CN115851909B - 检测fosb基因的试剂在制备诊断腹主动脉瘤产品的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及检测和/或调控FOSB基因的试剂在制备预测和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用。本发明通过整合单细胞测序和组织芯片转录组分析检测到，FOSB具驱动T细胞炎性状态极化，并且具有调控免疫炎性信号通路的能力，促使疾病进展。利用高通量数据和实时定量PCR实验证明，与健康人群相比，FOSB的表达水平在腹主动脉瘤患者不同组织水平上(腹主动脉壁、血管周围脂肪组织和外周血液)均显著上调。进一步通过ROC、DCA和CIC曲线证实了其良好且稳定的诊断效能和临床适用性。针对上述结果，FOSB可用作腹主动脉瘤免疫治疗的靶点以及预测分子标志物。

Description

检测FOSB基因的试剂在制备诊断腹主动脉瘤产品的应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及检测和/或调控FOSB基因的试剂在制备预测和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用。

背景技术

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是与年龄相关的以主动脉直径扩大为特征的常见病，是心血管发病率和死亡率的最重要原因之一，通常由吸烟、动脉粥样硬化和遗传变异引起。AAA的发生与很多流行病学因素有关，如年龄、性别、种族、家族史和吸烟等。高龄、男性、阳性家族史和长期吸烟者的AAA发生率相应增高。(JahangirE，etal.Smoking，sex，risk factors and abdominal aortic aneurysms:a prospectivestudy of 18782persons aged above 65years in the Southern Community CohortStudy[J].JEpidemiol Community Health，2015，69(5):481-488.)AAA在65岁以上的男性中的发病率高达9％，是55-74岁人群的10大主要死因之一。在欧洲北部地区，超声筛查显示直径29～49mm的AAA在75～84岁男性中的患病率达12.5％，在75～84岁女性中患病率为5.2％。在65岁及以上男性的所有死亡中，有1-2％是由这种血管疾病造成的。(SvensjoS，etal.Low prevalence ofabdominal aortic aneurysm among 65-year-old Swedishmenindicat esa change in the epidemiology of the disease[J].Circulation，2011，124(10):1118-1123.)AAA是一种自身免疫性无症状疾病，自然病程通常进展缓慢。通常情况下，AAA直径<4cm时，年增长1～4mm；瘤体直径在4～5cm时，年增长4～5mm；瘤体直径>5cm时，年增长>5mm，瘤体破裂率达20％；瘤体直径>6cm时，年增长7～8mm，瘤体破裂率也增大至40％。吸烟者AAA的扩张速度增快16％。但目前尚无法准确预测动脉瘤的增长速度和破裂风险，即使较小的瘤体也、随时可能快速增长并急性扩张致使动脉壁破裂，导致致命后果。而瘤体一旦破裂，破裂性AAA病死率高达90％。AAA破裂的相关因素除瘤体直径外，还包括高血压、慢性阻塞性肺疾病、长期吸烟、女性及阳性家族史等。AAA瘤体较大时会压迫十二指肠引起上消化道梗阻症状。严重时，可侵犯十二指肠形成主动脉-十二指肠瘘，导致消化道大出血；还可压迫下腔静脉或肾静脉，发生腹主动脉-下腔静脉瘘或腹主动脉-肾静脉瘘，导致急性心力衰竭。AAA瘤腔内附壁血栓如脱落则将引起远端肢体栓塞。

但是，在临床上，大多数动脉瘤患者发病隐匿，缺乏明显的体征和症状，瘤体破裂前诊断困难。目前的检测和风险评估主要依靠包括多普勒超声/CT血管造影(CTA)/磁共振血管造影以及腹部X线平片检查等在内的影像学检查，以及典型体征形态学特征和人群筛查等策略。这些现有的诊断手段和方式存在费用高、有创性以及有临床风险等缺点，缺少一种此外尽管存在血管腔内或AAA切除和人造血管移植术的开放修复等手术干预措施，但这往往会受限于AAA的直径和生长速度，且获益效果不明确，手术风险高，住院死亡率仍然很高。除了手术治疗方法外，非手术治疗AAA主要是降低合并的心血管疾病风险和减缓增长速度，如戒烟/锻炼/血压控制和临床用药β受体拮抗剂/血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和他汀类药等。但是这些方法和手段均不能有效减缓AAA增长速度、降低破裂风险(WemmelundH，HoghA，Hundborg HH，et al.Statinuse and rupture ofabdominal aortic aneurysm[J].Br J Surg，2014，101(8):966-975.等)。目前，没有一种有效的药物疗法在减缓AAA扩张速度方面取得令人满意的效果。因此，研究一种能够早期诊断、复发检测关键的分子标志物以及靶向治疗的作用靶点具有重大意义。

慢性炎症性是AAA的主要发病机制之一，血管壁中层和外膜血管炎症和免疫细胞浸润是动脉瘤的典型特征。作为主要的浸润性免疫细胞亚群，CD4+/CD8+T细胞在AAA病变中占主导地位，其数量不仅与动脉瘤的扩张呈正相关，在血管壁弹性蛋白结构破坏、平滑肌细胞层丢失和细胞外基质增多等方面也发挥重要作用。动脉瘤壁微环境刺激进一步促使T细胞分化发育成不同的浸润状态，这种表型的失衡极化加剧动脉瘤的不稳定性。调控T细胞命运多样性和不平衡的关键分子可成为AAA的新型生物标志物。

FOSB基因(FosB Proto-Oncogene,AP-1Transcription Factor Subunit)定位于染色体19p13.32上，是激活蛋白-1(AP-1)二聚体的主要构成分子，可被炎性因子、应激诱导物或病原体等不同刺激所激活而引发先天和获得性免疫；参与到多种细胞事件，包括分化、增殖、存活和凋亡。二者的转录活性和丰度取决于细胞类型和分化状态，可被快速转录以响应细胞外刺激。研究表明AP-1在淋巴细胞的分化、转化程序中有不同的参与，在T细胞激活阶段也可检测到显著的AP-1信号包括FOSB。然而，它们在腹主动脉瘤中的作用尚不清楚，且未见有文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供检测和/或调控FOSB基因的试剂在制备预测和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用，所述FOSB基因具有优良诊断预测性能，与动脉瘤促炎微环境密切相关，将FOSB基因作为腹主动脉瘤T淋巴细胞分化命运系调控基因，可为AAA的免疫靶向治疗和辅助预测诊断提供有效靶点和诊断标志物。

本发明提供了一种检测和/或调控FOSB基因的试剂在制备预测和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用，所述FOSB基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4所示的片段。

优选的，所述FOSB基因的mRNA序列包括SEQ ID NO.1所示序列的全部或部分，CDS序列包括SEQ ID NO.2所示序列的全部或部分，编码的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示序列的全部或部分。

优选的，检测FOSB基因的试剂包括检测FOSB基因mRNA表达量的引物对。

优选的，所述引物对包括FOSB-EXON4-F和FOSB-EXON4-R，其中FOSB-EXON4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，FOSB-EXON4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种检测FOSB基因表达量的试剂盒，包括针对FOSB基因设计的引物对FOSB-EXON4-F和FOSB-EXON4-R，其中FOSB-EXON4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，FOSB-EXON4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选的，还包括针对内参基因设计的引物对。

优选的，所述内参基因包括GAPDH，针对GAPDH设计的引物对包括GAPDH-F和GAPDH-R，其中GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，GAPDH-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种非诊疗目的的基于上述试剂盒检测FOSB基因表达量的方法，包括以下步骤：利用从外周血中提取的总RNA进行定量聚合酶链式反应，将反应产物行qRT-PCR，计算FOSB基因的相对表达量。

有益效果：本发明提供了一种检测和/或调控FOSB基因的试剂在制备预测和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用。本发明实施例通过整合单细胞测序、组织芯片高通量测序数据分析进行筛选T细胞命运相关后备基因，采用多种机器学习算法等统计学手段和临床样本检测进一步发现FOSB具有优良诊断预测性能，与动脉瘤促炎微环境密切相关，具有调控AAA中T淋巴细胞浸润状态的功能，促进T细胞以及动脉瘤壁微环境炎性失衡极化。

本发明实施例中，FOSB在AAA患者多组织水平(动脉瘤壁组织、血管旁周围脂肪组织、外周血液)表达显著失控上调，并具有一定特异性。以FOSB为中心的共表达信号轴可通过调节IFN反应和TNF信号传导通路、NKκB通路在T细胞浸润介导的AAA的发生发展中发挥关键作用。FOSB可作为免疫治疗AAA的靶点。

本发明以FOSB作为AAA的优良诊断标志物和免疫治疗靶点：FOSB的AUC值在队列1中分别为0.911；在队列2中为0.982；在队列3中为0.956；在内部数据集1中为1.000；在内部数据集2中为0.989。FOSB具有较高的诊断性和稳定性。不同数据集的决策曲线分析(DCA)表明患者能够受益于FOSB的标志物辅助诊断，高危阈值从0到1。临床影响曲线(CIC)再次进一步证明了FOSB作为关键生物标志物的临床适用性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于单细胞测序数据和组织微阵列高通量数据采用机器学习算法鉴定关键生物标志物的结果，其中A:基于UMAP的非监督聚类鉴定腹主动脉瘤细胞异质性，B:重建腹主动脉瘤T细胞的细胞命运分化轨迹并识别发育时序；C:基于LASSO逻辑回归和支持向量机的联合机器学习算法从T细胞浸润状态关键调控基因鉴定最佳生物标志物(FOSB)，D:重建T细胞分化发育轨迹，FOSB显著定位于促炎T细胞亚群，并在T细胞促炎浸润状态发展的拟时序上具有显著动力学模式；

图2为FOSB与促进动脉瘤进展的经典免疫炎性功能和通路的相关性分析结果；A:免疫细胞丰度在AAA患者腹主动脉瘤壁、周围脂肪组织与健康人腹主动脉瘤壁、周围脂肪组织的差异；B:免疫功能活性在AAA患者腹主动脉瘤壁、周围脂肪组织与健康人腹主动脉瘤壁、周围脂肪组织的差异；C:FOSB与促进动脉瘤进展的经典免疫炎性功能和通路显著相关；

图3为所有调控成分(DETF、T细胞浸润状态驱动基因、免疫细胞、标记信号和通路)之间共表达模式和相互作用系数的热图矩阵，其中展示了FOSB与多组分的调控关系；

图4为基于多个验证队列与临床样本以及多组织水平，腹主动脉瘤疾病状态下FOSB表达量关系图；

图5为基于多个验证队列与临床样本以及多组织水平，腹主动脉瘤疾病状态下FOSB受试者工作曲线(ROC)证实FOSB具有优秀的诊断预测价值和临床净效益；

图6为基于多个验证队列与临床样本以及多组织水平，腹主动脉瘤疾病状态下FOSB决策曲线分析(DCA)证实FOSB具有优秀的诊断预测价值和临床净效益；

图7为基于多个验证队列与临床样本以及多组织水平，腹主动脉瘤疾病状态下FOSB临床影响曲线(CIC)证实FOSB具有优秀的诊断预测价值和临床净效益。

具体实施方式

本发明提供了一种检测和/或调控FOSB基因的试剂在制备预测和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用，所述FOSB基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4所示的片段：gcttctctctttacacac agtgaagttc aagtcctcgg cgaccccttc cccgttgtta acccttcgta cacttcttcgtttgtcctca。

本发明所述FOSB基因的mRNA序列优选包括SEQ ID NO.1所示序列的全部或部分，CDS序列优选包括SEQ ID NO.2所示序列的全部或部分，编码的氨基酸序列优选包括SEQ IDNO.3所示序列的全部或部分。

本发明所述FOSB基因优选通过多手段筛选得到，具体包括：收集人类腹主动脉瘤壁组织的微阵列原始数据以及人类腹主动脉瘤壁组织的单细胞测序数据：来自基因表达总库(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/))的4个独立的腹主动脉组织数据集，包括GSE98278(31例腹主动脉瘤性腹主动脉壁组织)、GSE57691(49例腹主动脉瘤性腹主动脉壁组织和10名对照组的非瘤性腹主动脉壁组织)、GSE7084(9例腹主动脉瘤性腹主动脉壁组织和10名对照组的非瘤性腹主动脉壁组织)、GSE119717(腹主动脉周围30个血管周围脂肪组织和30个未扩张的腹主动脉周围的腹主动脉脂肪组织)。从GEO数据库中获得腹主动脉瘤性(GSE166676)患者腹主动脉组织的单细胞序列(scRNA-seq)数据。本发明的所有实验均由郑州大学附属第一医院伦理委员会批准(2021-KY-1260-002)。共采集24例AAA住院患者和15例健康对照的外周静脉血39份。所有受试者都签署了知情同意书。冷冻的人腹主动脉病变和邻近的正常腹主动脉来自布里格姆妇女医院(Liu CL,Liu X,Zhang Y,etal.Eosinophils Protect Mice From Angiotensin-II Perfusion-Induced AbdominalAortic Aneurysm.Circ Res.2021Jan22；128(2):188-202.)。根据由马萨诸塞州波士顿布里格姆妇女医院的人类调查审查委员会预先证明的协议2010P001930，废弃和解码的人体主动脉被重新使用。

本发明优选基于人类腹主动脉瘤壁组织的微阵列原始数据处理和人类腹主动脉瘤壁组织的单细胞测序数据处理，并通过单细胞测序数据和已知标志基因完成细胞类型注释。本发明首先将所有样本中的T细胞进行亚群分析，重建T细胞分化轨迹，基于表达谱信息通过拟合各个T细胞表型出现假时间以确定AAA疾病状态下各个T细胞亚型分化的先后顺序；然后采用多种机器学习算法：LASSO、Logistic回归和支持向量机-递归特征消除(SVM-RFE)进行特征选择，从T细胞浸润状态驱动基因中筛选出AAA关键生物标志物(FOSB)；而后采用斯皮尔曼相关性分析证实FOSB与经典AAA促炎信号标志IFN应答、TNF和NKκB通路显著相关；与AAA免疫信号(体细胞受体钙通路、抗原递呈)显著相关；再次采用BEAM分析证明FOSB在T细胞浸润的分化假时间上具有显著动力学模式；进一步在多个高通量数据库外部队列以及临床样本中通过生物信息学分析和RT-PCR实验方法验证了FOSB基因在腹主动脉壁组织、腹主动脉瘤血管旁脂肪组织、外周血液中表达量显著失调；最后在多个验证队列中与临床样本中，通过受试者工作特征(ROC)曲线和ROC下面积(AUC)证实了FOSB在众候选靶分子众具有最高的诊断和预测价值。采用决策曲线分析(DCA)和临床影响曲线(CIC)验证了FOSB具有优良的临床净效益。

在本发明中，检测FOSB基因的试剂优选包括检测FOSB基因mRNA表达量的引物对，所述引物对优选包括FOSB-EXON4-F和FOSB-EXON4-R，其中FOSB-EXON4-F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示，FOSB-EXON4-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示。

本发明对所述FOSB基因的表达量的检测方法并没有特殊限定。

本发明还提供了一种检测FOSB基因表达量的试剂盒，包括针对FOSB基因设计的引物对FOSB-EXON4-F和FOSB-EXON4-R，其中FOSB-EXON4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，FOSB-EXON4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明所述试剂盒中优选还包括针对内参基因设计的引物对，所述内参基因优选包括GAPDH，针对GAPDH设计的引物对优选包括GAPDH-F和GAPDH-R，其中GAPDH-F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7所示，GAPDH-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种非诊疗目的的基于上述试剂盒检测FOSB基因表达量的方法，包括以下步骤：利用从外周血中提取的总RNA进行定量聚合酶链式反应，将反应产物行qRT-PCR，计算FOSB基因的相对表达量。

在本发明中，所述总RNA的提取方法并没有特殊限定，提取总RNA后经RNA质量和RNA完整性评估，符合要求即可。本发明对符合要求的总RNA进行定量聚合酶链式反应，结束后立即-80℃下储存；然后行qRT-PCR，基于2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的检测和/或调控FOSB基因的试剂在制备预测和/或治疗腹主动脉瘤的产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)基于人类腹主动脉瘤壁组织的微阵列原始数据(基因表达总库(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/))的4个独立的腹主动脉组织数据集：GSE98278、GSE57691、GSE7084、GSE119717)，使用R语言中的affy软件包读取所有微阵列上探针的荧光值数据，然后通过稳健多阵列平均(Robust Multi-arrayAverage，RMA)算法进行背景校正，并取以2为底的对数进行数据标准化，得到探针表达矩阵。进而，通过平台文件对探针序列进行注释(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi：GPL10558Illumina Human HT-12V4.0expressionbeadchip，GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human GenomeU133Plus 2.0Array)，得到包含所有样本的基因表达矩。最后，使用R语言中的sva和limma软件包对样本进行校正。

(2)基于人类腹主动脉瘤壁组织的单细胞测序数据(基因表达总库(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/))的1个独立的腹主动脉组织单细胞数据队列：GSE166676)，使用CellRanger软件使每个样品产生双端配对末端读取(paired end)的fastq文件，修剪以去除polyA尾序列和模板开关寡核苷酸(TSO)序列。最终，使用R语言中的Seurat软件包对CellRanger软件输出的定量表达矩阵进行下游分析。

(3)超过100,000个转录本且线粒体基因比例低于10％的细胞被纳入进一步分析；只有在至少3个细胞中表达的基因才被纳入进一步分析。使用vst方法鉴定所有基因中前2000个高变异变基因。执行主成分分析(PCA)，并将前20个主成分(PCs)纳入降维分析。采用UMAP算法(uniform manifold approximation andprojection)降维。使用FindAllMarkers函数所有基因中前2000个高变异变基因中的DEGs，作为细胞类型注释的潜在标志基因。

(4)AAA组织包含了已知的T细胞(CD3D，CD3E，CD8A)，B细胞(CD79A，CD79B，MS4A1)，单核细胞/巨噬细胞(LYZ，CD68，CD14)，神经细胞/施万细胞(NGFR)，平滑肌细胞(TAGLN，ACTA2，CALD1)，肥大细胞(KIT，HDC，TPSAB1)，内皮细胞(VWF，CD34，FABP4)，NK细胞(FGFBP2，KLRF1，NKG7)且已知上述细胞类型的标志基因。识别每个UMAP无监督聚类所属的细胞类型，通过判断每个无监督聚类的DEGs是否为某种细胞类型的已知标志基因来判断该聚类所属的细胞类型(图1中A)。

(5)进一步，将所有样本中的T细胞单独构建为Seurat对象(Butler A,Hoffman P,Smibert P,et al.Integrating single-cell transcriptomic data across differentconditions,technologies,and species.Nat Biotechnol.2018；36:411-420)，并进行亚群分析。使用Monocle软件包进行成T细胞分化轨迹分析，基于表达谱信息通过拟合各个T细胞表型出现假时间(Pseudo-time)以确定AAA疾病状态下各个T细胞亚型分化的先后顺序。分化轨迹分析所有T细胞的独特的分子标识符(Unique Molecular Identifiers，UMI)表达矩阵作为输入数据，对所有细胞进行无监督排序。而后，利用DDRTress算法估计不同时间点的各个T细胞亚型的假时间(图1中B)。

(6)在鉴定腹主动脉瘤T淋巴细胞分化命运系调控基因(ISRGs)之前，为了减少噪音，提高精确性，增强分子的实用性和可操作性，通过多种算法进行进一步筛选，通过Venn图取交集的方法，保留满足如下5个条件的基因集定义为ISRGs(图1中C)：

1.DDRTress算法所得q值<0.05且用于分化轨迹排序的基因

2.不同分化阶段(State)的T细胞亚型之间的差异基因(q<0.05)

3.BEAM(Branched expression analysis modeling)算法鉴定得出的细胞命运调控基因

4.eBayes检验鉴定出的在动脉瘤壁组织中基因表达量在AAA患者和健康对照组之间存在显著表达差异的基因(q<0.05)

5.不同T细胞表型之间的top2000高变基因

(7)利用最小绝对收缩和选择算子(LASSO)、Logistic回归和支持向量机-递归特征消除(SVM-RFE)进行特征选择，以组织微阵列芯片数据为基础从ISRG中筛选出AAA关键生物标志物。LASSO回归对变量具有收缩惩罚函数，从而导致表达式中预测因子的稀疏性。基于支持向量机的机器学习方法--支持向量机RFE通过删除支持向量机生成的特征向量来识别最佳变量。构建支持向量机模块，通过R语言e1071程序包进一步筛选这些生物标志物在AAA中的诊断价值。最终，将两种机器学习算法的基因结合起来得到的最终生物标志物(FOSB)进行进一步分析(图1中C)。

(8)AAA中的免疫细胞浸润模式分析作为一种基于基因表达谱表征估算复杂组织细胞组成的方法，为确定已识别的生物标志物与腹主动脉瘤组织中免疫功能之间的关联，采用单样本基因集富集分析(single sample geneset enrichment analysis，ssGSEA)算法评估和量化了腹主动脉瘤组织中种免疫细胞和免疫功能(图2中A和B)。

(9)采用斯皮尔曼相关性证实生物标志物与关键信号通路的统计学相关性(图2中C和图3)。

(10)采用BEAM分析证明FOSB在T细胞浸润的分化假时间上具有显著动力学模式(图1中D)。

(11)收集4例AAA患者的腹主动脉壁标本，并以5例非瘤性腹主动脉壁标本作为对照(腹主动脉壁，内部数据集1)。在手术过程中，所有组织样本都被冷冻在液氮中。郑州大学第一附属医院经验丰富的病理学家证实了AAA。此外，另外采集24例AAA住院患者和15名健康对照的39份外周静脉血样本(血样本，内部数据集2)。

(12)定量逆转录聚合酶链式反应(QRT-PCR)检测FOSB在组织和血液中的表达水平。根据制造商的方案，使用RNAiso Plus(中国大连塔卡拉)从人腹主动脉壁组织和外周血样本中提取总RNA。用NanoDrop One C(Thermo Fisher Science，Waltham，USA)超微紫外分光光度计评估RNA质量，并基于琼脂糖凝胶电泳法评估RNA完整性。用HiScrip III RTSuperMix进行定量聚合酶链式反应(Vazyme Biotech，南京)。产品立即储存在-80℃下，直到分析。用ChamQ Universal SYBR qPCRMasterMix(Vazyme Biotech，中国，南京)在QuantStudio3实时聚合酶链式反应系统(美国福斯特市应用生物系统)上进行qRT-PCR。采用内参照基因GAPDH。(1)95℃保温30s，(2)95℃保温10s，60℃保温30s，(3)95℃保温15s，60℃保温60s，95℃保温15s，采用ΔCT(CtmRNA-Ct GAPDH)方法计算基因相对表达。用2^-ΔΔCT法计算相对定量。

(13)在多个高通量数据库外部队列(GSE57691,GSE98278,GSE7084,GSE119717)以及临床样本中证实FOSB基因在腹主动脉壁组织、腹主动脉瘤血管旁脂肪组织、外周血液中表达量显著失调(图4)。

(14)在多个验证队列中与临床样本中，使用R语言计算分析受试者工作特征(ROC)曲线和用于评估FOSB的诊断和预测价值，ROC下面积(AUC)用于指定ROC的效应值。决策曲线分析(DCA)和临床影响曲线(CIC)验证了FOSB作为诊断标志物具有优良的临床净效益(图5，图6和图7)。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (2)

1.一种检测FOSB基因的试剂在制备诊断腹主动脉瘤的产品中的应用，其特征在于，所述FOSB基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4所示的片段；

检测FOSB基因的试剂包括检测FOSB基因mRNA表达量的引物对，所述引物对包括FOSB-EXON4-F和FOSB-EXON4-R，其中FOSB-EXON4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，FOSB-EXON4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述FOSB基因的mRNA序列如SEQ ID NO.1所示，CDS序列如SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。