独立验证组中用该RT-qPCR方法进行了回顾性检测。

通过2.2所述方法,获得ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因在循环免疫细胞中的标准化表达量，并通过1/(1+e^(-(-2.47+0.092×ABCA1+21.75×BTBD19+0.752×FOS-10.544×SHE)))算出HIR-肝癌检测的概率值。以0.5为截止值，计算灵敏度和特异性。

2.4AFP检测

作为对比，对上述训练组和验证组的患者进行AFP检测，具体是：采用临床ELISAAFP检测试剂盒(上海透景生命科技股份有限公司，货号AFP001)检测患者血清中APF浓度，血清AFP浓度大于20ng/ml被定义为AFP阳性样本，血清AFP浓度低于20ng/ml被定义为AFP阴性样本。

3.统计分析

采用事后检验(post hoc)配对Bonferroni校正t检验的方差分析(ANOVA)分析，分析CHB组和HCC组之间样本均值差异的显著性。

使用单变量二元逻辑回归分析确定单个生物标志物的预测准确性。各独立生物标志物的p值由Wald卡方检验确定，截止值为p<0.05。ROC分析还显示了每个生物标志物的区分能力。采用逐步正演的多因素二元逻辑回归方法，确定生物标志物联合使用时的预测精度。

表3示出了本实施例的样本的具体信息。

表3

“*”表示同一组样本中肝细胞癌与慢性乙肝的患者样本分布差异有统计学意义，p<0.05。“^”表明验证组与训练组肝细胞癌与慢性乙肝患者样本差异有统计学意义(p<0.05)。

4.结果

4.1循环免疫细胞识别肝细胞癌的HIR-肝癌诊断分子标志物的鉴定

为了筛选出循环免疫细胞来源的生物标志物，发明人对10人循环免疫细胞样本(其中10名HCC患者、10名CHB患者)进行了全转录组RNA测序(RNA-Seq)，比较他们的转录组差异以期找出能区分CHB和HCC的RNA标志物。

图2显示了主成分分析表明循环免疫细胞内具有识别肝细胞癌的特异性RNA表达。由图2可以看出，主成份分析显示CHB和HCC两组循环免疫细胞样本转录产物差别很大。使用逆转录定量PCR(RT-qPCR)对这些转录产物进行定量，四个转录产物，ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因被证明在肝细胞癌和慢乙肝循环免疫细胞样本之间具有差异表达(p<0.05)。

4.2HIR-肝癌诊断分子标志物在训练组准确分别HCC样本

为了评估这四个基因的诊断价值，发明人对一组训练样本500例(110例HCC患者和390例CHB患者的循环免疫细胞RNA样本做了RT-qPCR，并以HPRT1作为内参计算-dCt的标准化表达值。

单因素ROC分析显示，AFP的ROC曲线(AUC)下面积为0.59，AFP是HCC临床诊断最常用的血清标志物。对于每个单独的生物标志物，如图3所示，ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因的AUC值处于0.75-0.94之间。

然后，对上述检测样本进行多因素二元逻辑回归分析，分析这4个基因随机组合对区分CHB和HCC的诊断准确性。结合图3和图4，结果发现，在这组500人的训练组中，ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因所组成的HIR-肝癌诊断标志物，具有更高的AUC为0.95(CI:0.9-1.00)，明显优于单独的4个基因中的任何一个,。

在此基础上本发明建立了一种基于上述HIR-肝癌诊断标志物的标准化拷贝数定量RT-qPCR方法。HCC的发生概率＝1/(1+e^(-(-2.47+0.092×ABCA1+21.75×BTBD19+0.752×FOS-10.544×SHE)))，其中ABCA1、BTBD19、FOS，和SHE为用RT-qPCR检测，并以HPRT1作为内参计算-dCt的标准化表达值。根据约登指数(Youden index)方法的建议，选择0.5为截止值来最优化应用于临床检测时的敏感性和特异性。HCC可能概率大于0.55表明该样本可以认为有肝细胞癌。

如图4所示，在0.5的截止点处，基于HIR-肝癌检测方法在该训练组中区分HCC的敏感性为92％、特异性为92％，整体准确率为92％。相比之下，如表4所示，AFP，临床上使用阈值为20ng/ml，在同训练组中识别肝细胞癌的敏感性为50％，特异性为64％，整体准确率为57％。

在200例独立验证组患者中验证了该HIR-肝癌检测方法和逻辑方程的有效性，其中包括154例CHB和46例HCC。如图5所示，基于HIR-肝癌检测获得的AUC为0.97(CI:0.94-1.00)，显著优于血清AFP的AUC为0.49(CI:0.35-0.62)。如表4所示，以0.76为截止值，HIR-肝癌诊断方法检测在该组的灵敏度为91％，特异性为95％，总准确率为93％，明显优于AFP，灵敏度为26％，特异性为81％，总准确率为53％。

4.3评估HIR-肝癌诊断标志物对不同亚组HCC患者的检测性能

随后对来自训练组和验证组的700例样本进行汇总为156HCC和544CHB组成的病例组，通过HIR-肝癌诊断1/(1+e^(-(-2.47+0.092×ABCA1+21.75×BTBD19+0.752×FOS-10.544×SHE)))所得到的肝癌概率，对HIR-肝癌诊断标志物在其中不同亚组HCC患者的检测性能进行评估。

如表4所示，HIR-肝癌诊断标志物在该组合组中达到AUC0.97(CI:0.96-0.99)，敏感性为92％，特异性为93％，总体精确度为92％。在收集的所有HCC患者中有超过一半的患者AFP低于20ng/ml的阈值，因此AFP作为检测HCC的生物诊断标志物无法满足灵敏性和特异性的要求。在一组83位AFP阴性(血清AFP<20ng/ml)HCC患者和544位CHB患者中，如图6和表4所示，HIR-肝癌诊断标志物能够区分CHB和AFP阴性HCC样本的AUC值为0.98(CI:0.978-0.99)。此外，在51例AFP阳性(血清AFP≥20ng/ml)HCC和相同的544例CHB样本中，如图7和表4所示，HIR-肝癌诊断标志物区分AFP阳性HCC和CHB的AUC值为0.96(CI:0.94-0.99)，与以上类似。而在这个纯AFP阳性组中，AFP区分HCC和CHB样本的特异性只有70％。因此，HIR-肝癌诊断标志物的检测性能不依赖于患者的AFP水平。

根据BCLC指南，早期HCC患者才有治疗方案可供选择。因此，发明人评估了HIR-肝癌诊断标志物对检测早期HCC的有效性。早期肝癌患者被定义为BCLC分型0(一个肿瘤病灶，病灶直径不超过2厘米)、或A期(不超过三个子灶，每个子灶直径不超过3厘米)的患者。在71例早期肝细胞癌和544例CHB所组成的验证组中，计算HIR-肝癌诊断所得出的肝癌概率。如图8和表4所示，HIR-肝癌诊断标志物可以检测出早期HCC的AUC值为0.98(CI:0.96-0.99)，而AFP的AUC则低得多，为0.56(CI:0.46-0.65)。在74例BCLC B期、C期或D期的晚期HCC患者和544例CHB患者中，如图9和表4所示，HIR-肝癌诊断标志物能够检测出晚期HCC的AUC为0.98(CI:0.95-0.99)，而AFP的AUC为0.55(CI:0.46-0.64)。

表4单个或联合生物标志物检测HCC的诊断性能

HIR-肝癌诊断是由ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因组成的RNA信号；早期HCC，HCC BCLC 0期或A期；中晚期HCC，HCC BCLC B期、C期或D期；AFP阴性HCC，血清AFP<20ng/ml；AFP阳性HCC，血清AFP>20ng/ml；NPV，阴性预测值；PPV，阳性预测值。

实施例5：用于检测肝癌的试剂盒

用于检测肝癌的RT-qPCR试剂盒包括如下预混液

上述阳性对照为HIR-肝癌检测阈值为大于0.76的人造样本，其制作方法为通过把检测基因PCR的扩增子克隆在T-easy vector,然后根据肝癌病人样本检测基因分布的90％percentile(百分位)的拷贝值，在阳性对照样本中用扩增子的克隆制备出相对应的拷贝数。阳性对照样本得到的HIR-肝癌检测阈值是通过本文中所描述的RT-qPCR方法来确定的。

待测基因的定量PCR预混液的组成成分/25个测试的试剂盒为

2x定量PCR主预混液	137.5ul
		待测基因的正向引物10uM	6.875ul
待测基因的反向引物10uM	6.875ul
		无核酸酶水	68.75ul
总量	220ul

上述各引物由IDT公司(Integrated DNA Technologies,Inc.)合成，PCR主预混液购买自KAPA Biosystems公司。

实施例6：肝癌的检测

1.血样收集和循环免疫细胞的纯化

由专业护士从实施例3的训练组和验证组患者分别抽取3ml静脉血，装在EDTA-K2采血管中(BD 367861)，并马上颠倒混匀。全血采血后需在2小时内进行预处理。在预处理前，采好的血样必须在4℃保存。取1ml EDTA-K2处理过的全血与10ml ACK裂解缓冲液(A1049201,ThermoFisher)充分混匀，室温静置10分钟。室温离心300g，5分钟，沉淀循环免疫细胞。加5ml冷藏PBS，移液枪反复吹打5次，使沉淀充分混匀。再次室温离心300g，5分钟，沉淀循环免疫细胞。弃上清，把循环免疫细胞沉淀用700微升的RNAzol RT试剂(MRC,RN900)充分溶解，负80度冰箱保存至RNA提取。

2.RNA提取，制库和RNA-seq二代测序

循环免疫细胞的总RNA通过RNAzol-RT(MRC,USA)试剂进行提取。提取后的RNA通过ND1000 nanodrop分光分度仪(Thermo Scientific,USA)定量，并通过AgilentBioanalyzer 2100(Agilent,USA)对RNA的完整度(RIN)进行评估。浓度大于100ng/ul，RIN大于8的RNA样本进行逆转录。

3.逆转录

200ng总RNA通过High Capacity cDNA RT试剂盒(LifeTechnologies，USA)逆转录成cDNA。

逆转录反应体系：

组分	体积
		200ng总RNA	2.0ul
10X RT缓冲液	2.0μL
		25X dNTP Mix(100mM)	1.0μL
10X RT随机引物	2.0μL
		MultiScribeTM逆转录酶	1.0μL
无核酸酶水	12.0μL
		反应总体积	20.0μL

逆转录反应条件：

设置	步骤1	步骤2	步骤3	步骤4
					温度	25℃	37℃	85℃	4℃
时间	10分钟	120分钟	5分钟	∞

4.检测

采用实施例5的RT-qPCR试剂盒进行检测，5倍稀释的逆转录反应产物作为试剂盒的待测输入样本。96孔板建议上样排列方式如图10所示。

每个基因的定量PCR反应设置是：

基因特异性定量PCR预混液	8ul
		5x稀释的逆转录产物	2ul

每个基因的定量PCR反应条件是：

通过Biorad CFX96实时定量PCR仪，在荧光量达到150时的时候确定Ct值。通过-dCt的方法获得每个基因的标准化表达。并通过1/(1+e^(-(-2.47+0.092×ABCA1+21.75×BTBD19+0.752×FOS-10.544×SHE)))算出肝癌检测的概率值。以0.5为截止值，计算灵敏度和特异性。结果与实施例1中的结果一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本方面的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、修饰、组合、改变、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

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序列表

<110> 绍兴积准生物科技有限公司

<120> 一种用于检测肝癌的生物标志物组及其应用

<150> 2019106647234

<151> 2019-07-22

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgctccact cctaaacttc ag 22

<210> 2

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<212> DNA

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caaacatcac tgtatcgcgg 20

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgagtggc tacagcagtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aactgatctg tctccgcctg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtgtgaaga cattgacgag 20

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgtcactaa ggaagaagcc a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcacctacat caacaggctc 20

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<212> DNA

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aaatgatgac cgtctcttgc t 21

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggcaaatgag tttcccttcc 20

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<211> 23

<212> DNA

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caatgttctt cgtgagttct agg 23

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<212> DNA

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ctttaccagg atgttatgtc gg 22

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ttcttcttgc cttctgaaag g 21

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<212> DNA

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tgacactggc aaaacaatgc a 21

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<212> DNA

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ggtccttttc accagcaagc t 21

<210> 15

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<212> DNA

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gacaatgcag aacccttcac 20

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aaagccgcca tacctaaact c 21

<210> 17

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<212> DNA

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caaggtggaa cagttatctc cag 23

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<212> DNA

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agtcagatca agggaagcca 20

<210> 19

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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aggcttccca ccccgtcggc tgcctgggca gactcccagc cagggcctct ttcgccgccg 60

ccgccgccgc cagccagcca gcttcttccc aggaccatag gccactccag cctcagcttc 120

tcctggcccc ctccctgtgt ctgttcctgt ccccgagcct ctggcctctg atgccttcag 180

gagcttgggc ctctcctgct ccactcctaa acttcagctt ctcagcaaac aggcctccca 240

agtccctgct tctccctctc aggccttgct aacctcacca gctctagggc ctggccaggc 300

ctcccaggct ccctcctcca ccccaacccc ttctcactca tggagccctt gggactggtc 360

gtgcatggga aagctgaacc tttttccgca gcactccgaa gccttgtcaa caacccgcga 420

tacagtgatg tttgcttcgt ggttggtcaa gaacggcagg aggtatttgc ccatcggtgc 480

ttgttggcct gtagatgcaa cttcttccag cgacttctgg gcacagagcc aggccccggg 540

gtgcccagtc ctgtggtgct aagcactgtg ccaactgagg ccttcctggc agtgctggag 600

ttcctatata ccaacagtgt caagctgtac cgccactctg tgctggaagt gctgacagcg 660

gctgtggagt atgggctgga ggaactgaga gagctgtgcc tgcagtttgt ggtgaaggtg 720

ctggatgtgg acttggtttg tgaggccctg caggtggccg taacctttgg cctggggcag 780

ctgcaggagc gctgcgtggc tttcatagag gcccacagcc aggaggccct ccggacccga 840

ggcttcctgg agctgtcggc ggccgcgctg ctgcccctgc tccgcagcga caagctctgc 900

gtggacgagg ctgaactggt ccgcgcggcc cgaagctggg cgcgcgtggg cgcggcggtg 960

ctggagcggc cggtggctga ggtggcggcc ccggtggtga aagagctgag actagccttg 1020

ctggccccgg cggagctgag cgccctggaa gagcagaacc ggcaggaacc actcatcccg 1080

gtggagcaga ttgtggaggc gtggaaatgc catgccctgc ggagagggga tgaggcccgg 1140

ggcgccccgt gtcgccgccg gagaggcacc ctgccccggg agcatcaccg ctttctggac 1200

ctgtccttca aatgatccaa cgccgggact cgcagggagc cctcgacccg cccagctgag 1260

cctgccccaa actacagctc ccgaagtgct cggcgttcgg agcgggcttc cgttcccagc 1320

gtgcccagtg agccgggcgc cggaagaacc gttgtctgcc acgcgcagcc ccttgtgcgg 1380

gatcaagccc gtgtgggcga ggtggggtcg ggccgggcag ggcttgggct gggcctccct 1440

gagggggtga aactcgaaaa cgaggatttc cttcgttcca caccctgact ctacgccctg 1500

cccctgggca ttgtcgtcta ctagtctatt ctgatgactc ccacatatct atctgttcag 1560

ctcagctccc tc 1572

<210> 20

<211> 3775

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

attcataaga ctcagagcta cggccacggc agggacacgc ggaaccaaga cttggaaact 60

tgattgttgt ggttcttctt gggggttatg aaatttcatt aatctttttt tttccgggga 120

gaaagttttt ggaaagattc ttccagatat ttcttcattt tcttttggag gaccgactta 180

ctttttttgg tcttctttat tactcccctc cccccgtggg acccgccgga cgcgtggagg 240

agaccgtagc tgaagctgat tctgtacagc gggacagcgc tttctgcccc tgggggagca 300

acccctccct cgcccctggg tcctacggag cctgcacttt caagaggtac agcggcatcc 360

tgtgggggcc tgggcaccgc aggaagactg cacagaaact ttgccattgt tggaacggga 420

cgttgctcct tccccgagct tccccggaca gcgtactttg aggactcgct cagctcaccg 480

gggactccca cggctcaccc cggacttgca ccttacttcc ccaacccggc catagccttg 540

gcttcccggc gacctcagcg tggtcacagg ggcccccctg tgcccaggga aatgtttcag 600

gctttccccg gagactacga ctccggctcc cggtgcagct cctcaccctc tgccgagtct 660

caatatctgt cttcggtgga ctccttcggc agtccaccca ccgccgccgc ctcccaggag 720

tgcgccggtc tcggggaaat gcccggttcc ttcgtgccca cggtcaccgc gatcacaacc 780

agccaggacc tccagtggct tgtgcaaccc accctcatct cttccatggc ccagtcccag 840

gggcagccac tggcctccca gcccccggtc gtcgacccct acgacatgcc gggaaccagc 900

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agtgaagttc aagtcctcgg cgaccccttc cccgttgtta acccttcgta cacttcttcg 1500

tttgtcctca cctgcccgga ggtctccgcg ttcgccggcg cccaacgcac cagcggcagt 1560

gaccagcctt ccgatcccct gaactcgccc tccctcctcg ctctgtgaac tctttagaca 1620

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gaggagagag aggggaagag acaaagtggg tgtgtggcct ccctggctcc tccgtctgac 1740

cctctgcggc cactgcgcca ctgccatcgg acaggaggat tccttgtgtt ttgtcctgcc 1800

tcttgtttct gtgccccggc gaggccggag agctggtgac tttggggaca gggggtggga 1860

aggggatgga cacccccagc tgactgttgg ctctctgacg tcaacccaag ctctggggat 1920

gggtggggag gggggcgggt gacgcccacc ttcgggcagt cctgtgtgag gattaaggga 1980

cgggggtggg aggtaggctg tggggtgggc tggagtcctc tccagagagg ctcaacaagg 2040

aaaaatgcca ctccctaccc aatgtctccc acacccaccc tttttttggg gtgcctaggt 2100

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ctctttactc tgggcagaag tgagcccccc ccttaaaggg aattcgatgc ccccctagaa 2220

taatctcatc cccccacccg acttcttttg aaatgtgaac gtccttcctt gactgtctag 2280

ccactccctc ccagaaaaac tggctctgat tggaatttct ggcctcctaa ggctccccac 2340

cccgaaatca gcccccagcc ttgtttctga tgacagtgtt atcccaagac cctgccccct 2400

gccagccgac cctcctggcc ttcctcgttg ggccgctctg atttcaggca gcaggggctg 2460

ctgtgatgcc gtcctgctgg agtgatttat actgtgaaat gagttggcca gattgtgggg 2520

tgcagctggg tggggcagca cacctctggg gggataatgt ccccactccc gaaagccttt 2580

cctcggtctc ccttccgtcc atcccccttc ttcctcccct caacagtgag ttagactcaa 2640

gggggtgaca gaaccgagaa gggggtgaca gtcctccatc cacgtggcct ctctctctct 2700

cctcaggacc ctcagccctg gcctttttct ttaaggtccc ccgaccaatc cccagcctag 2760

gacgccaact tctcccaccc cttggcccct cacatcctct ccaggaaggg agtgaggggc 2820

tgtgacattt ttccggagaa gatttcagag ctgaggcttt ggtaccccca aacccccaat 2880

atttttggac tggcagactc aaggggctgg aatctcatga ttccatgccc gagtccgccc 2940

atccctgacc atggttttgg ctctcccacc ccgccgttcc ctgcgcttca tctcatgagg 3000

atttctttat gaggcaaatt tatatttttt aatatcgggg ggtggaccac gccgccctcc 3060

atccgtgctg catgaaaaac attccacgtg ccccttgtcg cgcgtctccc atcctgatcc 3120

cagacccatt ccttagctat ttatcccttt cctggtttcc gaaaggcaat tatatctatt 3180

atgtataagt aaatatatta tatatggatg tgtgtgtgtg cgtgcgcgtg agtgtgtgag 3240

cgcttctgca gcctcggcct aggtcacgtt ggccctcaaa gcgagccgtt gaattggaaa 3300

ctgcttctag aaactctggc tcagcctgtc tcgggctgac ccttttctga tcgtctcggc 3360

ccctctgatt gttcccgatg gtctctctcc ctctgtcttt tctcctccgc ctgtgtccat 3420

ctgaccgttt tcacttgtct cctttctgac tgtccctgcc aatgctccag ctgtcgtctg 3480

actctgggtt cgttggggac atgagatttt attttttgtg agtgagactg agggatcgta 3540

gatttttaca atctgtatct ttgacaattc tgggtgcgag tgtgagagtg tgagcagggc 3600

ttgctcctgc caaccacaat tcaatgaatc cccgaccccc ctaccccatg ctgtacttgt 3660

ggttctcttt ttgtattttg catctgaccc cggggggctg ggacagattg gcaatgggcc 3720

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<210> 21

<211> 9795

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

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aatgggggct gtgtccacga gtgcatcaac atcccgggga actacaggtg tacctgcttt 420

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aataatggtg gctgccagca gatctgcgtc aatgccatgg gcagctacga gtgtcagtgc 540

cacagtggct tcttccttag tgacaaccag catacctgca tccaccgctc caatgagggt 600

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tcctccagcc acaggcaagg ccacggctcc gggctgttgc gctctaaggg ttctgtgatt 3600

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<213> Homo sapiens

<400> 22

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catcctgggt gacaagagcg aaactccatc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagcctggcc 4020

tggtggtgga tgcctgtggt tccagctatt cgggaggctg aggtaggtgg atcacctctg 4080

ctcaggtcaa ggctgcagcg agccatgatc gcaccattgc actccagcct gagtgacaga 4140

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gtgttaaact tatttttagt ttaacattct agaaatgaaa cgtttttact taaccttatt 4380

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aa 6542

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<211> 2164

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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agtctgggcg tttaggtcag aactaccccg gtagcctgac agcaggagct cgagagaagc 60

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atca 2164

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<211> 2173

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<210> 25

<211> 10408

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

gtaattgcga gcgagagtga gtggggccgg gacccgcaga gccgagccga cccttctctc 60

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agattggaca gcccaagaca tcgtggcgtt tttggccaag cacccagagg atgtccagtc 1740

cagtaatggt tctgtgtaca cctggagaga agctttcaac gagactaacc aggcaatccg 1800

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ctcctttgtg ttcaagatcc ccagcacagc ctatgtggtg ctcaccagcg tgaacctctt 5640

cattggcatt aatggcagcg tggccacctt tgtgctggag ctgttcaccg acaataagct 5700

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tagactttcc tttgcaccat gtgaagtgtt gtggagaaaa gagccagaag ttgatgtggg 7200

aagaagtaaa ctggatactg tactgatact attcaatgca atgcaattca atgcaatgaa 7260

aacaaaattc cattacaggg gcagtgcctt tgtagcctat gtcttgtatg gctctcaagt 7320

gaaagacttg aatttagttt tttacctata cctatgtgaa actctattat ggaacccaat 7380

ggacatatgg gtttgaactc acactttttt tttttttttt gttcctgtgt attctcattg 7440

gggttgcaac aataattcat caagtaatca tggccagcga ttattgatca aaatcaaaag 7500

gtaatgcaca tcctcattca ctaagccatg ccatgcccag gagactggtt tcccggtgac 7560

acatccattg ctggcaatga gtgtgccaga gttattagtg ccaagttttt cagaaagttt 7620

gaagcaccat ggtgtgtcat gctcactttt gtgaaagctg ctctgctcag agtctatcaa 7680

cattgaatat cagttgacag aatggtgcca tgcgtggcta acatcctgct ttgattccct 7740

ctgataagct gttctggtgg cagtaacatg caacaaaaat gtgggtgtct ccaggcacgg 7800

gaaacttggt tccattgtta tattgtccta tgcttcgagc catgggtcta cagggtcatc 7860

cttatgagac tcttaaatat acttagatcc tggtaagagg caaagaatca acagccaaac 7920

tgctggggct gcaagctgct gaagccaggg catgggatta aagagattgt gcgttcaaac 7980

ctagggaagc ctgtgcccat ttgtcctgac tgtctgctaa catggtacac tgcatctcaa 8040

gatgtttatc tgacacaagt gtattatttc tggctttttg aattaatcta gaaaatgaaa 8100

agatggagtt gtattttgac aaaaatgttt gtacttttta atgttatttg gaattttaag 8160

ttctatcagt gacttctgaa tccttagaat ggcctctttg tagaaccctg tggtatagag 8220

gagtatggcc actgccccac tatttttatt ttcttatgta agtttgcata tcagtcatga 8280

ctagtgccta gaaagcaatg tgatggtcag gatctcatga cattatattt gagtttcttt 8340

cagatcattt aggatactct taatctcact tcatcaatca aatatttttt gagtgtatgc 8400

tgtagctgaa agagtatgta cgtacgtata agactagaga gatattaagt ctcagtacac 8460

ttcctgtgcc atgttattca gctcactggt ttacaaatat aggttgtctt gtggttgtag 8520

gagcccactg taacaatact gggcagcctt tttttttttt tttttaattg caacaatgca 8580

aaagccaaga aagtataagg gtcacaagtc taaacaatga attcttcaac agggaaaaca 8640

gctagcttga aaacttgctg aaaaacacaa cttgtgttta tggcatttag taccttcaaa 8700

taattggctt tgcagatatt ggatacccca ttaaatctga cagtctcaaa tttttcatct 8760

cttcaatcac tagtcaagaa aaatataaaa acaacaaata cttccatatg gagcattttt 8820

cagagttttc taacccagtc ttatttttct agtcagtaaa catttgtaaa aatactgttt 8880

cactaatact tactgttaac tgtcttgaga gaaaagaaaa atatgagaga actattgttt 8940

ggggaagttc aagtgatctt tcaatatcat tactaacttc ttccactttt tccagaattt 9000

gaatattaac gctaaaggtg taagacttca gatttcaaat taatctttct atatttttta 9060

aatttacaga atattatata acccactgct gaaaaagaaa aaaatgattg ttttagaagt 9120

taaagtcaat attgatttta aatataagta atgaaggcat atttccaata actagtgata 9180

tggcatcgtt gcattttaca gtatcttcaa aaatacagaa tttatagaat aatttctcct 9240

catttaatat ttttcaaaat caaagttatg gtttcctcat tttactaaaa tcgtattcta 9300

attcttcatt atagtaaatc tatgagcaac tccttacttc ggttcctctg atttcaaggc 9360

catattttaa aaaatcaaaa ggcactgtga actattttga agaaaacaca acattttaat 9420

acagattgaa aggacctctt ctgaagctag aaacaatcta tagttataca tcttcattaa 9480

tactgtgtta ccttttaaaa tagtaatttt ttacattttc ctgtgtaaac ctaattgtgg 9540

tagaaatttt taccaactct atactcaatc aagcaaaatt tctgtatatt ccctgtggaa 9600

tgtacctatg tgagtttcag aaattctcaa aatacgtgtt caaaaatttc tgcttttgca 9660

tctttgggac acctcagaaa acttattaac aactgtgaat atgagaaata cagaagaaaa 9720

taataagccc tctatacata aatgcccagc acaattcatt gttaaaaaac aaccaaacct 9780

cacactactg tatttcatta tctgtactga aagcaaatgc tttgtgacta ttaaatgttg 9840

cacatcattc attcactgta tagtaatcat tgactaaagc catttgtctg tgttttcttc 9900

ttgtggttgt atatatcagg taaaatattt tccaaagagc catgtgtcat gtaatactga 9960

accactttga tattgagaca ttaatttgta cccttgttat tatctactag taataatgta 10020

atactgtaga aatattgctc taattctttt caaaattgtt gcatccccct tagaatgttt 10080

ctatttccat aaggatttag gtatgctatt atcccttctt ataccctaag atgaagctgt 10140

ttttgtgctc tttgttcatc attggccctc attccaagca ctttacgctg tctgtaatgg 10200

gatctatttt tgcactggaa tatctgagaa ttgcaaaact agacaaaagt ttcacaacag 10260

atttctaagt taaatcattt tcattaaaag gaaaaaagaa aaaaaatttt gtatgtcaat 10320

aactttatat gaagtattaa aatgcatatt tctatgttgt aatataatga gtcacaaaat 10380

aaagctgtga cagttctgtt ggtctaca 10408

<210> 26

<211> 2104

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

aaccgcatct gcagcgagca tctgagaagc caagactgag ccggcggccg cggcgcagcg 60

aacgagcagt gaccgtgctc ctacccagct ctgctccaca gcgcccacct gtctccgccc 120

ctcggcccct cgcccggctt tgcctaaccg ccacgatgat gttctcgggc ttcaacgcag 180

actacgaggc gtcatcctcc cgctgcagca gcgcgtcccc ggccggggat agcctctctt 240

actaccactc acccgcagac tccttctcca gcatgggctc gcctgtcaac gcgcaggact 300

tctgcacgga cctggccgtc tccagtgcca acttcattcc cacggtcact gccatctcga 360

ccagtccgga cctgcagtgg ctggtgcagc ccgccctcgt ctcctccgtg gccccatcgc 420

agaccagagc ccctcaccct ttcggagtcc ccgccccctc cgctggggct tactccaggg 480

ctggcgttgt gaagaccatg acaggaggcc gagcgcagag cattggcagg aggggcaagg 540

tggaacagtt atctccagaa gaagaagaga aaaggagaat ccgaagggaa aggaataaga 600

tggctgcagc caaatgccgc aaccggagga gggagctgac tgatacactc caagcggaga 660

cagaccaact agaagatgag aagtctgctt tgcagaccga gattgccaac ctgctgaagg 720

agaaggaaaa actagagttc atcctggcag ctcaccgacc tgcctgcaag atccctgatg 780

acctgggctt cccagaagag atgtctgtgg cttcccttga tctgactggg ggcctgccag 840

aggttgccac cccggagtct gaggaggcct tcaccctgcc tctcctcaat gaccctgagc 900

ccaagccctc agtggaacct gtcaagagca tcagcagcat ggagctgaag accgagccct 960

ttgatgactt cctgttccca gcatcatcca ggcccagtgg ctctgagaca gcccgctccg 1020

tgccagacat ggacctatct gggtccttct atgcagcaga ctgggagcct ctgcacagtg 1080

gctccctggg gatggggccc atggccacag agctggagcc cctgtgcact ccggtggtca 1140

cctgtactcc cagctgcact gcttacacgt cttccttcgt cttcacctac cccgaggctg 1200

actccttccc cagctgtgca gctgcccacc gcaagggcag cagcagcaat gagccttcct 1260

ctgactcgct cagctcaccc acgctgctgg ccctgtgagg gggcagggaa ggggaggcag 1320

ccggcaccca caagtgccac tgcccgagct ggtgcattac agagaggaga aacacatctt 1380

ccctagaggg ttcctgtaga cctagggagg accttatctg tgcgtgaaac acaccaggct 1440

gtgggcctca aggacttgaa agcatccatg tgtggactca agtccttacc tcttccggag 1500

atgtagcaaa acgcatggag tgtgtattgt tcccagtgac acttcagaga gctggtagtt 1560

agtagcatgt tgagccaggc ctgggtctgt gtctcttttc tctttctcct tagtcttctc 1620

atagcattaa ctaatctatt gggttcatta ttggaattaa cctggtgctg gatattttca 1680

aattgtatct agtgcagctg attttaacaa taactactgt gttcctggca atagtgtgtt 1740

ctgattagaa atgaccaata ttatactaag aaaagatacg actttatttt ctggtagata 1800

gaaataaata gctatatcca tgtactgtag tttttcttca acatcaatgt tcattgtaat 1860

gttactgatc atgcattgtt gaggtggtct gaatgttctg acattaacag ttttccatga 1920

aaacgtttta ttgtgttttt aatttattta ttaagatgga ttctcagata tttatatttt 1980

tattttattt ttttctacct tgaggtcttt tgacatgtgg aaagtgaatt tgaatgaaaa 2040

atttaagcat tgtttgctta ttgttccaag acattgtcaa taaaagcatt taagttgaat 2100

gcga 2104

Claims (32)

1.一种用于检测肝癌的生物标志物组，其特征在于，由BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因组成。

2.检测权利要求1所述的生物标志物组的试剂在制备用于检测肝癌的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂包括BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因的特异性引物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂还包括HPRT1基因的特异性引物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，BTBD19基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2；FOSB基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SCUBE1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；SHE基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8；PM20D1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；ZFP57基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；HPRT1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测肝癌包括：

步骤S1：获得受试者样本中的循环免疫细胞；

步骤S2：获得BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因在循环免疫细胞中的标准化表达量，计算肝癌检测概率；

步骤S3：将肝癌检测概率与截止值进行比较以确定受试者是否患有肝癌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤S2中，根据公式1/(1+e^(-(4.36+83.19×BTBD19+41.53×FOSB+17.65×SCUBE1+3.25×SHE-27.5×PM20D1-6.75×ZFP57)))计算肝癌检测概率，其中，BTBD19、FOSB、SCUBE1、SHE、PM20D1和ZFP57分别表示BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因相对于HPRT1基因的标准化表达量。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤S3中，截止值是0.76；当肝癌检测概率大于0.76时，确定受试者患有肝癌。

10.一种用于检测肝癌的产品，其特征在于，包括检测权利要求1所述的生物标志物组的试剂。

11.根据权利要求10所述的产品，其特征在于，所述产品是试剂盒、药物、基因芯片或检测试纸。

12.根据权利要求11所述的产品，其特征在于，所述产品是试剂盒。

13.根据权利要求12所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂。

14.根据权利要求13所述的产品，其特征在于，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂包括BTBD19基因、FOSB基因、SCUBE1基因、SHE基因、PM20D1基因和ZFP57基因的特异性引物。

15.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂还包括HPRT1基因的特异性引物。

16.根据权利要求15所述的产品，其特征在于，BTBD19基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2；FOSB基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SCUBE1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；SHE基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8；PM20D1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；ZFP57基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；HPRT1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

17.一种用于检测肝癌的生物标志物组，其特征在于，由ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因组成。

18.检测权利要求17所述的生物标志物组的试剂在制备用于检测肝癌的产品中的应用。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂包括ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因、和SHE基因的特异性引物。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂还包括HPRT1基因的特异性引物。

22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，ABCA1基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16；BTBD19基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；FOS基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；SHE基因的特异性引物是序列SEQID NO:7和SEQ ID NO:8；HPRT1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

23.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，检测肝癌包括：

步骤S1：获得受试者样本中的循环免疫细胞；

步骤S2：获得ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因在循环免疫细胞中的标准化表达量，计算肝癌检测概率；

步骤S3：将肝癌检测概率与截止值进行比较以确定受试者是否患有肝癌。

24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，在步骤S2中，根据公式1/(1+e^(-(-2.47+0.092×ABCA1+21.75×BTBD19+0.752×FOS-10.544×SHE)))计算肝癌检测概率，其中，ABCA1、BTBD19、FOS、和SHE分别表示ABCA1、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因相对于HPRT1基因的标准化表达量。

25.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，在步骤S3中，截止值是0.5；当肝癌检测概率大于0.5时，确定受试者患有肝癌。

26.一种用于检测肝癌的产品，其特征在于，包括检测权利要求1所述的生物标志物组的试剂。

27.根据权利要求26所述的产品，其特征在于，所述产品是试剂盒、药物、基因芯片或检测试纸。

28.根据权利要求27所述的产品，其特征在于，所述产品是试剂盒。

29.根据权利要求28所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂。

30.根据权利要求29所述的产品，其特征在于，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂包括ABCA1基因、BTBD19基因、FOS基因和SHE基因的特异性引物。

31.根据权利要求30所述的产品，其特征在于，所述通过RT-qPCR技术检测所述生物标志物组的试剂还包括HPRT1基因的特异性引物。

32.根据权利要求31所述的产品，其特征在于，ABCA1基因的特异性引物是序列SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16；BTBD19基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；FOS基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；SHE基因的特异性引物是序列SEQID NO:7和SEQ ID NO:8；HPRT1基因的特异性引物是序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

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