CN111705133B - LncRNAs用于制备原发性肝癌早期诊断试剂盒的用途 - Google Patents

LncRNAs用于制备原发性肝癌早期诊断试剂盒的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了LncRNAs用于制备原发性肝癌早期诊断试剂盒的用途。原发性肝癌被共认为是恶性度最强、生存期最短的顽固性恶性肿瘤之一，由于早期不易发现，导致发现时多处于晚期，治疗效果极差，因此在高危人群中早诊断、早治疗是目前挽救肝癌病人的关键。本发明发现，LINC00698、LINC01095和LOC283731联合诊断原发性肝癌的准确率在90％以上，具有开发成原发性肝癌诊断试剂盒的价值。

Description

LncRNAs用于制备原发性肝癌早期诊断试剂盒的用途
技术领域
本发明属于基因诊断领域，涉及原发性肝癌的基因诊断，具体涉及LncRNAs用于制备原发性肝癌早期诊断试剂盒的用途。
背景技术
肝癌是指起源于肝脏的恶性肿瘤，分为原发性及转移性两种。其中，由肝细胞病变所导致的癌症，称为原发性肝癌。其他来源的恶性肿瘤通过各种途径扩散至肝脏的癌症，称为转移性肝癌。肝癌被共认为是恶性度最强、生存期最短的顽固性恶性肿瘤之一。我国肝癌病人数量及死亡率均超过全世界的50％，发病率及死亡率分别位居第四及第三位。因发现时多处于晚期，治疗效果极差，因此在高危人群中早诊断、早治疗是目前挽救肝癌病人的关键。
长链非编码RNA(lncRNA)能够发挥许多重要的生物学功能，包括影响肿瘤细胞的生长、凋亡、浸润与转移等生理过程。越来越多的研究发现，多种lncRNAs成为多种肿瘤早期发现、分期和术后进展预测的标志物。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中存在的不足，提供LncRNAs用于制备原发性肝癌早期诊断试剂盒的用途。
一组lncRNAs联合用于原发性肝癌早期诊断的用途，所述lncRNAs由LINC00698、LINC01095和LOC283731组成。
一组lncRNAs联合用于制备原发性肝癌早期诊断试剂盒的用途，所述lncRNAs由LINC00698、LINC01095和LOC283731组成。
有益技术效果：
原发性肝癌被共认为是恶性度最强、生存期最短的顽固性恶性肿瘤之一，由于早期不易发现，导致发现时多处于晚期，治疗效果极差，因此在高危人群中早诊断、早治疗是目前挽救肝癌病人的关键。本发明发现，LINC00698、LINC01095和LOC283731联合诊断原发性肝癌的准确率在90％以上，具有开发成原发性肝癌诊断试剂盒的价值。
附图说明
图1为LINC00698单独诊断区分肝癌和非肝癌的ROC曲线；
图2为NONMMUT032844单独诊断区分肝癌和非肝癌的ROC曲线；
图3为LINC01095单独诊断区分肝癌和非肝癌的ROC曲线；
图4为LOC283731单独诊断区分肝癌和非肝癌的ROC曲线；
图5为LINC00698和NONMMUT032844联合诊断区分肝癌和非肝癌的ROC曲线；
图6为LINC00698、LINC01095和LOC283731联合诊断区分肝癌和非肝癌的ROC曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1：
一、试验材料
总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司。
反转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。
RT-PCR测量仪购自德国Qiagen公司。
目标基因以及内参的引物由北京博奥森公司设计合成。
二、试验方法
1、一般资料
原发性肝癌样本：选取南京医科大学第一附属医院2016～2019年确诊为原发性肝癌的患者138例；乙肝肝硬化样本：选取南京医科大学第一附属医院2016～2019年确诊为乙肝肝硬化的患者100例；乙肝肝炎样本：选取南京医科大学第一附属医院2016～2019年确诊为乙肝肝炎的患者100例；健康人群样本：选取南京医科大学第一附属医院2016～2019年体检健康人120例。四组样本的年龄分布具有高度相似性，P＞0.05，无统计学意义。
入组标准：①经计算机体层摄影(computedtomography，CT)等影像学检查或病理学检查证实；②检测前未行放疗、化疗等抗肿瘤治疗；③年龄≥18岁。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤；②妊娠期或哺乳期妇女；③合并免疫系统疾病、血液系统疾病等。
2、样本分组
训练集：分别从原发性肝癌、肝硬化、肝炎和健康人群样本中随机选取38、25、25、30例样本组成训练集，总样本数为118例；验证集：剩余的原发性肝癌、肝硬化、肝炎和健康人群样本组成验证集，总样本数为340例。如表1所示。
表1训练集和验证集样本组成
Figure BDA0002586583780000021
3、血清lncRNAs相对表达量测定
空腹情况下抽取5mL静脉血，以2500r/min的转速进行离心处理5min，分离血清，用总RNA提取试剂盒提取总RNA。取2μg总RNA于反转录试剂盒中合成cDNA。取cDNA置于PCR扩增仪中扩增，反应条件为94℃15min预变性，60℃30s退火，72℃30s延伸，40个循环。采用相对定量法，测定目的基因、GAPDH的PCR产物的Ct值，以2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量，各设3个复孔，实验重复3次。
LINC00698基因上游引物序列(Sequence NO.1)：5’-GTGCTTTTTGAGTGCTACGAG-3’；
LINC00698基因下游引物序列(Sequence NO.2)：5’-ATTGCGGACTACCACGAGATC-3’；
NONMMUT032844基因上游引物序列(Sequence NO.3)：
5’-CATCTATTCATCCACATACCCA-3’；
NONMMUT032844基因下游引物序列(Sequence NO.4)：
5’-TCTTCTAATTGGATCTCCCTAC-3’；
LINC01095基因上游引物序列(Sequence NO.5)：5’-TCCCGCACTGGTTAGTCATT-3’；
LINC01095基因下游引物序列(Sequence NO.6)：5’-GCCACGAACGCATCCGTAGT-3’；
LOC283731基因上游引物序列(Sequence NO.7)：5’-ACGGTACCTGTCCAGTTCT-3’；
LOC283731基因下游引物序列(Sequence NO.8)：5’-GTTTGCGTGTTAATGAATG-3’；
GAPDH基因上游引物序列(Sequence NO.9)：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3；
GAPDH基因下游引物序列(Sequence NO.10)：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。
4、统计学处理
采用SPSS 19.0处理数据，所有计量资料均进行正态和方差齐性检验，符合正态分布的数据用均值±偏差表示，不符合正态和方差齐性检验的计量资料采用非参数检验，组间两两比较采用t检验。采用SPSS 19.0绘制血清lncRNAs单独或联合诊断区分原发性肝癌和非原发性肝癌的受试者工作特征(ROC)曲线，并计算曲线下面积(AUC)，并利用AUC评估血清lncRNAs单独或联合对原发性肝癌和非原发性肝癌的诊断价值；AUC≤0.5为无诊断价值，0.5＜AUC≤0.7为诊断准确性较低，0.7＜AUC≤0.9为诊断准确性较好，AUC≥0.9为诊断准确性最高，P＜0.05为差异有统计学意义。
三、试验结果
1、血清lncRNAs在原发性肝癌和非原发性肝癌人群中含量比较
血清目标lncRNAs在原发性肝癌和非原发性肝癌中含量如表2所示，与非原发性肝癌相比，血清LINC00698、NONMMUT032844、LINC01095和LOC283731在原发性肝癌人群中的含量均显著升高。
表2血清目标lncRNAs在原发性肝癌和非原发性肝癌人群中含量
原发性肝癌 非原发性肝癌
LINC00698 28.35±5.16 6.27±4.03
NONMMUT032844 20.18±6.37 5.05±2.64
LINC01095 19.55±6.92 8.38±3.51
LOC283731 17.29±3.60 6.95±4.67
2、训练集中ROC曲线分析
训练集中，血清LINC00698、NONMMUT032844、LINC01095或LOC283731单独诊断区分肝癌和非肝癌的ROC曲线分别如图1～4所示，AUC分别为0.756、0.795、0.772、0.783。
训练集中，以各样本LINC00698相对含量为自变量X1，NONMMUT032844相对含量为自变量X2，以组别肝癌和非肝癌为应变量，使用SPSS软件对LINC00698、NONMMUT032844在肝癌和非肝癌样本中的含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：Ln[p/(1-p)]＝4.939X1+5.356X2-7.251，再将各样本中LINC00698、NONMMUT032844含量代入该二元逻辑回归方程，得到各血清样本的p值，以可能p值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，绘制ROC曲线，如图5所示，AUC＝0.954，灵敏度为97.2％，特异性为90.1％。根据ROC曲线计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值对应的p值为诊断区分肝癌和非肝癌的最佳cut-off值0.612。
训练集中，以各样本LINC00698相对含量为自变量X1，LINC01095相对含量为自变量X2，LOC283731相对含量为自变量X3，以组别肝癌和非肝癌为应变量，使用SPSS软件对LINC00698、LINC01095、LOC283731在肝癌和非肝癌样本中的含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：Ln[p/(1-p)]＝4.502X1+4.779X2+5.251X3-8.138，再将各样本中LINC00698、LINC01095、LOC283731含量代入该二元逻辑回归方程，得到各血清样本的p值，以可能p值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，绘制ROC曲线，如图6所示，AUC＝0.983，灵敏度为99.8％，特异性为92.9％。根据ROC曲线计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值对应的p值为诊断区分肝癌和非肝癌的最佳cut-off值0.684。
本领域技术人员知道，AUC≤0.5为无诊断价值，0.5＜AUC≤0.7为诊断准确性较低，0.7＜AUC≤0.9为诊断准确性较好，AUC≥0.9为诊断准确性最高，上述AUC结果可知，LINC00698、NONMMUT032844、LINC01095、LOC283731单独用于区分肝癌和非肝癌的诊断准确性低，LINC00698和NONMMUT032844联合或LINC00698、LINC01095和LOC283731联合用于区分肝癌和非肝癌的诊断准确性最高。
3、验证集中诊断准确率验证
验证集中，将各样本中LINC00698相对含量(X1)、NONMMUT032844相对含量(X2)代入上述二元逻辑回归方程Ln[p/(1-p)]＝4.939X1+5.356X2-7.251，得到各血清样本的回归预测概率p，高于最佳cut-off值0.612的预测为肝癌，反之预测为非肝癌，准确率为91.5％(311/340)。
验证集中，将各样本中LINC00698相对含量(X1)、LINC01095相对含量(X2)、LOC283731相对含量(X3)代入上述二元逻辑回归方程Ln[p/(1-p)]＝4.502X1+4.779X2+5.251X3-8.138，得到各血清样本的回归预测概率p，高于最佳cut-off值0.684的预测为肝癌，反之预测为非肝癌，准确率为93.2％(317/340)。
结果表明，LINC00698和NONMMUT032844或LINC00698、LINC01095和LOC283731联合诊断原发性肝癌的准确率在90％以上，具有开发成原发性肝癌诊断试剂盒的价值。
实施例2：
一种原发性肝癌诊断试剂盒，包括血清LINC00698和NONMMUT032844测定试剂。
一种原发性肝癌诊断试剂盒，包括血清LINC00698、LINC01095和LOC283731测定试剂。
序列表
<110> 南京凡亦达生物科技有限公司
<120> LncRNAs用于制备原发性肝癌早期诊断试剂盒的用途
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgctttttg agtgctacga g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attgcggact accacgagat c 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catctattca tccacatacc ca 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcttctaatt ggatctccct ac 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcccgcactg gttagtcatt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccacgaacg catccgtagt 20
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acggtacctg tccagttct 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtttgcgtgt taatgaatg 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (1)

1.LINC00698、LINC01095和LOC283731的检测试剂联合用于制备原发性肝癌早期诊断的血清检测试剂盒的用途。
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