CN109402262B - 辅助诊断神经母细胞瘤的PCR检测试剂盒及检测miR-199a-3p表达水平的方法 - Google Patents

辅助诊断神经母细胞瘤的PCR检测试剂盒及检测miR-199a-3p表达水平的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于临床检测领域，公开了一种辅助诊断神经母细胞瘤的PCR检测试剂盒及检测has‑miR‑199a‑3p(以下简称miR‑199a‑3p)表达量的方法。本发明的试剂盒包括外泌体冲洗液及外泌体RNA提取试剂、miR‑199a‑3p特异性引物、miR‑199a‑3p反转录试剂、以及实时荧光定量PCR检测试剂。本发明的PCR检测试剂盒可以很好地检测神经母细胞瘤疑似患者血浆外泌体内miR‑199a‑3p表达量，并与正常进行对照，以判断miR‑199a‑3p表达的上调与否来辅助判断是否患有该肿瘤疾病。

Description

辅助诊断神经母细胞瘤的PCR检测试剂盒及检测miR-199a-3p 表达水平的方法
技术领域
本发明属于临床检测领域，具体涉及一种辅助诊断神经母细胞瘤的PCR 检测试剂盒及检测miR-199a-3p表达水平的方法。
背景技术
神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外实体肿瘤，占儿童期所有恶性肿瘤的7％，以及儿童肿瘤相关死亡病例的15％。随着临床诊治技术的发展，NB总体生存率从1995年的54％提高到2003年的79％，然而高危组患儿预后仍很差，五年生存率为23％，大于50％的患者在初诊时既已发生远处转移。NB预后相关因素很复杂，包括年龄、病理组织学分型、基因表达情况等等，早期准确的诊断，及时的风险分级和精准的治疗方法对NB患者的预后非常重要。
对NB的诊断，到目前为止主要依靠肿瘤活检诊断，通过病理组织学检查及免疫组化方法进行分析是当前国际公认的诊断该病的金标准。但是这些诊断方法耗时长，且均为有创检查，受到很多条件的限制。因此发明一种快速、有效、低创伤的诊断方法十分必要。
随着对肿瘤微环境及细胞外囊泡研究的进展，外泌体在肿瘤的复发、转移、耐药及靶向治疗中发挥的作用被越来越多的研究者注意到。外泌体被定义为直径在30-200nm之间的细胞外囊泡，内含遗传物质核酸和蛋白质。由特异性细胞分泌的外泌体可以在各种体液样本中检测到，参与了细胞间的相互作用。外泌体中遗传物质主要是miRNA，与循环血内miRNA比较，外泌体中miRNA更有特异性，且被囊泡保护，而受RNA酶的降解作用影响小，在成人常见肿瘤如结肠癌、肺癌、肝癌中，外泌体中miRNA被证明与肿瘤细胞的恶性生物学行为有关。但是，在神经母外泌体内miRNA的研究非常少，对NB诊断有指导作用的外泌体内miRNA亟待发现。
发明内容
本发明针对现有技术中还没有针对神经母细胞瘤的方便快捷的辅助诊断方法，而其他神经母细胞瘤诊断方法操作复杂、有创且耗时长的技术问题，目的在于提供一种新的辅助诊断神经母细胞瘤的PCR检测试剂盒。本发明所述肿瘤神经母细胞瘤，所述试剂盒包括外泌体冲洗液、外泌体RNA提取试剂、miR-199a-3p特异性引物、反转录试剂、以及实时荧光定量PCR检测试剂。
所述外泌体冲洗液为磷酸缓冲盐溶液；外泌体RNA提取试剂包括：总 RNA分离试剂(TRIzol)、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇以及无RNA酶的水。
所述总RNA分离试剂包括苯酚和异硫氰酸胍。
所述miR-199a-3p特异性引物序列具体为正向引物：5'-CGGACAGTAGTCTGCACATTGGTTA-3'，通用反向引物：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTT-3'。
所述反转录试剂包括：通用引物5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'、 polyA聚合酶、反转录酶、单核苷酸混合物(包括dATP、dGTP、dTTP和 dCTP)和缓冲液。
所述实时荧光定量PCR检测试剂包括：荧光DNA聚合酶预混物 (QuantiTect SYBRGreen PCR混合物)。
本发明的另一目的在于提供一种检测神经母细胞瘤疑似患者的血浆外泌体内miR-199a-3p表达水平的方法，包括如下步骤：
S1，使用权利要求1所述试剂盒中的外泌体冲洗液及外泌体RNA提取试剂得到血浆中的外泌体以及外泌体RNA；
S2，将步骤S1提取到的外泌体RNA使用权利要求1所述试剂盒中的反转录试剂将miR-199a-3p反转录成cDNA；
S3，使用权利要求1所述试剂盒中的miR-199a-3p特异性引物和实时荧光定量PCR检测试剂检测miR-199a-3p表达水平。
步骤S1中先将血浆超速离心，再使用1倍体积磷酸缓冲盐溶液洗脱沉淀得到外泌体；所得外泌体按照体积比1:1加入RNA提取试剂，静置5mins，体积比5:1加三氯甲烷，震荡后，超速离心，吸取上清，加体积比2:1加入异丙醇，静置，超速离心，取白色沉淀，75％酒精洗沉淀，离心，去上清，沉淀用无RNA酶的溶解，得到外泌体RNA；
步骤S2反转录条件是37℃孵育60min，95℃失活5min。
步骤S3实时荧光定量PCR扩增条件是95℃激活聚合酶15min；94℃变 15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，循环40次。所述用荧光定量PCR特异扩增miR-199a-3p的引物为正向引物5'-CGGACAGTAGTCTGCACATTG GTTA-3'，通用反向引物：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'。
申请人通过15例神经母细胞瘤和3例健康对照血浆外泌体进行分离、鉴定，提取miRNA质检、测序建库，分析差异表达的miRNA，发现在神经母细胞瘤血浆外泌体中miR-199a-3p表达量与健康对照组比较明显增高，同时体外研究发现在神经母细胞瘤细胞系中及细胞系分泌外泌体中miR-199a-3p 表达量亦明显增高。进一步功能试验发现miR-199a-3p与神经母细胞瘤细胞的增殖和迁移相关。可以作为神经母细胞瘤体液辅助诊断的一个特异性分子标记。
本发明的积极进步效果在于：本发明人研究发现miR-199a-3p在神经母细胞瘤的增殖和迁移中起着促进作用，并发现miR-199a-3p在神经母细胞瘤患者血浆外泌体内高表达，通过该生物标志物能够容易且可靠地辅助诊断神经母细胞瘤。例如，仅通过测定患者血浆外泌体内miR-199a-3p表达水平，就比较容易判定是否患有神经母细胞瘤。本发明通过该标志物能够对神经母细胞瘤做出辅助诊断，为临床上神经母细胞瘤的快速准确诊断提供了可能，利于对神经母细胞瘤患者做出及时精准的治疗。
本发明的PCR检测试剂盒可以很好地检测肿瘤疑似患者血浆外泌体内 miR-199a-3p表达量，并与正常进行对照，以判断miR-199a-3p表达的上调与否来辅助判断是否患有肿瘤疾病。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1A荧光定量PCR检测miR-199a-3p在细胞系中的表达比较图；其中横坐标为细胞系种类，SK-N-SH为肿瘤组神经母细胞瘤细胞系，HUVEC为对照组上皮细胞；纵坐标为miR-199a-3p的表达倍数，统计学方法为秩和检验，p值为0.0135。
图1B荧光定量PCR检测miR-199a-3p在细胞系外泌体中表达比较图；其中横坐标为细胞系外泌体种类，SK-N-SH-exo为肿瘤组神经母细胞瘤细胞系分泌的外泌体，HUVEC-exo为对照组上皮细胞分泌的外泌体；纵坐标为 miR-199a-3p的表达倍数，统计学方法为秩和检验，p值为0.0198。
图2A神经母细胞瘤细胞系转染miR-199a-3p mimic类似物后miR-199a -3p表达量明显增多，与对照组比较，有统计学意义，p值为0.0008。其中横坐标为分组，SK-N-SH组为野生型神经母细胞瘤细胞做空白对照，NC-miR 组为转染阴性miRNA做阴性对照(negativecontrol)，miR-199a-3p为转染 miR-199a-3p类似物的实验组；纵坐标为miR-199a-3p表达倍数。
图2B神经母细胞瘤细胞系转染miR-199a-3p后，吸光值490检测肿瘤细胞增殖，NC-miR组为转染阴性miRNA做阴性对照组，miR-199a-3p为转染 miR-199a-3p类似物的实验组，与对照组比较细胞增殖明显提高p＝0.039。横坐标为转染后的时间(单位：小时)，纵坐标为吸光值490倍数。
图2C神经母细胞瘤细胞系中转染miR-199a-3p后肿瘤细胞迁移照片；横坐标为转染后的时间(单位：小时)，纵坐标为分组，SK-N-SH组为野生型肿瘤细胞做空白对照，NC-miR组为转染阴性miRNA做阴性对照组， miR-199a-3p为转染miR-199a-3p类似物的实验组。
图2D神经母细胞瘤细胞系中转染miR-199a-3p后肿瘤细胞迁移能力统计图；SK-N-SH组为野生型肿瘤细胞做空白对照，NC-miR组为转染阴性 miRNA做阴性对照组，miR-199a-3p为转染miR-199a-3p类似物的实验组；与对照组比较，实验组侵袭细胞明显增多，p<0.0001。横坐标为转染后的时间(单位：小时)，纵坐标为侵袭细胞数。
图3荧光定量PCR检测miR-199a-3p在神经母细胞瘤患儿血浆外泌体内的表达较正常对照高；
其中，横坐标为分组，包括健康对照组和神经母细胞瘤组，纵坐标为 miR-199a-3p的相对表达量。神经母细胞瘤患儿血浆外泌体内miR-199a-3p 表达增高，与健康对照组比较有统计学意义，p值为0.042。
具体实施方式
实施例1筛选与神经母细胞瘤相关的外泌体内miRNA标志物
采集15例确诊为神经母细胞瘤患儿和3例性别年龄匹配的对照组血液 2mL(样本由上海儿童医学中心提供)
步骤S1如前述超速离心法提取血浆中的外泌体，总RNA分离试剂等提取外泌体内总RNA
具体步骤：2mL血浆经10000g离心30分钟，去沉淀后，100000g离心两次70分钟，1×PAS溶液洗脱离心管上含有外泌体的沉淀；按照体积比1:1 加入总RNA分离试剂(TRIzol)(Thermo fisher，货号1559618)，静置5mins，加200μL三氯甲烷，震荡后，4℃12000g离心20mins，吸取上清，加500μL 异丙醇，静置10分钟后，4℃12000g离心15min，取白色沉淀，75％酒精洗沉淀，7500g离心5分钟后，去上清，沉淀用无RNA酶的水溶解，-80℃存储备用。
步骤S2a文库预备、测序和数据分析
对血浆样品的所有外泌体RNA进行下一代测序。首先使用PAGE凝胶，对18至30ntmiRNA进行大小选择，在PAGE凝胶电泳30min，选择在18～30 nt之间具有明亮主条带的样品用于进一步实验。Agilent 2100生物分析仪评估文库的质量和产量。使用miRbase和Rfam数据库，分析差异表达的miRNA。
对15例儿童神经母细胞瘤患儿血浆外泌体内miRNA高通量测序结果进行的分析表明：神经母细胞瘤和对照组的血浆外泌体内miRNA表达存在显著性差异，43个高表达的miRNA被发现存在与神经母细胞瘤患儿血浆外泌体中。
进行miR-199a-3p细胞系及细胞系外泌体表达验证。过程如下：选取实验组人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH和对照组人脐静脉内皮细胞系HUVEC 细胞，去外泌体培养基培养，常规收取细胞沉淀约4*106个细胞，超速离心法提取培养基外泌体，10000g离心30分钟，去沉淀后，100000g离心两次 70分钟，1mL 1×PAS溶液洗脱离心管壁上的外泌体。加入1mL总RNA分离试剂(TRIzol)，室温静置5mins，加200μL三氯甲烷，震荡后静置5mins， 20mins，吸取上清，加500μL异丙醇，静置10分钟后，4℃12000g离心 15min，取白色沉淀，75％酒精洗沉淀，7500g离心5分钟后，去上清，沉淀用无RNA酶的水溶解，备用。
步骤S2反转录成cDNA
使用miScript PCR start Kit(QIAGEN公司，货号218193)试剂盒反转录成cDNA，具体步骤如下：将10μL逆转录混合体系(包括500ng RNA模板，5×miScript HiFlex缓冲液2μL，10×miScript单核苷酸混合物1μL， miScript reverse transcriptase Mix反转录混合物(含polyA聚合酶、反转录酶、反转录引物5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')1μL，无核糖核酸酶水补至10μL。37℃处理60min，95℃处理5min，冷却至4℃。
步骤S3实时荧光定量PCR检测
采用miScript PCR Starter Kit(Qiagen公司，218193)：10μL PCR反应体系包括10×miScript通用引物(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')1μL、miR-199a-3p特异性正向引物1μL(5'-CGGACAGTAGTCTGCACATTGGTT A-3')，荧光DNA聚合酶预混物(2×QuantiTectSYBR Green PCR混合物) 5μL，cDNA模板1μL，无核糖核酸的水2μL。荧光定量PCR扩增条件是95℃激活聚合酶15min；94℃变15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，循环40 次。
实时荧光定量检测发现神经母细胞瘤细胞系中和其分泌的外泌体中 miR-199a-3p均高表达(如图1A和1B所示)。发明人还发现过表达 miR-199a-3p可引起神经母细胞瘤细胞增殖和迁移能力增强(如图2A～2D所示)。
实施例2实时荧光定量PCR检测血浆外泌体miR-199a-3p表达水平，诊断儿童神经母细胞瘤
普外科门诊疑似神经母细胞瘤患儿血液样本2mL，共12例
步骤S1采用前述方法提取血浆中的外泌体及外泌体内RNA，具体参见实施例1的步骤S1。
步骤S2采用前述方法将步骤S1提取的RNA逆转录成特异性cDNA。使用miScriptPCR start Kit(QIAGEN公司，货号218193)试剂盒反转录成 cDNA，具体步骤如下：将10μL逆转录混合体系(包括500ng RNA模板，5 ×miScript HiFlex缓冲液2μL，10×miScript单核苷酸混合物1μL，miScript reverse transcriptase Mix反转录混合物(含polyA聚合酶、反转录酶、反转录引物5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')1μL，无核糖核酸的水补至10μL。 37℃处理60min，95℃处理5min，冷却至4℃。
步骤S3将步骤S2反转录的cDNA进行实时荧光定量PCR，检测 miR-199a-3p表达水平。
使用miScript PCR start Kit(QIAGEN公司，货号218193)试剂盒。将表1所示的反应体系添加到Bio-Rad CFX Connect的qPCR仪器上进行扩增，设置反应条件如下：预变性95℃15min激活聚合酶；变性94℃15s，退火 55℃30s，延伸70℃30s，循环40次，循环末收集荧光信号。
表1实时荧光定量PCR体系组成
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实验结果：9例血浆外泌体内miR-199a-3p相对表达量>1，其中8例病人经临床或组织病理证实为神经母细胞瘤，1例未发现神经母细胞瘤；3例血浆外泌体miR-199a-3p相对表达量≤1，均未发现神经母细胞瘤，见表2。表 2中对照组为未发现神经母细胞瘤的病例，肿瘤组为后证实为神经母细胞瘤的病例。miR-199a-3p对神经母细胞瘤的诊断敏感性达100％，特异性88.9％。由图3可见8例后确诊为神经母细胞瘤组的miR-199a-3p表达水平与4例非神经母细胞瘤组相比，明显增高，且有统计学意义，p值为0.042。实时荧光定量PCR结果如表2所示，取2－△△C t值，△△Ct＝△Ct(试验样品)-△Ct(基准样品)，△Ct(试验样品)＝Ct(试验样品，目的基因)-Ct(试验样品，内参基因)，△Ct(基准样品)＝Ct(基准样品，目的基因)-Ct(基准样品，内参基因)。Ct表示qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数(Cycle Threshold)。C代表Cycle，T代表Threshold。即Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。
表2 12例血样本中miR-199a-3p表达水平
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure DEST_PATH_IMAGE004
综上，本发明检测到神经母细胞瘤患儿的血浆外泌体中miR-199a-3p表达水平增高，与正常对照组比较有统计学意义。血浆外泌体中miR-199a-3p 表达水平可以作为神经母细胞瘤诊断的标志物，临床应用方便快捷、前景良好，对神经母细胞瘤的及时诊断、治疗等方面具有重要意义。
Figure BDA0001909321380000091
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心
<120> 辅助诊断神经母细胞瘤的PCR检测试剂盒及检测miR-199a-3p表达水平的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggacagtag tctgcacatt ggtta 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttttttttt tttttttttt tt 22

Claims (9)

1.一种miR-199a-3p特异性引物在制备辅助诊断神经母细胞瘤的PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于所述试剂盒包括外泌体冲洗液、外泌体RNA提取试剂、miR-199a-3p特异性引物、反转录试剂、以及实时荧光定量PCR检测试剂，所述miR-199a-3p特异性引物序列为正向引物：5'-CGGACAGTAGTCTGCACATTGGTTA-3'，通用反向引物：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述外泌体冲洗液为磷酸缓冲盐溶液；外泌体RNA提取试剂包括：总RNA分离试剂、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇以及无RNA酶的水。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述总RNA分离试剂包括苯酚和异硫氰酸胍。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述反转录试剂包括：通用引物5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'、polyA聚合酶、反转录酶、单核苷酸混合物和缓冲液。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述实时荧光定量PCR检测试剂包括：荧光DNA聚合酶预混物。
6.一种非疾病诊断目的的检测神经母细胞瘤疑似患者的血浆外泌体内miR-199a-3p表达水平的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1，使用权利要求1所述试剂盒中的外泌体冲洗液及外泌体RNA提取试剂得到血浆中的外泌体以及外泌体RNA；
S2，将步骤S1提取到的外泌体RNA使用权利要求1所述试剂盒中的反转录试剂将miR-199a-3p反转录成cDNA；
S3，使用权利要求1所述试剂盒中的miR-199a-3p特异性引物和实时荧光定量PCR检测试剂检测miR-199a-3p表达水平。
7.如权利要求6 所述的方法，其特征在于步骤S1中采用超速离心法提取血浆并使用外泌体冲洗液冲洗得到外泌体。
8.如权利要求6 所述的方法，其特征在于步骤S2反转录条件是37℃孵育60min，95℃失活5min。
9.如权利要求6 所述的方法，其特征在于步骤S3实时荧光定量PCR扩增条件是95℃激活聚合酶15min；94℃变性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，循环40次。
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