CN115948546A - 乳腺癌的外泌体miRNA生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乳腺癌的miRNA生物标志物，所述生物标志物为miRNA组合，所述组合包括miR‑223‑3p和miR‑1246。所述miRNA为外泌体miRNA；本发明证明了联合使用多个不同的外泌体miRNA能够增加检测乳腺癌敏感性，排除肿瘤异质性对检测的干扰。本发明还提供用于检测该miRNA生物标志物的试剂以及包含该实际的试剂盒，以及相应的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体而言，本发明涉及一种可用于诊断乳腺癌的外泌体microRNA生物标志物以及相应地它们在乳腺癌诊断中的应用。
背景技术
全球范围内，乳腺癌已成为女性癌症相关死亡的主要原因，在女性中乳腺癌的发病率和死亡率远远超过其他癌症，被认为是女性的主要公共健康问题之一，遗传和环境因素等多种因素均可能会影响其发生和发展。
早期检测以及监测患者对各种治疗的响应是乳腺癌治疗的重要方面。各种成像技术，如乳房X线摄影术、磁共振成像(MRI)、正电子发射计算机断层显像(PET)、计算机断层扫描(CT)和单光子发射计算机断层成像术 (SPECT)，是用作评估乳腺癌的有效工具。但是，越来越多的证据表明影像技术的局限性，例如引起疼痛和焦虑、假阳性结果和辐射暴露风险，或者价格昂贵、成像复杂和周期长，或者依赖于医师的经验与技术，且存在分辨率低、特异性和敏感性无法保证等缺陷，因此需要开发更准确、操作简单、风险低且非侵入性的技术手段来补充或替代。
此外，已经提出了检测肿瘤抗原标志物来进行乳腺癌的筛查，如人表皮生长因子受体2(HER2)抗原和糖类抗原15-3(CA15-3)。但是，难以证明这些标志物具有乳腺癌特异性，且易受肿瘤负荷影响，在早期筛查中价值有限。还提出了可检测基因标志物例如BRCA1和BRCA2或者检测细胞外的循环DNA(cell-free DNA，cfDNA)，但是同样存在对降低乳腺癌死亡率并无帮助或方法不成熟等缺陷。
已有越来越多的文献报道了微小RNA(microRNA，miRNA)作为癌症分子标志物。miRNA是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的短链RNA，其为非编码RNA，在转录后阶段参与各种靶基因的表达调节。几乎所有类型的细胞都被动(例如通过凋亡小体)或主动(例如存在于微泡中)地向循环系统释放miRNA，这些分子可以通过类似于旁分泌信号的机制影响其他组织的稳态平衡，或触发一些致病机制，包括正常细胞向肿瘤细胞转化和促进肿瘤细胞增殖等。事实上，肿瘤细胞以及癌症相关成纤维细胞都已被发现向微环境中释放miRNA，然后进入血流。研究表明，miRNA通过表达水平的变化靶向地参与乳腺癌的多种细胞和分子水平的发病机制，在乳腺癌发生发展中发挥关键作用；最近报道显示，miRNA的表达谱可能与乳腺癌的肿瘤侵袭性、亚型、治疗响应和患者预后有关。此外，miRNA在各种条件下的稳定性很强，并且对RNA酶具备良好抗性，这些特点使其成为乳腺癌生物标志物的理想候选者。
大量的miRNA是被包装在外泌体中进行转运之后才发挥作用的。外泌体是一种球状纳米级胞外囊泡，直径通常为30-100nm，密度为1.13-1.19g/ml。统计数据显示，外泌体含有大量不同种类的蛋白质、mRNA、miRNA和脂质，这些分子广泛参与细胞结构组成、生物合成、细胞间通信和囊泡融合等生物过程。在生理和病理条件下，外泌体可以由包括肿瘤细胞在内的多种细胞释放，而肿瘤细胞来源的外泌体则与肿瘤发展相关。并且，外泌体的富集可以从血液中比较容易地实现。由此可知，源于肿瘤细胞的外泌体携带并稳定储存了肿瘤细胞的成分，并可以实现无创的体外富集，因此外泌体及其包含的分子可以成为“体液活检”中的一种理想的候选分子标志物，被期待应用于乳腺癌检测之中。
发明内容
本领域已知，miRNA的异常与乳腺癌的发生、发展密切相关，但是将 miRNA异常用于乳腺癌诊断的研究或应用尚十分缺乏。
为了解决上述技术问题，本发明通过检测外泌体miRNA对不同类型的乳腺癌的检测敏感性和特异性，最终鉴定了一组可用于筛查乳腺癌、尤其是早期筛查的外泌体miRNA组合。该组合作为生物标志物，在不同分型方式得到的不同类型的乳腺癌中、在不同年龄患者中均具有足够高的检测能力。
因此，本发明的一个目的是提供一种乳腺癌的miRNA生物标志物，其为miRNA组合。本发明的另一个目的是提供用于检测该miRNA生物标志物的试剂，例如与所述miRNA特异性互补的核苷酸序列；以及提供该miRNA 生物标志物或试剂在制备用于乳腺癌的患病风险预测、诊断、预后评估、治疗效果监测或复发监测等产品中的用途。本发明的再一个目的是提供试剂盒以及相应地用于检测所述miRNA生物标志物的方法。
在本发明的上下文中，术语“微小RNA”、“microRNA”和“miRNA”可互换使用。
本发明的技术方案如下。
一方面，本发明提供一种乳腺癌的miRNA生物标志物，所述生物标志物为miRNA组合，所述组合包括miR-223-3p和miR-1246。
优选地，所述组合还包括以下miRNA中的一种或多种：miR-451a、 miR-375-3p、miR-361-5p、miR-497-5p、miR-146a-5p、RNU6和miR-195；优选地，所述组合还包括以下miRNA中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种：miR-451a、miR-375-3p、miR-361-5p、miR-497-5p、miR-146a-5p、 RNU6和miR-195。
上述miRNA的序列及其数据库登记号如下：
miR-223-3p：
UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA(MIMAT0000280；SEQ ID NO.1)；
miR-1246：
AAUGGAUUUUUGGAGCAGG(MIMAT0005898；SEQ ID NO.2)；
miR-451a：
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miR-375-3p：
UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA(MIMAT0000728；SEQ ID NO.4)；
miR-361-5p：
UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC(MIMAT0000703；SEQ ID NO.5)；
miR-497-5p：
CAGCAGCACACUGUGGUUUGU(MIMAT0002820；SEQ ID NO.6)；
miR-146a-5p：
UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU(MIMAT0000449；SEQ ID NO.7)；
RNU6：
GUGCUCGCUUCGGCAGCACAUAUACUAAAAUUGGAACGAUACA GAGAAGAUUAGCAUGGCCCCUGCGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGU GAAGCGUUCCAUAUUUU(NR_004394.1；SEQ ID NO.8)；
miR-195：
UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC(MIMAT0000461；SEQ ID NO.9)
根据本发明的具体实施方式，所述组合包括：
(1)miR-223-3p和miR-1246；
(2)miR-223-3p、miR-1246、miR-195；
(3)miR-223-3p、miR-1246、miR-361-5p；
(4)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a；
(5)miR-223-3p、miR-1246、miR-497-5p、RNU6；
(6)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、RNU6；
(7)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、RNU6、miR-146a-5p；
(8)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、RNU6、miR-497-5p、 miR-195；
(9)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、miR-497-5p、miR-195、 miR-361-5p、RNU6；或
(10)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、miR-497-5p、 miR-195、miR-361-5p、RNU6、miR-146a-5p。
根据本发明，所述组合中的miRNA来源于外泌体。优选地，优选地，所述外泌体为全血、血清、血浆、唾液或尿液外泌体，优选为全血、血清或血浆外泌体。例如，所述miRNA为外泌体miRNA，所述外泌体来源于受试者的全血、血清、血浆、唾液或尿液；其中，受试者为哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。
根据本发明，所述乳腺癌按照分子亚型包括Luminal型乳腺癌、三阴性乳腺癌和her-2阳性乳腺癌；或者，按照组织学分型包括浸润性癌或非浸润性癌；或者按照TNM分期包括0期、I期、II期、III期、IV期乳腺癌，其中0期-II期为早期乳腺癌，III期-IV期为晚期乳腺癌。
根据本发明，该miRNA生物标志物即miRNA组合可以在受试者的样本(例如血浆或血清)中进行检测。在本发明中，miRNA的“存在”或“不存在”与“阳性”或“阴性”可互换使用；对此进行判断为本领域常规技术。
另一方面，本发明提供一种用于检测所述miRNA生物标志物的试剂。
根据本发明，所述试剂为与所述miRNA特异性互补的核苷酸序列。优选地，所述试剂为通过PCR(例如实时荧光定量PCR)来检测所述miRNA 的试剂，例如逆转录引物、PCR扩增引物对和/或探针。
根据本发明的具体实施方式，所述试剂包括以下特异性扩增所述miRNA的PCR扩增引物对(分别为正向和反向引物)：
(1)针对miR-223-3p：GTTCGGTGTCAGTTTGTCAAATAC(SEQ ID NO. 10)和GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGG(SEQ ID NO.11)；
(2)针对miR-375-3p：TTCGTTTGTTCGTTCGGCTC(SEQ ID NO.12) 和TCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCACG(SEQ ID NO.13)；
(3)针对miR-1246：AGTCGGAATGGATTTTTGGAG(SEQ ID NO.14) 和AGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCC(SEQ ID NO.15)；
(4)针对miR-146a-5p：GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAACCCA(SEQ ID NO.16)和CTGCTTGGGTGAGAACTGAAT(SEQ ID NO.17)；
(5)针对miR-497-5p：TACCTCGTTCAGCAGCACACT(SEQ ID NO.18) 和GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTACAA(SEQ ID NO.19)；
(6)针对miR-361-5p：ACCTCGTGTTATCAGAATCTCCAG(SEQ ID NO. 20)和GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGTA(SEQ ID NO.21)；
(7)针对miR-195：GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGCCA(SEQ ID NO. 22)和ACTCCGTAGCAGCACAGAAAT(SEQ ID NO.23)；
(8)针对miR-451a：GTCGGAAACCGTTACCATTACT(SEQ ID NO.24) 和GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAACTC(SEQ ID NO.25)；和/或
(9)针对RNU6：CGCTAAAATTGGAACGATACAGA(SEQ ID NO.26) 和TTTGCGTGTCATCCTTGCG(SEQ ID NO.27)。
再一方面，本发明提供所述miRNA生物标志物或试剂在制备用于乳腺癌的患病风险预测、诊断、预后评估、治疗效果监测或复发监测的产品中的用途。
优选地，所述乳腺癌按照分子亚型包括Luminal型乳腺癌、三阴性乳腺癌和her-2阳性乳腺癌；或者，按照组织学分型包括浸润性癌或非浸润性癌；或者按照TNM分期包括0期、I期、II期、III期、IV期乳腺癌，其中0期 -II期为早期乳腺癌，III期-IV期为晚期乳腺癌。
优选地，所述产品为试剂盒，例如PCR(例如实时荧光定量PCR)试剂盒。
又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的试剂。
优选地，所述试剂盒为PCR(例如实时荧光定量PCR)试剂盒。相应地，所述试剂盒还可包括用于对miRNA生物标志物进行PCR(例如实时荧光定量PCR)检测的所需其他组分，这些均是本领域公知的。例如，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTPs、MgCl2、逆转录酶、逆转录缓冲液中的一种或多种。
优选地，本发明提供的试剂盒还包括内参分子，所述内参分子为选自 let-7a、let-7d、let-7g和let-7i的一种或多种，优选为let-7a。
let-7a的序列及其数据库登记号如下：
let-7a：UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(MIMAT0000062；SEQ ID NO.28)
就内参分子，所述试剂盒优选还包括通过PCR(例如实时荧光定量PCR) 来检测所述内参分子的试剂，例如逆转录引物、PCR扩增引物对和/或探针；优选地，所述试剂包括以下特异性扩增所述let-7a的PCR扩增引物对(分别为正向和反向引物)：AGTCTCGGTGAGGTAGTAGGTTGT(SEQ ID NO.29) 和GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAACTAT(SEQ IDNO.30)。
还一方面，本发明提供一种检测所述miRNA生物标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)收集受试者的样本，并从中分离外泌体；
(2)从所述外泌体中提取RNA，检测所述miRNA的含量。
优选地，步骤(1)中，所述受试者为哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。优选地，所述样本为全血、血清、血浆、唾液或尿液，优选为全血、血清或血浆。优选地，采用梯度离心法或差速离心法分离外泌体。
优选地，步骤(2)中，通过PCR(例如实时荧光定量PCR)来检测所述 miRNA的含量。例如，采用本发明提供的试剂或包含该试剂的试剂盒对所述miRNA组合中的每个miRNA进行检测和/或定量。
在获得受试者的miRNA生物标志物的含量后，通过将其含量与参考阈值进行比较，在高于参考阈值时，确定所述受试者具有乳腺癌患病风险、患有乳腺癌、预后不良、乳腺癌治疗效果差或具有复发风险。
相应地，在另一方面，本发明还提供一种乳腺癌的患病风险预测、筛查、预后评估、治疗效果监测或复发监测的方法，其包括以下步骤：
(1)收集受试者的样本，并从中分离外泌体；
(2)从所述外泌体中提取RNA，检测所述miRNA的含量；
(3)将所述含量与参考阈值进行比较，在其高于参考阈值时，确定所述受试者具有乳腺癌患病风险、患有乳腺癌、预后不良、乳腺癌治疗效果差或具有复发风险。
根据本发明，所述乳腺癌按照分子亚型包括Luminal型乳腺癌、三阴性乳腺癌和her-2阳性乳腺癌；或者，按照组织学分型包括浸润性癌或非浸润性癌；或者按照TNM分期包括0期、I期、II期、III期、IV期乳腺癌，其中0期-II期为早期乳腺癌，III期-IV期为晚期乳腺癌。
优选地，步骤(1)中，所述受试者为哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。优选地，所述样本为全血、血清、血浆、唾液或尿液，优选为全血、血清或血浆。优选地，采用梯度离心法或差速离心法分离外泌体。
优选地，步骤(2)中，通过PCR(例如实时荧光定量PCR)来检测所述miRNA的含量。例如，采用本发明提供的试剂或包含该试剂的试剂盒对所述miRNA组合中的每个miRNA进行检测和/或定量。
优选地，步骤(3)中，所述参考阈值可以是来自健康人或健康人群的参照水平；例如，可以被定义为经身体检查确认未患有癌症的人群的平均值加2 个标准偏差。
与现有技术相比，本发明提供了一种与乳腺癌相关的新型生物标志物，其为全新的一组miRNA。实验证明，联合使用多个不同的外泌体miRNA能够增加检测乳腺癌敏感性，排除肿瘤异质性对检测的干扰。本发明所述的miRNA生物标志物在早期乳腺癌的诊断中敏感性能达到80％以上，并且对不同年龄段的乳腺癌患者、不同类型的乳腺癌(Luminal型乳腺癌、三阴性乳腺癌、her-2阳性乳腺癌、浸润性乳腺癌等)没有偏好，极大地扩大了所述miRNA标志物在乳腺癌诊断中的应用范围，为临床辅助诊断乳腺癌提供了更好的参考价值。并且，本发明提供的miRNA生物标志物为外泌体 miRNA，可以在受试者血液例如血清样本中进行检测，辅助乳腺癌的临床诊断，具有广阔的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为候选单一外泌体miRNA在乳腺癌患者与对照人群中表达水平的散点图。
图2为候选单一外泌体miRNA区分乳腺癌患者与对照人群的受试者工作特征(ROC)曲线。
图3为3-miRNA组合在训练队列和验证队列的ROC曲线。
图4为3-miRNA组合在不同分子亚型的乳腺癌患者中的ROC曲线。
图5为3-miRNA组合在不同分期的乳腺癌患者中的ROC曲线。
图6为3-miRNA组合在不同组织学分型的乳腺癌患者中的ROC曲线。
图7为3-miRNA组合在不同年龄段的乳腺癌患者中的ROC曲线。
具体实施方式
本发明中涉及以下实验操作或定义。应注意，本发明还可采用本领域其他常规技术进行实施，并不仅限于以下实验操作。
(一)血清或血浆的制备和保存
乳腺癌患者血清或血浆在患者最初诊断为乳腺癌，尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集。血浆或血清按标准临床程序制备，置于-80℃冰箱中长期保存。
(二)差速离心法分离血清外泌体
将血清从冰箱中拿出，置于冰上解冻(使用新鲜血清则跳过此步骤)；4℃ 12,000xg离心15分钟，小心吸取上清，转移上清至新的1.5ml离心管中；添加等体积PBS溶液于上清中，混匀；按上清混合液:沉淀剂＝4:1体积比加入沉淀剂；涡旋震荡15秒，4℃静置过夜；4℃3,000xg离心30分钟，管底应有肉眼可见的黄白色沉淀，小心吸除全部上清液；向离心管中加入适量 PBS溶液，置于混匀仪上1,500rpm混匀10分钟，所得即为富含胞外囊泡的溶液；向离心管中加入适量QIAzol裂解剂，震荡混匀后进入RNA抽提步骤。
(三)RNA的分离提取
已添加QIAzol的裂解溶液，室温孵育5分钟；向每管添加200μl氯仿溶液，剧烈震荡15秒，室温放置3分钟；在4℃、12,000xg条件下离心15 分钟，可见分层；将上清转移至新的2mL离心管，按上清:无水乙醇＝1:1.5 的体积比添加无水乙醇，来回颠倒混匀；将溶液分批次转移至RNeasy MinElute离心柱进行12,000xg离心30秒，弃废液；向离心柱中添加BufferRWT溶液700μl，12,000xg离心30秒，弃废液；向离心柱中添加Buffer RPE 溶液500μl，在12,000xg离心30秒，弃废液；向离心柱中添加新鲜配制的 80％乙醇溶液500μl，在12,000xg离心2分钟，弃废液并更换收集管；开盖离心，12,000xg离心5分钟，弃收集管；将离心柱放入试剂盒提供的1.5mL Rnase-free离心管中，向柱中心添加Rnase-free dH2O 14μl，12000xg离心2 分钟；弃离心柱，洗脱的RNA置于冰上待用或迅速转入-80℃冰箱中储存。
(四)实时定量PCR
通过M-MLV Reverse-Transcriptase将从血清中提取的外泌体RNA逆转录为cDNA，反应条件为1)37℃1小时，2)75℃15分钟。然后，使用 TOYOBO SYBR进行qRT-PCR，每个反应的总体积为20μL，包含1μL cDNA (10ng/μL)，并根据制造商的使用说明在ABI 7500(ThermoFisher)实时定量 PCR平台中进行。PCR的循环条件为1)95℃15秒，2)60℃30秒，3)95℃ 15秒，进行40个循环，然后进行熔解曲线分析以评估PCR特异性。Let-7a miRNA作为内源性对照。设置三复孔测量反应。候选miRNA的表达水平使用2-ΔΔCt方法计算。引物序列见表1。
表1.针对靶标miRNA的引物对
(五)外泌体miRNA的临界值(cutoff值)
外泌体miRNA水平的cutoff值被定义为等于对照组(经身体检查确认未患有癌症的人群)中健康对照队列的平均值加2个标准偏差(SD)。
(六)单个外泌体miRNA的阳性判断
对样本中外泌体miRNA的水平进行定量后，将其与cutoff值进行比较，≥cutoff值为阳性，＜cutoff值为阴性。
(七)外泌体miRNA组合的阳性判断
为了增加外泌体miRNA检出的阳性率，分析结果时联合多个外泌体 miRNA的结果来判断预测效果。规则是：在患者样本中检测多个外泌体 miRNA，只要有其中一个或者多个外泌体miRNA显示阳性，则判断组合结果为阳性；而如果所有的外泌体miRNA均为阴性，则判断组合结果为阴性。
(八)统计分析
使用非参数Mann-Whitney检验分析患者和对照受试者中候选外泌体 miRNA的血清表达水平。P<0.05被认为差异有统计学意义。受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)用于评估miRNA的诊断性能。所有统计分析均使用SPSS 25.0软件和GraphPad Prism进行6.0软件。
(九)敏感性和特异性判断
敏感性：金标准诊断全部乳腺癌病例中，外泌体微小RNA组合检测结果为阳性的病例占全部有病病例的比例。
特异性：金标准诊断全部无病的受试者中，外泌体微小RNA组合检测结果为阴性的受试者占全部无病受试者的比例。
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。样本采集已经受试者或患者知情同意，且获得监管部门的批准。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1单一候选外泌体微小RNA检测乳腺癌的能力评估
本实施例包括健康体检人群267例和乳腺癌患者267例，进行乳腺癌外泌体微小RNA标志物的筛选。受试者人群来自不少于3个独立的医学中心。所有的乳腺癌患者血清都是在患者诊断为乳腺癌，但尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的，并在-80度冰箱保存。患者信息如表2所示。
表2.患者特征表
| 年龄(周岁) | 乳腺癌患者 |
| ≥50 | 112(41.95％) |
| ＜50 | 86(32.21％) |
| 其他或未知 | 69(25.84％) |
| TNM分期 | |
| 早期(0-II期) | 191(71.54％) |
| 晚期(III-IV期) | 24(9.00％) |
| 其他或未知 | 52(19.48％) |
| UICC分期 | |
| 0 | 6(2.25％) |
| I | 47(17.60％) |
| II | 101(37.83) |
| III | 24(9.00％) |
| IV | 1(0.37％) |
| 其他或未知 | 88(32.96％) |
| 组织学分型 | |
| 浸润性癌 | 216(80.90％) |
| 非浸润性癌 | 25(9.36％) |
| 其他或未知 | 26(9.74％) |
| 分子亚型 | |
| Luminal | 166(62.17％) |
| HER2+ | 47(17.60％) |
| 三阴性(Triple negative) | 19(7.12％) |
| 其他或未知 | 35(13.11％) |
从血清中提取的外泌体RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，采用特异性引物将候选miRNA扩增，其在血清外泌体中的表达水平使用2-ΔΔCt方法计算。通过健康对照人群的表达水平，加上2倍的标准差设置为阈值 (cutoff值)。候选单一外泌体微小RNA表达水平的散点图如图1所示。
由于肿瘤产生机理多样性，单一外泌体微小RNA在肿瘤患者的分布敏感性较低(表3)，通常只有40％-70％之间，因此，肿瘤组和对照组的单一微小RNA水平分布使用MannWhitney test进行统计分析，发现miR-223-3p、 miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、miR-361-5p、miR-497-5p、miR-146a-5p、 miR-195在肿瘤组和对照组中的水平分布有显著不同(p<0.05)。对每一种微小RNA进行ROC曲线绘制评估它们单独的检测能力，如图2所示，发现AUC处于0.6205-0.7449之间。
对样本中外泌体miRNA的水平进行定量后，将其与cutoff值进行比较，大于或者等于cutoff值为阳性，小于cutoff值为阴性。根据单一微小RNA 检测结果，计算每一种候选微小RNA的敏感性、特异性、曲线下面积，见表3。
表3.单一外泌体微小RNA检测乳腺癌的性能参数
| 敏感性(％) | 特异性(％) | AUC(95％CI，范围值) | |
| miR-223-3p | 65.66 | 65.88 | 0.6895(0.6445-0.7345) |
| miR-1246 | 93.98 | 58.87 | 0.7304(0.6833-0.7776) |
| miR-451a | 38.26 | 94.32 | 0.6316(0.5796-0.6835) |
| miR-375-3p | 28.48 | 93.29 | 0.6205(0.5604-0.6807) |
| miR-361-5p | 52.00 | 87.10 | 0.7104(0.6464-0.7743) |
| miR-497-5p | 41.60 | 84.80 | 0.6334(0.5645-0.7023) |
| miR-146a-5p | 73.33 | 77.23 | 0.7449(0.6969-0.7929) |
| miR-195 | 65.18 | 73.21 | 0.7249(0.6775-0.7723) |
实施例2针对乳腺癌的血清外泌体微小RNA检测组合建立
本实施例中对参与实验的所有受试者进行了随机分组，按8:2的比例将所有受试者分为训练队列和验证队列。在训练队列中，采用机器学习的策略，并参考早期乳腺癌阳患者中检出率、特异性，和其他分子有重叠的阳性检出、单独阳性贡献率等因素，建立了三组针对乳腺癌患者血清的外泌体微小RNA 检测组合，包括：第一组miR-223-3p、-1246、-195/let-7a分子；第二组 miR-223-3p、-1246、-361-5p/let-7a；第三组miR-223-3p、-1246、-451a/let-7a，其中let-7a为内参分子。
以这些组合对训练队列的人群进行检测分析，得到它们的敏感性/特异性分别为82.10％/87.22％、85.11％/82.26％、76.88％/93.01％，曲线下面积(AUC) 分别为0.8957、0.8791、0.9188(见图3中的3-1)。采用这些组合对验证队列进行进一步的分析，类似地得到敏感性/特异性分别为76.92％/95.45％、 100％/82.26％、70.21％/92.58％，曲线下面积(AUC)为0.9441、0.9446、0.9055 (见图3中的3-2)。可见分子组合的检测能力与单分子相比，在两个人群中均有显著地提升。
实施例3利用本发明检测组合针对不同分子亚型的乳腺癌检测能力评估
本实施例对检测组合的适用性进一步作了拓展。根据乳腺癌分子表达特征，依据雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2 (Her2)、Ki67蛋白的表达情况，按国际惯例将患者分为不同的分子亚型，包括luminal型、HER2+型和三阴性(triplenegative)乳腺癌患者。
采用本发明的外泌体微小RNA乳腺癌检测组合对不同分子亚型的患者进行了独立的统计分析，发现这些组合在luminal型患者中的阳性率分别为 83.82％/87.01％/79.58％，曲线下面积(AUC)分别为0.9128/0.8933/0.9264(见图4中的4-1)；在HER2+型患者中的阳性率为71.43％/89.66％/69.05％，曲线下面积(AUC)为0.8738/0.8831/0.8694(见图4中的4-2)；在三阴性乳腺癌患者中的阳性率为88.24％/100％/52.94％，曲线下面积(AUC)为 0.9322/0.9283/0.9273。(见图4中的4-3)。由此可见，本发明组合对乳腺癌的不同分子亚型，在检测鉴别方面没有偏好，均可适用。
实施例4利用本发明检测组合针对不同TNM分期乳腺癌患者的检测能力评估
本实施例对检测组合的适用性进一步作了拓展。根据乳腺癌TNM分期标准，将本发明中的受试人群分为早期患者(0-II期)和晚期患者(III-IV 期)。
采用本发明的外泌体微小RNA乳腺癌检测组合对不同分期的患者进行了独立的统计分析，发现这些组合在早期患者中的阳性率分别为 83.11％/88.24％/82.24％，曲线下面积(AUC)为0.9077/0.8888/0.9310(见图 5中的5-1)；在晚期患者中的阳性率为66.67％/62.5％/54.17％，曲线下面积 (AUC)为0.8540/0.7853/0.8685。(见图5中的5-2)。由此可见，本发明组合对早期患者有着良好的检测能力。
实施例5利用本发明检测组合针对不同组织学分型乳腺癌患者的检测能力评估
本实施例对检测组合的适用性进一步作了拓展。根据患者免疫组织化学染色结果，将本发明中的受试患者分为浸润性乳腺癌和非浸润性乳腺癌患者。
采用本发明的外泌体微小RNA乳腺癌检测组合对不同组织学分型的患者进行了独立的统计分析，发现这些组合在浸润性患者中阳性率为 81.14％/87.76％/74.30％，曲线下面积(AUC)为0.9084/0.8917/0.9181(见图 6中的6-1)；在非浸润性患者中的阳性率为80.95％/94.12％/81.82％，曲线下面积(AUC)为0.9054/0.9260/0.9058(见图6中的6-2)。由此可见，这些发明组合对恶性程度高的浸润性乳腺癌有着良好的检测能力。
实施例6利用本发明检测组合针对不同年龄乳腺癌患者的检测能力评估
本实施例对检测组合的适用性进一步作了拓展。乳腺癌的发生与年龄有着相关性；根据患者的年龄，将本发明中的受试患者分为大于或等于50岁组和小于50岁组。
采用本发明的外泌体微小RNA乳腺癌检测组合对不同年龄组的患者进行了独立的统计分析，发现这些组合在大于或等于50岁的患者中的阳性率为85.39％/87.69％/83.33％，曲线下面积(AUC)为0.9271/0.8932/0.9416(见图7中的7-1)；在小于50岁患者中的阳性率为88.71％/88.46％/85.07％，曲线下面积(AUC)为0.9201/0.8910/0.9370(见图7中的7-2)。由此可见，本发明组合对患者年龄没有偏好，任何年龄段均可适用。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (13)
1.一种乳腺癌的miRNA生物标志物，所述生物标志物为miRNA组合，所述组合包括miR-223-3p和miR-1246。
2.根据权利要求1所述的miRNA生物标志物，其特征在于，所述组合还包括以下miRNA中的一种或多种：miR-451a、miR-375-3p、miR-361-5p、miR-497-5p、miR-146a-5p、RNU6和miR-195；
优选地，所述组合还包括以下miRNA中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种：miR-451a、miR-375-3p、miR-361-5p、miR-497-5p、miR-146a-5p、RNU6和miR-195。
3.根据权利要求1或2所述的miRNA生物标志物，其特征在于，所述组合包括：
(1)miR-223-3p和miR-1246；
(2)miR-223-3p、miR-1246、miR-195；
(3)miR-223-3p、miR-1246、miR-361-5p；
(4)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a；
(5)miR-223-3p、miR-1246、miR-497-5p、RNU6；
(6)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、RNU6；
(7)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、RNU6、miR-146a-5p；
(8)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、RNU6、miR-497-5p、miR-195；
(9)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、miR-497-5p、miR-195、miR-361-5p、RNU6；或
(10)miR-223-3p、miR-1246、miR-451a、miR-375-3p、miR-497-5p、miR-195、miR-361-5p、RNU6、miR-146a-5p。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的外泌体miRNA生物标志物，其特征在于，所述miRNA来源于外泌体；
优选地，所述外泌体为全血、血清、血浆、唾液或尿液外泌体，优选为全血、血清或血浆外泌体；
优选地，所述乳腺癌按照分子亚型包括Luminal型乳腺癌、三阴性乳腺癌和her-2阳性乳腺癌；或者，按照组织学分型包括浸润性癌或非浸润性癌；或者按照TNM分期包括0期、I期、II期、III期、IV期乳腺癌，其中0期-II期为早期乳腺癌，III期-IV期为晚期乳腺癌。
5.一种用于检测如权利要求1至4中任一项所述的miRNA生物标志物的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述试剂为与所述miRNA特异性互补的核苷酸序列；
优选地，所述试剂为通过PCR(例如实时荧光定量PCR)来检测所述miRNA的试剂，例如逆转录引物、PCR扩增引物对和/或探针；
更优选地，所述试剂包括以下特异性扩增所述miRNA的PCR扩增引物对：
(1)针对miR-223-3p：GTTCGGTGTCAGTTTGTCAAATAC(SEQ ID NO.10)和GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGG(SEQ ID NO.11)；
(2)针对miR-375-3p：TTCGTTTGTTCGTTCGGCTC(SEQ ID NO.12)和TCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCACG(SEQ ID NO.13)；
(3)针对miR-1246：AGTCGGAATGGATTTTTGGAG(SEQ ID NO.14)和AGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCC(SEQ ID NO.15)；
(4)针对miR-146a-5p：GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAACCCA(SEQ ID NO.16)和CTGCTTGGGTGAGAACTGAAT(SEQ ID NO.17)；
(5)针对miR-497-5p：TACCTCGTTCAGCAGCACACT(SEQ ID NO.18)和GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTACAA(SEQ ID NO.19)；
(6)针对miR-361-5p：ACCTCGTGTTATCAGAATCTCCAG(SEQ ID NO.20)和GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGTA(SEQ ID NO.21)；
(7)针对miR-195：GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGCCA(SEQ ID NO.22)和ACTCCGTAGCAGCACAGAAAT(SEQ ID NO.23)；
(8)针对miR-451a：GTCGGAAACCGTTACCATTACT(SEQ ID NO.24)和GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAACTC(SEQ ID NO.25)；和/或
(9)针对RNU6：CGCTAAAATTGGAACGATACAGA(SEQ ID NO.26)和TTTGCGTGTCATCCTTGCG(SEQ ID NO.27)。
7.如权利要求1至4中任一项所述的生物标志物或如权利要求5或6所述的试剂在制备用于乳腺癌的患病风险预测、诊断、预后评估、治疗效果监测或复发检测的产品中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述乳腺癌按照分子亚型包括Luminal型乳腺癌、三阴性乳腺癌和her-2阳性乳腺癌；或者，按照组织学分型包括浸润性癌或非浸润性癌；或者按照TNM分期包括0期、I期、II期、III期、IV期乳腺癌，其中0期-II期为早期乳腺癌，III期-IV期为晚期乳腺癌；
优选地，所述产品为试剂盒，例如PCR(例如实时荧光定量PCR)试剂盒。
9.一种试剂盒，其包括权利要求5或6所述的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为PCR(例如实时荧光定量PCR)试剂盒；
优选地，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTPs、MgCl2、逆转录酶、逆转录缓冲液中的一种或多种；
优选地，所述试剂盒还包括内参分子，所述内参分子为选自let-7a、let-7d、let-7g和let-7i的一种或多种，优选为let-7a。
11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括通过PCR(例如实时荧光定量PCR)来检测所述内参分子的试剂，例如逆转录引物、PCR扩增引物对和/或探针；
优选地，所述试剂包括以下特异性扩增所述let-7a的PCR扩增引物对：AGTCTCGGTGAGGTAGTAGGTTGT(SEQ ID NO.29)和GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAACTAT(SEQ IDNO.30)。
12.一种检测如权利要求1至4中任一项所述miRNA生物标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)收集受试者的样本，并从中分离外泌体；
(2)从所述外泌体中提取RNA，检测所述miRNA的含量。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述受试者为哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人；
所述样本为全血、血清、血浆、唾液或尿液，优选为全血、血清或血浆；
优选地，采用梯度离心法或差速离心法分离外泌体；
优选地，步骤(2)中，通过PCR(例如实时荧光定量PCR)来检测所述miRNA的含量；
优选地，采用权利要求5或6所述的试剂或权利要求9至11中任一项所述的试剂盒对所述miRNA组合中的每个miRNA进行检测和/或定量。
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| Title |
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| 李小燕;贺靖;邹强;: "乳腺癌外泌体及相关miRNA的研究进展", 外科理论与实践, no. 06, pages 564 - 568 * |
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