CN107043823B - 一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用 - Google Patents

一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用，所述肿瘤标志物为lncRNA，定位于第17号染色体chr17:47785696‑47797422，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为lncRNA‑KAT7。根据lncRNA‑KAT7序列，设计并合成特异性实时荧光定量PCR引物，制备用于结直肠癌诊断或者疗效预测的制剂。利用实时荧光定量PCR制剂，在结直肠癌临床病例标本中检测lncRNA‑KAT7的表达水平，发现lncRNA‑KAT7在结直肠癌中表达显著下调，并具有显著统计学意义(p<0.05)，肠癌中lncRNA‑KAT7低表达与结直肠肿瘤分化、T分期、侵袭转移密切相关。这一结果表明lncRNA‑KAT7可作为结直肠癌的肿瘤标志物，可制备用于结直肠癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的制剂或试剂盒。

Description

一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，涉及一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种具有高度致死性的癌症，发病率居是全球恶性肿瘤的第三位，目前仍是全世界范围内健康关注的热点。尽管结肠直肠癌的诊断和治疗在不断进展，但每年记录有超过120万新的CRC癌症病例和60多万例死亡病例。CRC的发生除了与遗传、年龄、环境因素密切相关，还与不良饮食习惯、肥胖及吸烟等因素有关，具体发病机制尚不十分清楚。转移性疾病是引起结直肠癌患者死亡的主要原因。据官方数据统计，局灶性CRC患者平均年存活率高达90％，而对于具有远处转移的IV期CRC患者仅为6％。引起结直肠癌患者临床疗效降低和生存期短、预后差的关键因素是侵袭与转移，所以侵袭和转移是结直肠癌治疗结果和预后的重要因素。既往人们对结直肠癌发病和转移机理以及耐药机制等方面进行了一系列探讨，认为机体内多种肿瘤相关的关键基因变化或表观遗传学改变可能在其中起到了很大作用。找到和研究新的结直肠癌生物标记物和防治靶标对研究清楚结直肠癌的发生发展机制打下基础并具有重要的意义
长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是无蛋白编码能力的转录产物，长度大于200个核苷酸，参与各种生理过程。在肿瘤的发生发展、侵袭转移、诊断及预后、放化疗疗效等方面起着重要作用。lncRNA可通过表观遗传等作用导致相关基因异常表达，在结直肠癌侵袭与转移中发挥重要调控作用，但绝大部分的lncRNA的功能尚不明确。lncRNA在结直肠癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等多种癌症中发挥着重要的作用。lncRNAs已被鉴定为致癌基因或肿瘤抑制基因或预后预测因子，lncRNAs在CRC的临床相关性仍然很大程度上没有探索。目前尚未有关于lncRNA-KAT7的相关研究报道。因此找到CRC特异性更高的分子诊断标记物和相关的检测技术尤为重要。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种结直肠癌相关的肿瘤标志物。所述肿瘤标志物为lncRNA，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为lncRNA-KAT7，定位于第17号染色体chr17:47785696-47797422，含有2个外显子，转录本序列长度为575bp。本发明研究证实lncRNA-KAT7在结直肠癌组织中表达下调，提示lncRNA-KAT7可作为结直肠癌的肿瘤标记物。lncRNA-KAT7有望成为结直肠癌诊断和预后判断的标志物，同时为结直肠癌的治疗提供了新的靶点。因此，lncRNA-KAT7可用于制备结直肠癌辅助诊断、疗效预测及预后判断制剂。还可用于制备结直肠癌辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒。
所述结直肠癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括lncRNA-KAT7和内参基因GAPDH的特异性引物，所述lncRNA-KAT7和内参基因GAPDH的特异性引物的上游引物和下游引物，所述lncRNA-KAT7的特异性上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述lncRNA-KAT7下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所诉GAPDH的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所诉GAPDH的下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。
所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述特异性引物适用于SYBR Green的检测。另外，试剂盒中还包括标准DNA模板和PCR反应体系，PCR反应体系中的PCR反应液为实时荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。
在利用上述试剂盒检测lncRNA-KAT7的过程如下：
1)提取样品总RNA；
2)制备样品cDNA；
3)定量扩增lncRNA-KAT7。
下面对本发明作进一步说明：
lncRNA-KAT7定位于17号染色体chr17:47785696-47797422，可应用于辅助结直肠癌诊断的试剂盒中。
本发明通过实时荧光定量PCR检测了64例结直肠癌患者的结直肠癌与配对正常肠组织中的lncRNA-KAT7表达水平，发现lncRNA-KAT7在结直肠癌组织与配对正常肠组织中存在差异性表达，且在结直肠癌组织中表达下调。以上结果表明lncRNA-KAT7可能作为新型结直肠癌诊断标志物。
所述结直肠癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒包括：(1)从结直肠癌组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；(2)将总RNA逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶及随机引物；(3)将cDNA实时荧光定量PCR所需试剂，包括lncRNA-KAT7实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；lncRNA-KAT7特异性PCR引物包括：①lncRNA-KAT7上游引物(SEQ ID NO.2)②lncRNA-KAT7下游引物(SEQ ID NO.3)；GAPDH内参特异性PCR引物包括：①GAPDH上游引物(SEQ ID NO.4)②GAPDH下游引物(SEQ ID NO.5)。
本发明为结直肠癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
附图说明
图1为lncRNA-KAT7在结直肠癌中的表达水平。
具体实施方式
所述结直肠癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括：
(1)从结直肠癌和癌盘组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、DEPC水。
(2)将总RNA逆转录为cDNA所用试剂：promega逆转录试剂盒(GoScriptTMReverseTranscriptase，A5003)，包括:GoScriptTM5X Reaction Buffer、MgCl2、PCR NucleotideMix、Recombinant
Figure BDA0001305851650000031
Ribonuclease Inhibitor、GoScriptTMReverseTranscriptase、Nuclease-Free Water。
(3)将cDNA实时荧光定量PCR所用试剂，包括lncRNA-KAT7实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参特异性引物、实时荧光定量SYBR染料(Roche 4887352001 LightCycler480 SYBR Green I Master)、DEPC水。
检测过程如下：
1、结直肠癌和配对的正常结直肠组织总RNA提取
(1)新鲜或-80℃冻存组织约20mg左右，加入1ml Trizol冰上研磨，可先用剪刀剪碎组织，为防止溢出，一般先加400ul Trizol，呆研磨充分，再补齐至1ml。室温放置5-10min。
(2)按Trizol与三氯甲烷的体积比为5比1的比例加入三氯甲烷，涡旋振荡30s，室温放置5min，12000g转速4℃离心15min。
(3)吸取约400ul上清层，尽量小心，避免吸取中间固体层，加入400ul异丙醇，上下颠倒混匀，切勿剧烈振荡。室温放置10min，12000g转速4℃离心10min。
(4)吸弃上清液，用DEPC配制浓度为75％的乙醇加入1ml，在实验台上轻轻磕起沉淀，7500g转速4℃离心5min。
(5)吸弃上清层，室温放置5-10min，加入70左右的PEPC水溶解RNA，-80℃保存。
(6)用1％的琼脂糖凝胶，按1ug的RNA加1ul 6X LoadingBuffer混匀，电泳20min左右，凝胶电泳成像系统照相保存，分析。
(7)Nano Drop检测RNA浓度和纯度，用DEPC水调零，将RNA样品充分混匀，滴加2ul样品在Nano Drop检测探头上，放心测量臂，测量RNA的浓度，记录260/280的比值。
2、将总RNA逆转录为cDNA
采用Promega逆转录试剂盒。
配置如下体系:
体系I：
2ugRNA溶于DEPC水中，加1ul随机引物，补齐至10ul。与PCR仪上70℃5分钟，立即冰浴5分钟。
体系II如表1所示:
表1
Figure BDA0001305851650000041
将体系I和体系II混合，瞬时离心，放入PCR仪中，程序为，
Figure BDA0001305851650000042
实时荧光定量PCR检测lncRNA-KAT7的表达量
实时荧光定量PCR采用罗氏LightCycler 480 SYBR Green I Master试剂盒。
反应体系如下：
Figure BDA0001305851650000043
Figure BDA0001305851650000051
仪器采用Roche 480，实时荧光定量PCR程序为：95℃10min预变性，接40个循环：95℃10s，60℃20s，72℃30s。
本实验数据采用相对定量的分析方法，将GAPDH作为内参基因，计算公式为：
△CT＝△CTKAT7-△CTGAPDH
△△CT＝△CT癌组织-△CT正常组织
相对表达量＝log2-△△CT
利用软件SPSS 18.0行分析实时荧光定量PCR lncRNA-KAT7的相对表达量。发现64例结直肠癌组织与配对正常组织相比，发现结直肠癌组织的lncRNA-KAT7的表达下调，结果见图1。
lncRNA-KAT7表达于病例临床特征的关系：
将总体64个病例根据目标lncRNA在肠癌与配对的正常组织的相对表达值2-ΔΔCT从低到高进行排列，取前后各32例分为低表达组与高表达组。根据上述分组情况，分析目标lncRNA-KAT7高低表达与病例性别、年龄、病灶部位、肿瘤大小、分化级别、有无淋巴结转移、TNM分期等的关系。通过分析发现，肠癌中lncRNR-KAT7低表达与结直肠肿瘤分化、T分期、侵袭转移密切相关，见表1。
表1.lncRNA-KAT-7临床信息表格
Figure BDA0001305851650000052
Figure BDA0001305851650000061
以上结果表明，lncRNA-KAT7可作辅助结直肠癌诊断的新型分子标志物。为结直肠癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 郴州市第一人民医院
<120> 一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 575
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cgggcggcca ggcttctgct gggtcctaat gccaaattcc ttactggagc ttcagcgccg 60
tctagctgct gcccagcgtc agcgacttta cctgctcatt acctaggcac atcactaggc 120
ttccaagggg gagagcggca cagctggtgt ttgtatgctg ctgtttgcgt agccatagcc 180
tgtgaggccc cagagagcag gactcccagt tcccctcgcc caggccaagt gaggcacgga 240
ctgtgggtgc actcagggtg cagccgccac tcaccctcag cagctcctct tctccctgct 300
ccttcacaaa tacctcctcc agctcttggt tgagcccttc caggctcctg tgcaggcagg 360
ggctgagtcg caagacaggg gaccctgagg ggaagctggg aggggacgcc tgaggaagag 420
gcaaatgaca aaatcacaca cagccccacc aggcctagac agtctttcat tctgaccagg 480
ggtaatggtc atgtccacac agcagaactg agtgaatgaa gggtgatttg gggacagtta 540
cagattgcaa taggtccact cagggcagtt ttctc 575
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tccaccctgt tgctgta 17

Claims (2)

1. 一种检测组织中肿瘤标志物的试剂在制备结直肠癌辅助诊断制剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤标志物为lncRNA，定位于第17号染色体chr17:47785696-47797422，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为lncRNA-KAT7。
2. 一种检测组织中肿瘤标志物的试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述肿瘤标志物为lncRNA，定位于第17号染色体chr17:47785696-47797422，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为lncRNA-KAT7。
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