CN107460250B - 基于kif14、kif15和kif20a基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒及其使用方法 - Google Patents

基于kif14、kif15和kif20a基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于检测试剂盒技术领域，具体涉及一种基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括扩增KIF14、KIF15和KIF20A基因的PCR引物对和扩增管家基因GAPDH的PCR引物对。本发明首次发现KIF14、KIF15和KIF20A基因在透明细胞肾癌肿瘤部位和癌旁正常组织转录表达水平存在显著差异。本试剂盒通过联合检测KIF14、KIF15和KIF20A基因转录水平的表达情况并与正常组织表达情况对比，可以快速、高效、精准的诊断透明细胞肾癌。

Description

基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒 及其使用方法
技术领域
本发明属于检测试剂盒技术领域，具体涉及一种基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒及其使用方法。
背景技术
肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的生命健康，且在我国肾癌的发病率呈年轻化且逐年增长的趋势。肾透明细胞癌是肾癌中最常见的组织学类型，占整体肾癌发病率的80％以上。透明细胞肾癌目前诊断主要依赖于影像学检查及组织病理诊断，但无论影像学检查还是病理诊断的结果一般依据相关医务工作者的经验而定，导致诊断结果有一定的不确定性。因此，发现新的透明细胞肾癌特异的分子诊断标记物势在必行。
驱动蛋白超家族(kinesin family)是一类与微管相互作用并为细胞内组分运动提供动力的马达分子，其能使物质沿着微管向细胞两极运动，具有多种生理功能，广泛参与细胞周期的相关进程，如小泡运输、有丝分裂纺锤体形成、染色体分离及胞质分裂的完成等。驱动蛋白家族中部分成员已被证实与癌症有关，但KIF14、KIF15和KIF20A作为驱动蛋白超家族成员，其在透明细胞肾癌中的表达情况尚未有相关报道。
发明内容
本发明主要提供了一种基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒及其使用方法，首次发现KIF14、KIF15和KIF20A的转录水平在透明细胞癌与癌旁存在显著差异。与正常组织相比，透明细胞肾癌组织中KIF14、KIF15和KIF20A表达水平显著上调，且基于每个基因转录水平绘制的透明细胞肾癌诊断受试者工作特征曲线(Receiveroperating characteristic,ROC)的曲线下面积(Area under the curve,AUC)均大于0.75，三个基因联合诊断AUC更是达到0.955。通过检测KIF14、KIF15和KIF20A基因的表达水平，能够便捷、快速、精准的诊断透明细胞肾癌。其技术方案如下：
一种基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒，包括扩增KIF14、KIF15和KIF20A基因的PCR引物对，所述引物对为：
KIF14正向引物序列为5’-TGTAGGTAGATTGGCACTTCAGA-3’，如SEQ ID NO：1所示；
KIF14反向引物序列为5’-CGACGTTGTAATGTAAGACGTGT-3’，如SEQ ID NO：2所示；
KIF15正向引物序列为5’-AGGAATCTGTATTCGCAACTGTG-3’，如SEQ ID NO：3所示；
KIF15反向引物序列为5’-ACTTCGTGGGATTACTCCTCTC-3’，如SEQ ID NO：4所示；
KIF20A正向引物序列为5’-TTGAGGGTTAGGCCCTTGTTA-3’，如SEQ ID NO：5所示；
KIF20A反向引物序列为5’-GTCCTTGGGTGCTTGTAGAAC-3’，如SEQ ID NO：6所示；
优选的，所述试剂盒还包括扩增管家基因GAPDH的PCR引物对，所述引物对为：
正向引物序列为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，如SEQID NO：7所示；
反向引物序列为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，如SEQID NO：8所示。
优选的，所述试剂盒还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料、无酶水和荧光定量加样板。
优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和无酶水。
优选的，所述试剂盒还包括将mRNA反转录为cDNA的体系，该反转录体系包含gDNAEraser、gDNA Eraser Buffer、T重复寡核苷酸Oligo(dT)、反转录反应液、反转录酶和dNTPs。
一种基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)将获取的新鲜组织经过液氮处理研磨后进行RNA抽提；
(2)将抽提出的RNA反转录成对应的cDNA；
(3)将反转录后的cDNA进行对KIF14、KIF15、KIF20A和GAPDH基因的荧光定量PCR扩增；
(4)以GAPDH作为内参，记录每个反应的Ct值，检测结果以ΔCt表示，其中ΔCt＝CtGene-CtGAPDH。
KIF14、KIF15和KIF20A基因在制备透明细胞肾癌诊断试剂盒中的应用。
采用上述方案，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次公开了KIF14、KIF15和KIF20A基因与透明细胞肾癌发生发展相关，KIF14、KIF15和KIF20A基因有望成为诊断透明细胞肾癌的分子标志物，并为研究透明细胞肾癌疾病进展的分子机理提供新的思路；
(2)KIF14、KIF15和KIF20A基因在正常肾脏组织和透明细胞肾癌中的转录表达水平存在显著差异，与正常肾脏组织相比，KIF14、KIF15和KIF20A基因在透明细胞肾癌组织中表达显著上调，由3个基因联合对于诊断透明细胞肾癌的ROC曲线可知，其AUC达到0.955，诊断具有较高准确性且均高于独立诊断AUC，可知联合诊断效果显著。通过检测KIF14、KIF15和KIF20A基因转录水平的表达情况，可以诊断透明细胞肾癌，从而可以制备含有KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒，利用检测基因转录水平表达的方式诊断透明细胞肾癌的方法更加灵敏更加特异，有利于疾病早期的诊断；
(3)本发明还提示可以通过干预KIF14、KIF15和KIF20A的表达阻断透明细胞肾癌疾病进展，其有可能作为透明细胞肾癌未来靶向治疗的特定靶点，为透明细胞肾癌疾病的治疗提供新思路。
附图说明
图1为TCGA数据库中KIF14、KIF15和KIF20A基因mRNA在透明细胞肾癌患者正常肾脏组织和肿瘤组织中的表达情况；
图2为基于TCGA数据库KIF14、KIF15和KIF20A基因mRNA在透明细胞肾癌患者正常肾脏组织和肿瘤组织中的表达情况绘制的独立透明细胞肾癌诊断ROC曲线；
图3为基于TCGA数据库KIF14、KIF15和KIF20A基因mRNA在透明细胞肾癌患者正常肾脏组织和肿瘤组织中的表达情况绘制的3基因联合诊断透明细胞肾癌的ROC曲线；
图4为临床样本来源的KIF14、KIF15和KIF20A基因mRNA在透明细胞肾癌患者正常肾脏组织和肿瘤组织中的表达情况；
图5为基于临床样本来源的KIF14、KIF15和KIF20A基因mRNA在透明细胞肾癌患者正常肾脏组织和肿瘤组织中的表达情况绘制的独立透明细胞肾癌诊断ROC曲线；
图6为基于临床样本来源的KIF14、KIF15和KIF20A基因mRNA在透明细胞肾癌患者正常肾脏组织和肿瘤组织中的表达情况绘制的3基因联合诊断透明细胞肾癌的ROC曲线。
具体实施方式
具体实施例
以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
一、TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库对比透明细胞肾癌与癌旁组织中KIF14、KIF15和KIF20A差异表达
肿瘤基因图谱计划(The Cancer Genome Atlas，TCGA)项目组最初由美国国家肿瘤研究所(The national cancer institute，NCI)和美国国家人类基因组研究所(Thenational human genome research institute，NHGRI)组成，并发展成一个非常大的研究数据平台。透明细胞肾癌数据下载于UCSC Cancer Browser(https://genome-cancer.ucsc.edu)，Illumina HiSeq结果。其中癌旁组织(Normal)包含72例，癌组织(Cancer)包含534例。KIF14、KIF15和KIF20A基因转录水平在癌旁组织和癌组织中的表达差异结果如图1所示。如图1，t检验分析表明，KIF14、KIF15和KIF20A在癌旁组织和癌组织中表达差异极其显著，P<0.0001。
二、基于TCGA数据库KIF14、KIF15和KIF20A表达的透明细胞肾癌单独诊断ROC曲线
基于KIF14、KIF15和KIF20A在上述透明细胞肾癌癌旁72例和癌组织534例的表达情况，绘制3个基因单独对于诊断透明细胞肾癌的ROC曲线。在ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。结果如图2所示，KIF14单独诊断透明细胞肾癌的AUC为0.864，KIF15单独诊断透明细胞肾癌的AUC为0.786，KIF20A单独诊断透明细胞肾癌的AUC为0.891。
三、基于TCGA数据库KIF14、KIF15和KIF20A表达的透明细胞肾癌联合诊断ROC曲线
基于KIF14、KIF15和KIF20A在上述透明细胞肾癌癌旁72例和癌组织534例的表达情况，绘制3个基因联合对于诊断透明细胞肾癌的ROC曲线。结果如图3所示，KIF14、KIF15和KIF20A联合诊断透明细胞肾癌的ROC曲线，AUC为0.939，说明联合诊断透明细胞肾癌具有较高的准确性且均高于独立诊断效果。
四、临床组织样本对比透明细胞肾癌与癌旁组织中KIF14、KIF15和KIF20A差异表达
从郑州大学第一附属医院泌尿外科收取经病理认证的透明细胞肾癌与癌旁配对组织共计20对，KIF14、KIF15和KIF20A基因转录水平在癌旁组织和癌组织中的表达差异结果如图4所示。如图4，t检验分析表明，KIF14、KIF15和KIF20A在癌旁组织和癌组织中表达差异显著，P<0.05。
五、基于临床组织样本KIF14、KIF15和KIF20A表达的透明细胞肾癌单独诊断ROC曲线
基于KIF14、KIF15和KIF20A在上述透明细胞肾癌20对临床样本中的表达情况，绘制3个基因单独对于诊断透明细胞肾癌的ROC曲线。结果如图5所示，KIF14单独诊断透明细胞肾癌的AUC为0.855，KIF15单独诊断透明细胞肾癌的AUC为0.770，KIF20A单独诊断透明细胞肾癌的AUC为0.878。
六、基于临床组织样本KIF14、KIF15和KIF20A表达的透明细胞肾癌联合诊断ROC曲线
基于KIF14、KIF15和KIF20A在上述透明细胞肾癌20对临床样本中的表达情况，绘制3个基因联合对于诊断透明细胞肾癌的ROC曲线。结果如图6所示，KIF14、KIF15和KIF20A联合诊断透明细胞肾癌的ROC曲线，AUC为0.995，诊断具有较高准确性且均高于独立诊断AUC，联合诊断效果显著。
七、基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒制备及使用
1透明细胞肾癌诊断试剂盒包括扩增KIF14、KIF15和KIF20A基因的PCR引物对、扩增管家基因GAPDH的PCR引物对、SYBRGreen聚合酶链式反应体系、RNA提取试剂、mRNA反转录为cDNA的体系。
其中扩增KIF14基因的PCR引物对为：
正向引物序列为5’-TGTAGGTAGATTGGCACTTCAGA-3’，如SEQ ID NO：1所示；
反向引物序列为5’-CGACGTTGTAATGTAAGACGTGT-3’，如SEQ ID NO：2所示。
扩增KIF15基因的PCR引物对为：
正向引物序列为5’-AGGAATCTGTATTCGCAACTGTG-3’，如SEQ ID NO：3所示；
反向引物序列为5’-ACTTCGTGGGATTACTCCTCTC-3’，如SEQID NO：4所示。
扩增KIF20A基因的PCR引物对为：
正向引物序列为5’-TTGAGGGTTAGGCCCTTGTTA-3’，如SEQID NO：5所示；
反向引物序列为5’-GTCCTTGGGTGCTTGTAGAAC-3’，如SEQID NO：6所示。
扩增管家基因GAPDH的PCR引物对为：
正向引物序列为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，如SEQID NO：7所示；
反向引物序列为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，如SEQID NO：8所示。
所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料、无酶水和荧光定量加样板。
所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和无酶水。
所述反转录为cDNA的体系包含T重复寡核苷酸Oligo(dT)、反转录反应液、反转录酶、RNA酶抑制剂和dNTPs。
2.诊断试剂盒的检测过程如下：
1)将待测的新鲜组织在液氮作用下研碎，在碎裂后的组织中加入1mL Trizol，使用1mL的移液枪反复吹打，室温孵育5min，充分分离核蛋白复合物；
2)每管加入500μL氯仿，上下颠倒混匀10次。待溶液充分乳化后，室温静置5min。4℃离心，12000rpm，15min；
3)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的水相、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取水相转移至新的离心管中；
4)向水相中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置10min；4℃，12 000rpm离心10min，离心后，EP管底部会出现沉淀；
5)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入l mL预冷75％乙醇(切勿触及沉淀)，12000rpm，4℃离心5min，弃去上清；
6)室温干燥沉淀2-5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀；
7)利用Nanodrop检测RNA的浓度及纯度。OD260/OD280比值在1.80-2.0之间，说明RNA纯度符合实验要求。
8)反转录：首先配置5×gDNA Eraser Buffer(2μL)、gDNA Eraser(1μL)、RNA(1μ)和RNase-free水混合体系，共10μL，42℃，2min；将5×PrimeScript buffer 2(4μL)、PrimeScript RT Enzyme Mix(1μL)、RT Primer Mix(1μL)、RNase-free水(4μL)及上述混合液(10μL)进行混合，短暂离心后放入PCR仪，反应条件：37℃反应15min，85℃反应5秒，获得CDNA；
9)加样：将荧光定量板置于冰上，每个样本设2个复孔，将cDNA(稀释4～5倍，稀释后加2μL)、SYBER Green和RCR缓冲液混合一起每孔12μL，引物每孔8μL，配置好总体系后进行分装，减少误差；
10)加样结束后，使用PE手套小心将荧光定量板膜盖上密封板，离心，避免气泡产生；
11)设置程序：95℃10min；95℃10s，60℃10s，72℃10s，40个循环+溶解曲线；
12)实验数据分析：以GAPDH作为内参，记录每个反应的Ct值，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。ΔCt＝CtGene-CtGAPDH，ΔCt越小表示其起始拷贝数越多，表达越高。对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒及其使用方法
<130> 1
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaggtaga ttggcacttc aga 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacgttgta atgtaagacg tgt 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggaatctgt attcgcaact gtg 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acttcgtggg attactcctc tc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgagggtta ggcccttgtt a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtccttgggt gcttgtagaa c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcaccgtcaa ggctgagaac 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggtgaagac gccagtgga 19

Claims (5)

1.一种基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括扩增KIF14、KIF15和KIF20A基因的PCR引物对，所述引物对为：
KIF14正向引物序列为5’-TGTAGGTAGATTGGCACTTCAGA-3’，如SEQ ID NO：1所示；
KIF14反向引物序列为5’-CGACGTTGTAATGTAAGACGTGT-3’，如SEQ ID NO：2所示；
KIF15正向引物序列为5’-AGGAATCTGTATTCGCAACTGTG-3’，如SEQ ID NO：3所示；
KIF15反向引物序列为5’-ACTTCGTGGGATTACTCCTCTC-3’，如SEQ ID NO：4所示；
KIF20A正向引物序列为5’-TTGAGGGTTAGGCCCTTGTTA-3’，如SEQ ID NO：5所示；
KIF20A反向引物序列为5’-GTCCTTGGGTGCTTGTAGAAC-3’，如SEQ ID NO：6所示。
2.根据权利要求1所述的基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括扩增管家基因GAPDH的PCR引物对，所述引物对为：
正向引物序列为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，如SEQ ID NO：7所示；
反向引物序列为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，如SEQ ID NO：8所示。
3.根据权利要求1所述的基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料、无酶水和荧光定量加样板。
4.根据权利要求1所述的基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和无酶水。
5.根据权利要求1所述的基于KIF14、KIF15和KIF20A基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括将mRNA反转录为cDNA的体系，该反转录体系包含gDNAEraser、gDNA Eraser Buffer、T重复寡核苷酸Oligo(dT)、反转录反应液、反转录酶和dNTPs。
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