CN116121376A - Nmrk2作为诊断基因易位性肾细胞癌标记物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NMRK2作为诊断基因易位性肾细胞癌标记物的应用，并基于该应用提供了一种快速简便并且准确的Xp11.2 tRCC的临床诊断的试剂盒。采用NMRK2作为诊断基因易位性肾细胞癌标记物能够准确的将Xp11.2 tRCC与肾透明细胞癌或乳头状肾细胞癌予以区分，当采用本发明提供的试剂盒检测到待测肾癌组织的NMRK2的CT值与PPIA的CT值相差小于6时，即可判断待测肾癌组织诊断为Xp11.2 tRCC。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种NMRK2作为诊断基因易位性肾细胞癌标记物的应用。
背景技术
基因易位性肾细胞癌（translocation Renal Cell Carcinoma, tRCC）是一种恶性程度较高的少见肾癌类型，占所有肾癌的2%-5%，多发生于儿童和年轻人，在最新的WHO肾脏肿瘤病理分类中被归为MiT家族易位性肾癌，主要涉及MiT转录因子家族两个成员(TFE3和TFEB)与不同的基因发生融合，其中TFE3与伙伴基因融合导致的Xp11.2 tRCC（Xp11.2 易位性肾细胞癌）约占所有tRCC的90%。TFE3与不同伙伴基因融合导致的Xp11.2 tRCC可能具有不同的临床特征，增加了患者诊断和治疗的难度。由于缺乏准确的诊断标志物，Xp11.2tRCC的病理表现又与肾透明细胞癌（Kidney Renal Clear Cell Carcinoma，KIRC）或乳头状肾细胞癌（Kidney Renal Papillary Cell Carcinoma, KIRP）具有相似之处，所以Xp11.2 tRCC常被误诊为KIRC或KIRP。
目前用于诊断Xp11.2 tRCC的标志物主要包括TFE3、组织蛋白酶K、melan A和HMB45，这些指标的诊断特异性较差，利用上述标志物进行筛查，大部分免疫组化阳性的患者并不是Xp11.2 tRCC，需要检测之后再采用FISH或基因检测去明确诊断，而FISH一方面技术流程十分复杂，同时又难以诊断 TFE3 与定位于 X 染色体的伙伴基因融合导致的Xp11.2 tRCC，并且绝大多数医院并不针对Xp11.2 tRCC开展FISH或基因检测项目，大大增加了患者诊断的工作量和难度，针对现有技术的缺点，发现一种可靠的Xp11.2 tRCC标志物有重要临床意义。
发明内容
本发明提供了一种NMRK2（烟酰胺核苷激酶 2）作为诊断基因易位性肾细胞癌标记物的应用，所述应用不包括疾病的治疗和诊断方法。
具体的，所述应用可以为制备用于诊断基因易位性肾细胞癌的检测试剂盒或生物芯片。
所述基因易位性肾细胞癌为Xp11.2 易位性肾细胞癌。
待测肾癌组织的NMRK2表达量与癌旁组织、乳头状肾细胞癌组织以及肾透明细胞癌组织相比均升高，则判断此肾癌为Xp11.2基因易位性肾细胞癌。
本发明还提供一种用于基因易位性肾细胞癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包括检测
NMRK2 RNA或其编码蛋白表达量的诊断试剂。
具体的，所述试剂盒包括特异性扩增
NMRK2的引物对，所述引物对的序列如SEQ IDNO.1-2所示。
进一步的，所述试剂盒还包括特异性扩增内参基因
PPIA的引物对。
所述特异性扩增内参基因
PPIA的引物对的序列如SEQ ID NO.3-4所示。
更进一步的，所述试剂盒还包括Xp11.2易位性肾细胞癌阳性对照cDNA及阴性对照cDNA。具体的，所述阳性对照cDNA为利用稳定过表达NMRK2的293T细胞提取RNA后反转录得到的cDNA；所述阴性对照cDNA：利用293T细胞提取RNA后反转录得到的cDNA。
采用所述试剂盒诊断Xp11.2易位性肾细胞癌的方法为：
（1）提取待测样品中的RNA，逆转录为cDNA；
（2）荧光定量PCR检测待测肾癌组织中
NMRK2表达；
（3）阳性对照
PPIA和
NMRK2的CT值均小于20，阴性对照
NMRK2的CT值大于25，认为试剂盒结果有效；待测肾癌组织
NMRK2的CT值与内参
PPIA的CT值相差小于6，则判断待测肾癌组织为Xp11.2 tRCC。
本发明的有益效果包括：
本发明提供了一种NMRK2作为诊断基因易位性肾细胞癌标志物的新用途，并基于该新用途提供了一种快速简便并且准确的Xp11.2 tRCC的临床诊断的试剂盒。采用NMRK2作为诊断基因易位性肾细胞癌标记物能够准确的将Xp11.2 tRCC与肾透明细胞癌或乳头状肾细胞癌予以区分。当采用本发明提供的试剂盒检测到待测肾癌组织的
NMRK2的CT值与
PPIA的CT值相差小于6时，即可判断待测肾癌组织诊断为Xp11.2 tRCC。
准确有效的诊断指标的应用能够帮助临床选择更加有效的治疗手段，治疗后提示对某些患者进行及时的监测，对提高Xp11.2 tRCC的治疗响应度以及降低Xp11.2 tRCC患者的复发率，延长Xp11.2 tRCC患者的生存期并提高患者的生活质量，进一步减轻肾癌带来的个人、家庭和社会负担，具有十分重要的现实意义。有效的Xp11.2 tRCC诊断指标的应用将为患者带来福音，产生巨大的社会和经济效益。另外准确有效的诊断标志还能够促进易位性肾癌基础研究的进展，为开发更有效的治疗药物的奠定基础，推动肾癌领域的研究进展。
附图说明
图1为
NMRK2在不同样本中的表达量分析图；
图2为
NMRK2诊断Xp11.2 tRCC效能的ROC 曲线图；
图3为
NMRK2在解放军总医院的不同样本中中特异性表达量分析图；
图4为利用解放军总医院的临床样本的
NMRK2诊断Xp11.2 tRCC效能的ROC 曲线图；
图5为利用解放军总医院的临床样本明确NMRK2诊断Xp11.2 tRCC的阈值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、
NMRK2作为诊断基因易位性肾细胞癌标志物的筛选
（1）大数据分析
NMRK2在Xp11.2 tRCC中特异性差异表达
利用 TCGA 数据库中的RNA-seq 数据分析
NMRK2在不同样本中的表达量。
纳入TCGA中RNA-seq明确是Xp11.2 tRCC的肿瘤样本14例（Xp11.2 tRCC T）、Xp11.2 tRCC癌旁样本5例（Xp11.2 tRCC N）、乳头状肾细胞癌肿瘤样本280例（KIRP T）、乳头状肾细胞癌癌旁样本29例（KIRP N）、肾透明细胞癌肿瘤样本532例（KIRC T）、肾透明细胞癌癌旁样本70例（KIRC N）。
分析结果显示，与其他肾癌类型或者癌旁相比，
NMRK2在Xp11.2 tRCC中特异性高表达，结果见图1。
（2）大数据分析
NMRK2诊断Xp11.2 tRCC效能
利用 TCGA 数据库和GEO数据库中的RNA-seq数据分析
NMRK2诊断Xp11.2 tRCC的诊断效能。
纳入TCGA和GEO中经RNA-seq或是FISH明确为Xp11.2 tRCC的肿瘤样本（Xp11.2tRCC）77例（其中TCGA数据库14例，GEO数据库63例），Xp11.2 tRCC癌旁样本（Xp11.2 tRCCNC）19例 （其中TCGA数据库5例，GEO数据库14例），乳头状肾细胞癌肿瘤样本（KIRP）280例（TCGA数据库280例），肾透明细胞癌肿瘤样本（KIRC）532例 （TCGA数据库532例）。
如图2所示，ROC曲线分析结果显示，利用
NMRK2诊断Xp11.2 tRCC的曲线下面积均不低于0.99，说明利用NMRK2的表达区分Xp11.2 tRCC和KIRP以及KIRC的灵敏度和特异性均较好，NMRK2作为诊断Xp11.2 tRCC的标志具有良好的可行性。
（3）利用解放军总医院的临床样本分析
NMRK2在Xp11.2 tRCC中特异性表达
纳入FISH明确诊断为Xp11.2 tRCC的肿瘤样本（Xp11.2 tRCC T）12例，Xp11.2tRCC癌旁样本（Xp11.2 tRCC N）12例，FISH排除Xp11.2 tRCC后确诊为乳头状肾细胞癌样本（KIRP T）和肾透明细胞癌肿瘤样本（KIRC T）各40例，乳头状肾细胞癌旁样本（KIRP N）与肾透明细胞癌癌旁样本（KIRC N）各40例。
结果显示，与确诊为乳头状肾细胞癌和透明细胞癌的肿瘤及三种肿瘤的癌旁样本相比，
NMRK2在Xp11.2 tRCC中特异性高表达，结果见图3。
（4）利用解放军总医院的临床样本分析
NMRK2诊断Xp11.2 tRCC的效能。
纳入FISH明确诊断为Xp11.2 tRCC的肿瘤样本（Xp11.2 tRCC）12例，Xp11.2 tRCC癌旁样本（Xp11.2 tRCC NC）12例，FISH排除Xp11.2 tRCC后确诊为乳头状肾细胞癌样本（KIRP）和肾透明细胞癌肿瘤样本（KIRC）各40例。
如图4所示，ROC曲线分析结果显示利用
NMRK2诊断Xp11.2 tRCC的曲线下面积均不低于0.998，说明利用NMRK2的表达区分Xp11.2 tRCC和KIRP以及KIRC的灵敏度和特异性均较好，NMRK2作为诊断Xp11.2 tRCC的标志物具有良好的可行性，验证了利用数据库分析得到的结论。
（5）利用解放军总医院的临床样本明确NMRK2诊断Xp11.2 tRCC的阈值。
纳入FISH明确诊断为Xp11.2 tRCC的肿瘤样本（Xp11.2 tRCC）12例，Xp11.2 tRCC癌旁样本（NC）12例，FISH排除Xp11.2 tRCC后确诊为乳头状肾细胞癌样本（KIRP）和肾透明细胞癌肿瘤样本（KIRC）各40例。利用Realtime PCR获得各样本
NMRK2以及
PPIA的CT值，并利用
NMRK2的CT值减去
PPIA的CT值获取各样本的δCT值。
如图5所示，Xp11.2 tRCC肿瘤样本的δCT值均小于6，而其他各组样本的δCT值均大于6。说明利用
NMRK2的Realtime PCR结果诊断Xp11.2 tRCC时，
NMRK2的CT值减去
PPIA的CT值得到的δCT值小于6即可确认待测样本为Xp11.2 tRCC。
实施例2、
NMRK2作为诊断基因易位性肾细胞癌标志物的应用
1、试剂耗材、检测用引物准备
RNA快速提取试剂盒（Tissue RNA Purification Kit Plus，RN002plus），三氯甲烷，无水乙醇，无RNA酶1.5ml EP管，快速逆转录试剂盒（Fast All-in-onerTKit，RT001），荧光定量PCR试剂盒 （2x Super SYBR Green qPCR Master Mix, QP002）。
NMRK2基因的荧光定量PCR引物:
NMRK2-F：5’-GCTGCCTTGGAAGTCGTCC-3’（SEQ ID NO.1）；
NMRK2-R：5’-GATGGATCACGCAGCAGTTG-3’ （SEQ ID NO.2）。
内参基因
PPIA（肽基脯氨酰异构酶A）的荧光定量PCR引物:
PPIA-F：5’-CCCACCGTGTTCTTCGACATT-3’ （SEQ ID NO.3）；
PPIA-R：5’-GGACCCGTATGCTTTAGGATGA-3’ （SEQ ID NO.4）。
阳性对照cDNA：利用稳定过表达NMRK2的293T细胞提取RNA后反转录得到的cDNA。
阴性对照cDNA：利用293T细胞提取RNA后反转录得到的cDNA。
2、操作步骤
（一）提取RNA（Tissue RNA Purification Kit Plus，RN002plus）
(1) 切取1~50mg的组织小块至称过重的1.5ml离心管，称量得到组织重量。
(2) 加入500ul的LysisBuffer，用电动匀浆机、组织破碎仪或研磨棒匀浆。
(3) 室温静置5分钟，以充分裂解组织。
(4) 加入100ul的氯仿，用手震荡混匀，室温静置3分钟。
(5) 12000×g，4℃离心2分钟，小心地吸出上清，注意不要吸到中间层和有机相。将上清转移到新的1.5ml离心管中(可吸出大约250ul上清)。上柱/RNA结合。
(6) 向吸出的上清中加入等体积的无水乙醇充分混匀，加入离心柱。
(7) 4000×g，4℃离心1分钟。
(8) 向RNA柱中加入500ul的WashBuffer2， 12000×g，4℃离心1分钟，倒掉废液，将收集管管口残留的液体用吸水纸吸干净。
(9) 将RNA柱放回收集管，12000×g，4℃离心1分钟，以完全去除可能残留的WashBuffer。
(10) 将离心柱取出，放进一个新的无RNA酶的15ml离心管中，开盖晾干2分钟。
(11) RNA洗脱。在RNA柱的膜中心部位加入20~50ul的ElutionBuffer，室温静置2分钟。
(12) 12000×g，4℃离心1分钟(洗脱下来的RNA溶液重新加入柱中，静置5分钟，再次离心可提高洗脱效率，得到更多RNA)，洗脱的RNA置于冰上。
(13) 测定洗脱的RNA浓度，以便于后续实验使用。提取出来的RNA可立即用于后续实验，也可保存在-80℃备用。
（二）逆转录 (Fast All-in-onerTKit，RT001)
1）取1μg总RNA，加入2μlDNA酶，加水至16ul ，用移液器轻柔吹打5~10次混匀。
2）室温(约25℃)反应5分钟，置于冰上待用。
3）按照下表配制逆转录反应体系:
| 成分 | 体积(20pl体系) |
| DNA酶处理过的总RNA | 16 ul |
| 5×RT Mix | 4 μl |
4）用移液器吹打10次，充分混匀。
5）42℃反应15分钟。稀释5~10倍后作为模板进行qPCR，或者冻存于-80℃冰箱保存。
（三）荧光定量PCR (2× Super SYBR Green qPCR Master Mix, QP002)
qPCR反应体系
模板的建议用量为cDNA1~10ng。
一些常见机型的ROX参比染料选择:
qPCR反应程序
一般采用两步法进行反应，可按照下表设置程序:
（四）结果判断
阳性对照
PPIA和
NMRK2的CT值均小于20，阴性对照CT值大于25，认为试剂盒结果有效。待测肾癌组织
NMRK2的CT值与内参
PPIA的CT值相差小于6，则判断此肾癌组织为Xp11.2基因易位性肾细胞癌。
Claims (10)
1. NMRK2作为诊断基因易位性肾细胞癌标记物的应用，所述应用不包括疾病的治疗和诊断方法。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为制备用于诊断基因易位性肾细胞癌的检测试剂盒或生物芯片。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因易位性肾细胞癌为Xp11.2 易位性肾细胞癌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，待测肾癌组织的NMRK2表达量与癌旁组织、乳头状肾细胞癌组织以及肾透明细胞癌组织相比均升高，则判断此肾癌为Xp11.2基因易位性肾细胞癌。
5. 一种用于基因易位性肾细胞癌诊断的试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒包括检测NMRK2 RNA或其编码蛋白表达量的诊断试剂。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增NMRK2的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.1-2所示。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括特异性扩增内参基因PPIA的引物对。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增内参基因PPIA的引物对的序列如SEQ ID NO.3-4所示。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Xp11.2易位性肾细胞癌阳性对照cDNA及阴性对照cDNA；
所述阳性对照cDNA为利用稳定过表达NMRK2的293T细胞提取RNA后反转录得到的cDNA；所述阴性对照cDNA：利用293T细胞提取RNA后反转录得到的cDNA。
10.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒诊断Xp11.2易位性肾细胞癌的方法为：
提取待测样品中的RNA，逆转录为cDNA；
荧光定量PCR检测待测肾癌组织中NMRK2表达；
阳性对照PPIA和NMRK2的CT值均小于20，阴性对照NMRK2的CT值大于25，认为试剂盒结果有效；NMRK2的CT值与PPIA的CT值相差小于6，则待测肾癌组织诊断为Xp11.2 tRCC。
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| CN202211270339.4A CN116121376A (zh) | 2022-10-18 | 2022-10-18 | Nmrk2作为诊断基因易位性肾细胞癌标记物的应用 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116895331A (zh) * | 2023-09-11 | 2023-10-17 | 四川大学华西医院 | Tfe3重排型肾癌分型分析方法、装置、设备及存储介质 |
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| CN107460250A (zh) * | 2017-09-28 | 2017-12-12 | 郑州大学第附属医院 | 基于kif14、kif15和kif20a基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒及其使用方法 |
| US20220319638A1 (en) * | 2021-03-09 | 2022-10-06 | Bostongene Corporation | Predicting response to treatments in patients with clear cell renal cell carcinoma |
-
2022
- 2022-10-18 CN CN202211270339.4A patent/CN116121376A/zh active Pending
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