CN108949991B - Loc105369370在直肠腺癌诊断、治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了LOC105369370在直肠腺癌诊断、治疗中的应用。经实验证明，癌旁正常组织相比，癌组织中的LOC105369370表达水平上调。进一步进行细胞实验发现，降低LOC105369370的表达水平，可以显著的抑制细胞的生长增殖，提示LOC105369370可作为可能的潜在靶点应用于直肠腺癌的治疗。

Description

LOC105369370在直肠腺癌诊断、治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及LOC105369370在直肠腺癌诊断、治疗中的用途。

背景技术

恶性肿瘤是全世界范围内严重影响人类健康的主要公共卫生问题，严重威胁着人类的生命健康，也是人类主要死亡因素之一。直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，目前针对直肠癌的所用治疗方法中外科根治性手术切除是唯一能够治愈结直肠癌的。直肠癌外科手术失败的主要因素就是肿瘤转移复发。这也是导致患者死亡的主要原因，因此直肠腺癌的早期发现对于直肠腺癌的治疗具有重要意义。

表观遗传调控在生命发生和发展的每一个阶段均发挥重要作用，然而在各种表观遗传调控过程中几乎都可以观察到RNA分子的身影；近年研究表明RNA已经不局限于中心法则中作为DNA到蛋白的遗传信息传递中间体，而是广泛参与了各种生物学功能。哺乳动物基因组中只有1～2％编码蛋白质，而70～90％的转录子为ncRNA，在这些ncRNA中，长度大于200核苷酸的定义为长链非编码RNA(longnoncoding RNA,1ncRNA)；在所有的ncRNA中，1ncRNA占80％以上(Shi,X.,et al.,Long non-coding RNAs:A new frontier in thestudy of human diseases.Cancer Letters,2013.339(2):p.159-166.)。数目众多的1ncRNA具有多种多样生物学功能，广泛参与了各种生命活动。

随着对直肠腺癌的深入研究，研究发现lncRNA在直肠腺癌发生、发展过程中发挥着重要的作用，寻找与直肠腺癌相关的lncRNA，为直肠腺癌的发病机制的认识和诊疗的水平的提高具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种可用于直肠腺癌诊断的分子标志物LOC105369370基因。相比传统的直肠腺癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断直肠腺癌具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在早期就能知晓疾病风险，从而采取相应的措施。

本发明的目的之二在于提供一种可用于直肠腺癌治疗的分子靶点，通过靶向分子靶点，改变分子靶点的表达情况，从而达到治疗或缓解癌症的效果。

本发明的目的之三在于提供一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，为直肠腺癌药物的发现和研发提供一种分子手段。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测LOC105369370的水平。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别LOC105369370的探针；或

特异性扩增LOC105369370的引物。

在本发明的具体实施方式中，特异性扩增LOC105369370的引物序列如SEQ IDNO.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒，包括本发明第一方面所述的试剂，所述试剂能够检测LOC105369370的表达水平；本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明的第三方面提供了一种芯片，包括本发明第一方面所述的试剂，所述试剂能够检测LOC105369370的表达水平。本发明中所述的芯片包括固相载体，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

本发明的第四方面提供了一种药物组合物，包括LOC105369370的抑制剂，和/或药学上可接受的载体。其中，所述抑制剂选自：以LOC105369370基因为靶序列、且能够抑制LOC105369370基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

进一步，siRNA的序列如SEQ ID NO.7～14所示。

优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.9～10所示。

本发明人在筛选有效的siRNA序列时，通过大量的比对分析，找出最佳的有效片段。通过设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染至细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，序列如SEQ ID NO.9～10所示，进一步地在细胞水平实验，结果证明该siRNA能有效的抑制细胞中LOC105369370基因的水平，从而抑制直肠腺癌细胞的增殖。

在本发明中，药学上可接受的载体包括(但不限于)如缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐等。作为缓冲剂，能够使用磷酸盐、甘氨酸，山梨酸，山梨酸钟，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质例如硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂等。作为乳化剂，能够使用阿拉伯树胶、海藻酸钠、西黄芪胶等。作为悬浮剂，能够使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为稳定剂，能够使用丙二醇、二亚乙基亚硫酸盐、抗坏血酸等。作为防腐剂，能够使用叠氮化钠、苯扎氯铵、对羟苯甲酸、氯丁醇等。

本发明的药物组合物还可以包括离子交换剂如矾土，硬脂酸铝，卵磷脂，半乳化药物递送系统(SEDDS)例如dα-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐，在药物剂型中使用的表面活性剂例如吐温或其它类似聚合递送基质，血清蛋白例如人血清白蛋白，也可以使用环糊精例如α-环糊精、β-环糊精、和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物例如是羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精、或其它增溶衍生物来促进本发明化合物的递送。本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

本发明的药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂，如含水乳糖或无水乳糖、淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、硅酸、微晶纤维素、羟甲基纤维素钠、淀粉甘醇酸钠及其衍生物等。

本发明的药物组合物还包含界面活性剂、乳化剂、扩散剂、消泡剂、涂层材料等。任何药学上或医学上可接受的界面活性剂、乳化剂、扩散剂、消泡剂等皆可被使用。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

本发明的药物组合物还可与其他治疗直肠腺癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

本发明的第五方面提供了一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有LOC105369370基因的培养体系；和

检测所述体系中LOC105369370基因的表达；

其中，若待筛选物质可降低LOC105369370基因的表达或活性，则表明该物质是预防或治疗直肠腺癌的候选药物。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

当将通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、猴子、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成各种剂型。例如，根据需要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药物可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物以一般接受的药物施用方式所需的单位剂型(unit dose)、与药学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质包括但不限于无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、媒介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。根据这些制剂中有效成分的含量，可以获得在指定范围内的合适的给药量。

本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用；

b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊直肠腺癌的产品中的应用；

c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用；

d.本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗直肠腺癌的产品中的应用；

e.LOC105369370在制备治疗直肠腺癌的药物组合物中的应用

f.LOC105369370在筛选治疗直肠腺癌的候选药物中的应用；

g.本发明第五方面所述的方法在筛选治疗直肠腺癌的候选药物中的应用。

进一步，e中所述的药物组合物包括LOC105369370的抑制剂，其中所述抑制剂为能够降低LOC105369370表达水平或活性的物质；在本发明的具体实施方式中，所述抑制剂为降低LOC105369370表达水平的物质，所述物质不限于实施例中针对LOC105369370的siRNA，还可以是针对LOC105369370的shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

本发明的实用性并不局限于对转录本发明的标志物LOC105369370的基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LOC105369370(XR_950269.3)所示的序列。

在本发明中，LOC105369370可以使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

在本发明的上下文中，“诊断直肠腺癌”既包括判断受试者是否已经患有直肠腺癌、也包括判断受试者是否存在患有直肠腺癌的风险。

在本发明的上下文中，“治疗直肠腺癌”从疾病的状态变化来分，可以包括直肠腺癌的缓解、直肠腺癌的完全治愈。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了LOC105369370基因表达与直肠腺癌相关，通过检测受试者中LOC105369370的表达水平，可以判断受试者是否患有直肠腺癌、或者判断受试者是否存在患有直肠腺癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标志物LOC105369370，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现直肠腺癌的早期诊断，从而降低直肠腺癌的死亡率。

附图说明

图1是利用QPCR检测LOC105369370基因在直肠腺癌组织中的表达情况图；

图2是检测siRNA对LOC105369370的沉默效果图；

图3是CCK8法检测LOC105369370对直肠腺癌细胞增殖的影响图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与直肠腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集3例直肠腺癌癌旁正常上皮组织和直肠腺癌组织样本，全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，无其他肿瘤性疾病、自身免疫疾病和严重的慢性疾病，癌旁正常上皮组织取自距肿瘤上缘5cm处，所有的患者均已知情同意，并通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，具体操作按说明书进行。

3、总RNA定量与纯度分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、构建cDNA文库

1)去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；

2)片段化RNA

对完整的RNA序列，利用金属离子进行随机打断，将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。

3)反转合成cDNA

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作详见说明书。

5、测序

使用Illumina X-Ten测序平台进行2*150bp测序。

6、高通量转录组测序数据分析

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；

3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；

4)cuffdiff比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异表达lncRNA的筛选标准：p value<0.05，|log₂FC|>1。

7、结果

结果显示，与癌旁正常上皮组织相比，LOC105369370在直肠腺癌组织中表达显著上调。

实施例2 QPCR测序验证LOC105369370基因的差异表达

1、对LOC105369370基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择直肠腺癌癌旁正常组织和直肠腺癌组织各45例。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

3、QPCR

1)逆转录反应

采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转

a.去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNABμffer 2.0μl，总RNA1μg，加RnaseFree ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min。

b.将10×Fast RT Bμffer 2.0μl，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl。

c.将混合后液体在水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物设计

根据Genebank中LOC105369370基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

LOC105369370基因：

正向引物为5’-TGTATGCCTCCTTAGTCTCAATG-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-AATACCGTGGAACAGTGAAGAT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

3)QPCR扩增检验

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

a.构建反应体系：

2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROXReference Dye^△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。

每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

b.反应条件：

95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。

4)cDNA模板浓度的筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，当cDNA进行10倍稀释时，PCR的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好，因此选择cDNA 10倍稀释进行后续的实验。

5)样品RealTime PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

QPCR结果如图1所示，与直肠腺癌癌旁正常上皮组织相比，LOC105369370在直肠腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；阳性检出率＝上调表达例数/总检测例数×100％＝44/45＝97.78％，提示LOC105369370可应用于直肠腺癌的诊断。

实施例3 LOC105369370基因的沉默

1、细胞培养

人直肠腺癌细胞株HRC-99，以含10％小牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用含EDTA的0.25％胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2、siRNA的设计

针对LOC105369370基因的序列设计siRNA，设计的siRNA序列如下所示：

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；

siRNA1：

正义链：5’-UUUUCACAGAUGAUUCUGCAG-3’(SEQ ID NO.7)，

反义链：5’-GCAGAAUCAUCUGUGAAAACA-3’(SEQ ID NO.8)；

siRNA2：

正义链：5’-AUUUCGAGGGCUACGAAGCUU-3’(SEQ ID NO.9)，

反义链：5’-GCUUCGUAGCCCUCGAAAUAC-3’(SEQ ID NO.10)；

siRNA3：

正义链为5’-UUCCUUUAUUUUUCUGAAGUG-3’(SEQ ID NO.11)，

反义链为5’-CUUCAGAAAAAUAAAGGAAAA-3’(SEQ ID NO.12)

siRNA4：

正义链为5’-UACUGUUUUACUUCUUCAGCU-3’(SEQ ID NO.13)，

反义链为5’-CUGAAGAAGUAAAACAGUAUC-3’(SEQ ID NO.14)

3、转染

将细胞按1×10⁴/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的RPMI1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(HRC-99)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，其中阴性对照组siRNA与LOC105369370基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

4、QPCR检测LOC105369370基因的转录水平

1)细胞总RNA的提取

使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，具体步骤详见说明书。

2)逆转录步骤同实施例2。

3)QPCR扩增步骤同实施例2。

5、结果

结果如图2显示，与HRC-99和siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1～4)能降低LOC105369370的水平，其中siRNA2的效果最为显著，选择siRNA2进行后续实验，以证明LOC105369370的差异表达影响癌细胞的增殖。

实施例4 LOC105369370对直肠腺癌细胞增殖的影响

1、直肠腺癌细胞HRC-99接种于6孔板中培养，待细胞密度达到85％-90％，使用脂质体2000转染siRNA2。无血清培养基培养4-6h后更换新培养基。

2、转染siRNA2后培养24h，将干扰组细胞和对照组细胞消化，在96孔板中接种转染后的HRC-99细胞悬液以及各对照组(100μl/孔)，接种密度为5×10⁴/L。将培养板放在培养箱中预培养；向每孔加入10μl CCK8溶液，将培养板放在培养箱内培养1-4h，使用酶标仪测定在490nm处的吸光度。

3、结果

结果如图3所示，与对照组相比，随着生长时间的增加，siRNA2转染组细胞增殖减缓，差异具有显著统计学意义(P<0.05)，说明LOC105369370可以促进直肠腺癌细胞的生长，提示LOC105369370可作为可能的靶点应用于直肠腺癌的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 王冬国 朱雄文

<120> LOC105369370在直肠腺癌诊断、治疗中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtatgcctc cttagtctca atg 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aataccgtgg aacagtgaag at 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uuuucacaga ugauucugca g 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagaaucau cugugaaaac a 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

auuucgaggg cuacgaagcu u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcuucguagc ccucgaaaua c 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

uuccuuuauu uuucugaagu g 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cuucagaaaa auaaaggaaa a 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

uacuguuuua cuucuucagc u 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cugaagaagu aaaacaguau c 21

Claims (7)

1.一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有LOC105369370 基因的体系；和

检测所述体系中LOC105369370基因的表达；

其中，若待筛选物质可降低LOC105369370基因的表达或活性，则表明该物质是预防或治疗直肠腺癌的候选药物。

2.如下任一项所述的应用：

a.试剂在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述试剂能够检测LOC105369370的水平；

b.试剂盒在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括能够检测LOC105369370的水平的试剂；

c.芯片在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述芯片包括能够检测LOC105369370的水平的试剂；

d.药物组合物在制备治疗直肠腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括LOC105369370的抑制剂，和/或药学上可接受的载体；

e. LOC105369370的抑制剂在制备治疗直肠腺癌的药物组合物中的应用；

f. LOC105369370在筛选治疗直肠腺癌的候选药物中的应用；

g.权利要求1所述的方法在筛选治疗直肠腺癌的候选药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a-c中所述的试剂包括：

特异性识别LOC105369370的探针；

或特异性扩增LOC105369370的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增LOC105369370的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，d-e中所述的抑制剂为siRNA。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.7~14所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.9~10所示。

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