CN114085906A - 一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，最新的统计数据显示，在全世界女性恶性肿瘤中，发病率具第一位，死亡率居第二位。乳腺癌的早期诊断可以显著提高患者的生存期。本发明涉及一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒，由人血清中的hsa‑miR‑1292‑5p,hsa‑miR‑887‑5p,hsa‑miR‑4658，hsa‑miR‑6783‑3p，hsa‑miR‑3156‑5p和hsa‑miR‑5581‑3p中的1种或多种组成，内参基因为U6，并提供了上述miRNA及U6的特异性引物。还提供了阳性质控品、阴性质控品、poly‑A加尾酶、逆转录酶等试剂盒检测必须的试剂及达到检测目的所需的技术解决方案。本发明可以更早期的检测出血清中一些瘤源性miRNA的异常升高，用于临床早期乳腺癌辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体的涉及一种乳腺癌miRNA标志物的联合检测试剂盒。
背景技术
乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，目前在全世界的发病率和死亡率都高居其它恶性肿瘤之首。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势，美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国虽不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家1～2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位。由于早期乳腺癌患者的症状不明显，大多数病人确诊时已处于中晚期阶段，因此在乳腺癌的预防和治疗中，提高乳腺癌的早期诊断起着至关重要的作用。目前乳腺癌的早期诊断主要依赖影像技术和肿瘤标志物的检测。低剂量计算机断层扫描(LDCT)具有较高的灵敏度，是最常见的乳腺癌筛查和诊断手段。但CT假阳性较高、检测费用高，并且辐射对人体还有潜在的伤害。血清肿瘤标志物的检测因其安全无害，费用低且简单可行，在早期乳腺癌的筛查和诊断中具有重要的作用。
微小RNA(m1RNA)是一类高度保守、内源性、非编码的单链小分子RNA，其长度约为19~25nt，主要参与基因转录和转录后水平的调控，可调节不同的生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡、劲附和死亡等，与癌症的形成和演变密切相关。miRNA会因为细胞的死亡或者细胞主动分泌进入到血液循环中，miRNAs在血液中是非常稳定的，与mRNAs相比不太容易发生核酸酶降解。比如，在室温下孵育血浆样品长达24小时，对循环miRNAs水平的影响较小,此外，即使经过多次冻融循环，miRNAs在血浆样品中仍保持相对稳定。另外miRNAs很容易定量，并在不同的病理生理条件下存在差异表达。大量研究表明，miRNAs检测更早期、更方便、更准确、实现无创诊断。所以，miRNA可以有效用于乳腺癌的早期诊断。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒，可以简单有效且无创的对乳腺癌进行检测。
为实现本发明的目的，整体技术方案如下：
提供了一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合，由人血清中的hsa-miR-1292-5p ,hsa-miR-887-5p ,hsa-miR-4658，hsa-miR-6783-3p，hsa-miR-3156-5p和hsa-miR-5581-3p中的1种或多种组成。
上述的miRNA标志物组合在乳腺癌诊断中的应用。
上述的miRNA标志物组合在制备检测试剂盒中的应用。
进一步的，使用上述的miRNA标志物组合检测试剂盒中的引物和试剂，进行反转录及qPCR扩增。
本发明所涉及的hsa-miR-1292-5p，hsa-miR-887-5p，hsa-miR-4658，hsa-miR-6783-3p，hsa-miR-3156-5p和hsa-miR-5581-3p中的每种miRNA的序列是已知公开的。
表1 上述miRNA序列及U6的公共数据库信息
上述检测试剂盒中的引物是6种miRNA标志物的qPCR正向引物及作为内参的U6的qPCR扩增引物。
上述一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合的检测试剂盒，所用试剂为Poly-A加尾法反转录试剂及qPCR法检测试剂。
由于本发明使用的是Poly-A加尾法对miRNA进行反转录，故反转录引物和pPCR的反向引物均为通用引物，仅通过qPCR的正向引物识别6种miRNA标志物及内参U6即可。
本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，如无特殊说明，均可以通过商业渠道购买获得。在一些实施例中，本发明使用通用反转录引物和qPCR通用反向引物，为全式金公司市售。
具体地说，本发明解决技术方案包括：
1. 候选标志物筛选方案：通过对NCBI-GEO数据库和TCGA数据库的大数据分析，建立乳腺癌血清miRNA候选标志物。其中的NCBI-GEO数据库选取的均为血清样本来源的数据，数据含量为5234例乳腺癌患者及健康志愿者的血清样本分析结果；TCGA数据库为组织样本来源的数据，数据含量为1096例乳腺癌组织及104例癌旁组织的miRNA差异表达分析。找到乳腺癌人群血清中及乳腺癌组织中同步上调的miRNA表达谱，然后从中选取预后不良的miRNA，得到123种miRNA候选标志物。再采用共线性分析，剔除掉共线的miRNA，保留非共线的30种miRNA候选标志物。采用加尾法反转录，再qPCR的方法，检测血清样本中这30个miRNA的表达情况。
2. 以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，收集完整的人口学资料和临床数据，建立标准化样本库和数据库。
3. 对收集的样本进行检测，通过反转录-qPCR的方法验证乳腺癌血清miRNA候选标志物。检测指标为∆Ct值=CtmiRNA- CtU6。
4. 利用ROC曲线判定这些miRNA对乳腺癌的诊断效能，最终建立miRNA联合诊断标志物组合，并建立发病风险判定公式。
5. 统计学分析所使用的统计方法包括但不限于χ2检验、t检验、共线性分析、logistics回归及Fisher判定。
本发明的有益效果：
1. 血清miRNA肿瘤标志物检测属于液体活检范畴，与临床上常规的血液肿瘤标志物相比，具有特异性高、更早期发现、灵敏性度高和微创的特点，是包括肿瘤在内的多种疾病诊断的新型标志物。
2. 本发明使用自主设计的qPCR正向引物对上述6种miRNA进行半定量分析，其有益之处在于：与茎环法相比，加尾法反转录的优势是仅需通过一个反转录体系可以完成多种miRNA的反转录，具有通量高、所需血液样本量少，成本低等多种优势，不足之处在于，引物特异性通常较差。本发明自主设计的qPCR正向引物，在实际应用中已经证实，具有较高特异性、灵敏度及重现性，充分弥补了加尾法反转录的缺点，在实际应用中具有很大优势。
3. 本发明使用自主设计的qPCR正向引物，其有益之处还在于：已知U6作为组织细胞中miRNA的内参已得到公认，但是U6在血清通常稳定性差，易碎片化，引物扩增产物不稳定，是造成血清U6不能稳定检出的重要原因之一。本发明自主设计的U6正向引物,在可以与市售反转录试剂盒中的通用反向引物完成U6的qPCR反应。并在实际应用中已经证实，具有特异性高、标准差小、重现性好的特点，可以作为乳腺癌患者与健康人群血清的miRNA的内参，在实际应用中具有很大优势。
4. 本发明应用反转录-qPCR法，在大量乳腺癌和健康人群的血清中验证和评价了多个miRNA，上述miRNA组合在乳腺癌和健康人群的血清中均具有显著差异，一种理想可靠性的乳腺癌标志物。
5. 本发明建立的训练集对测试集的检测结果显示，其诊断效能高达92%。对未来临床对的乳腺癌诊断具有重要意义。
附图说明
图1实施方案流程图。
图2上述6种miRNA的联合诊断ROC曲线。
图3上述6种miRNA在全部326例样本中的表达情况。
具体实施方式
1. 样本收集标准：发明人于2018年至2019年从中国医科大学附属盛京医院收集了大量的乳腺癌患者和正常体检人群的血清样本，通过对资料的整理，从中选择了326例样本，其中乳腺癌160例，健康人群156例，进行检测。所选择的乳腺癌患者外周样本均为首诊，无手术以及用药史，且住院后经病理确认为乳腺癌的病人。健康人群为体检中心体检合格的健康人群。系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料。
2. 血清样本制备：使用5 ml带惰性分离胶的采血管采集静脉全血，完成后迅速转移至离心机，离心条件为3000g—4 ℃—10分钟，吸取上清1 ml，转移至无RNA酶EP管，放入-80℃冰箱保存至使用前。
3. RNA提取前样本预处理：从-80℃冰箱取出血清，室温静置至全部融化，至离心机中，离心条件为10000g—6 ℃—15分钟，取上清200 ul，置于新EP管中。
4. 全自动无细胞血清miRNA提取：将样本置于全自动核酸提取仪中，仪器为凯杰（QIAGEN）公司市售，型号QIAcube。该仪器使用QIAGEN离心柱试剂盒（miRNeasy Serum/Plasma Kit），实现对无细胞血清miRNA的全自动提取。所得RNA体积为15 ul，浓度大于100ng/ul。
5. 使用加尾法反转录试剂盒，对miRNA进行反转录。反转录总体系为20 ul，加入的RNA量为200 ng/20 ul。反转录体系如下：
反转录的反应条件为37℃下60分钟，然后85℃下5秒酶灭活。具体操作参照TransScript® miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书。
6. 实时荧光定量PCR（qPCR）：扩增反应使用的试剂盒是全式金公司市售TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒，反应体系构成见下表：
扩增反应使用的仪器是赛默飞公司QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪上进行，反应程序设置见下表，其它设置均为系统默认值：
使用仪器自带软件QuantStudioTM Design & Analysis Software进行结果采集，内参为U6，检测指标为Ct值。
7. 训练集的建立，将全部样本随机分为数量相等的2组，训练集和测试集的人数各158例，各含乳腺癌80例和健康人群78例。
a. 总体上采用∆∆Ct法来比较各个miRNA在乳腺癌人群和健康人群的表达差异，即∆∆Ct = ∆Ct乳腺癌-∆Ct健康。
b. 具体的∆Ct健康= 
；∆Ct乳腺癌= 
。
c. 每种miRNA在乳腺癌人群与健康人群的表达差异= 2 -∆∆Ct。
上述的6种miRNA标志物在训练集158例样本的表达差异见下表：
利用SPSS 22 .0软件进行统计分析，采用Fisher判别法对训练集数据进行分析，得到Fisher线性判别公式: Y= -1.533+ 0.491*∆Ct miR1292 +0.015*∆Ct miR887 + 0.331*∆Ct miR4658+ 0.322*∆Ct miR6783+ 0.271*∆Ct miR3156+ 0.123*∆Ct miR5581 。
8. 测试集的检测，测试集数量为158例，其中乳腺癌80例，健康人群78例。采用与训练集相同的检测操作得到测试集每个样本中上述6种miRNA的∆Ct值。利用上述Fisher线性判别公式对测试集每个数据进行判定，所得检测结果数据如下表：
根据测试集的检测结果可知，使用本发明所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒，对乳腺癌的真阳性率（敏感性）为92.5 %，即漏诊率为7.5 %；真阴性率（特异性）为91.0 %，即误诊率为9.0 %；测试集全部158例样本总正确率为91.8 %。
绘制ROC曲线，利用曲线下面积AUC评价上述6种miRNA标志物对乳腺癌的诊断效能，见图2.
AUC最大值诊断效能为1.00，本专利所述6种miRNA标志物的独立诊断效能在0.69-0.84之间，联合诊断效能高达0.94，见下表。
将训练集和测试集全部326例样本的检测结果汇总，可以看出，本专利所述6种miRNA在乳腺癌人群和健康人群均具有显著表达差异，每种miRNA在两个人群中血清中的表达量见图3，具体数据见下表。
本发明建立了一套完整的操作流程，从收到血清样本开始，通过所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒，可以较好的区分乳腺癌病人与健康人。
序列表
<110> 沈阳康为医学检验实验室有限公司
<120> 一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cgggttccgg caga 14
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ccttgggagc cctgttag 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tgagtgggat cctggag 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
tcctgggctt ctcctct 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
cgcagaaaga tctggaagtg 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gcagttccat gcctcct 17
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
gcaaggatga cacgcaaa 18
Claims (8)
1.一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合，其特征在于:由人血清中的hsa-miR-1292-5p ,hsa-miR-887-5p ,hsa-miR-4658，hsa-miR-6783-3p，hsa-miR-3156-5p和hsa-miR-5581-3p中的1种或多种组成。
2.根据权利要求1所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合，其特征在于该血清miRNA标志物为hsa-miR-1292-5p, hsa-miR-887-5p, hsa-miR-4658和hsa-miR-6783-3p中两种或两以上的组合，优选为hsa-miR-1292-5p, hsa-miR-887-5p, hsa-miR-4658和hsa-miR-6783-3p四种miRNA所组成的组合。
3.根据权利要求1所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合，其特征在于：所述的miRNA标志物组合乳腺癌诊断中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合的检测试剂盒，其特征在于：权利要求1所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合在制备检测试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合的检测试剂盒，其特征在于：权利要求1所述的乳腺癌诊断标志物组合的qPCR扩增引物序列。
6.根据权利要求4所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合的检测试剂盒，其特征在于：作为内参的U6的qPCR扩增引物序列。
7.根据权利要求4所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合的检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂为poly-A加尾法反转录试剂及qPCR法检测试剂。
8.根据权利要求4所述的一种血清miRNA乳腺癌诊断标志物组合的检测试剂盒，其特征在于：阳性质控品、阴性质控品、poly-A加尾酶、逆转录酶、dNTPs、逆转录缓冲液、无RNA酶水、qPCR缓冲液、氯化镁、DNA聚合酶、SYBR Green荧光染料中至少一种。
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