CN108004318A

CN108004318A - 用于早期乳腺癌筛查的血清miRNA标志物组合及其应用

Info

Publication number: CN108004318A
Application number: CN201711157870.XA
Authority: CN
Inventors: 杜红丽; 庾晓康; 梁锦升
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2018-05-08

Abstract

本发明公开一种用于早期乳腺癌筛查的血清miRNA标志物组合及其应用。本发明的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合，包括的3个miRNA分别为：has‑miR‑21‑5p、has‑miR‑10b‑5p、has‑miR‑99a‑5p。本发明采用生物信息技术优势，基于大规模高通量组织测序数据，结合血清样本的验证，快速筛选出能有效检测出早期乳腺癌的血清miRNA组合。此筛查方法可以大大降低数据获得成本和减少早期乳腺癌血清标志物筛选过程的时间。本发明提供的包括3个miRNA的血清标志物组合，应用标志物组合作为检测靶标，可达到降低检测成本和提高乳腺癌病人的早期检出率的目的。

Description

用于早期乳腺癌筛查的血清miRNA标志物组合及其应用

技术领域

本发明涉及利用高通量测序数据生物信息分析技术优势，筛查及获得与乳腺癌发病相关并能准确区分早期乳腺癌病人的miRNA组合，并用实时荧光定量PCR技术在血清样本中验证miRNA标志物，特别涉及用于早期乳腺癌筛查的血清miRNA标志物组合及其应用。

背景技术

乳腺癌是全球女性常见的恶性肿瘤之一，据统计，我国每年女性乳腺癌发病16.9万例，是女性最常见恶性肿瘤排名的第二位；每年我国女性乳腺癌死亡约4.5万例，是女性第六位最常见的恶性肿瘤死亡原因。乳腺癌早期多数没有临床症状，大多数乳腺癌患者直到晚期才被诊断出来。若能做到早期发现、早诊断、早治疗，就可显著降低患者的死亡率，提高治愈率，提高患者的生活质量并减轻其疾病负担。因此，能够找到早期乳腺癌的分子标志物对于乳腺癌的发生、发展、治疗及预后都具有重要的临床意义。

目前乳腺癌主要的诊断手段是乳房造影扫描以及组织活检，但前一种方法的早期诊断准确率不高，第二种方法过程繁琐费时，早期不易取样，对病人身体有损伤，不受大众青睐，不能尽早地检测出潜在的高危人群。常规的血清标志物癌胚抗原(CEA)、糖链抗原153(CA153)在早期诊断中的灵敏度和特异性也不高。所以，乳腺癌的诊治中亟需找到灵敏性、特异性较好的非侵入性标志物用于早期诊断。

microRNA，是一类长约22个核苷酸的小分子单链RNA，是生物体内重要的调节分子，不仅在组织内表达，还能够在外周血中稳定存在。许多研究表明，在肿癌的出现，发展以及转移的过程中都会伴随着microRNA的表达变化。这些变化也许可以在早期的诊断上为我们提供有用的信息，这也意味着microRNA有望成为一种新兴的生物标志物运用在肿瘤及其他疾病的诊治中。然而目前大部分研究的实验方法使用传统的qPCR技术来获得血浆或血清中的miRNA的表达情况，因此检测的候选分子数有限，通量低，样本的来源也非常受限。不少研究机构公开的数据库里有大量的样本和对应的数以千计的分子表达情况信息，我们可以把这些数据利用起来，从大数据里得到更为全面的结果。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于高通量测序数据的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合筛选方法。检测的miRNA多则成本高，因此，本发明旨在利用现有的高通量测序数据数据库筛出少数几个能有效检测出早期乳腺癌的miRNA标志物，以达到降低样本获得成本和加快早期乳腺癌血清标志物筛选的目的。

本发明的目的在于提供一组能有效检测出早期乳腺癌的血清miRNA标志物组合，以达到降低检测成本和提高乳腺癌病人的早期检出率的目的。

本发明的另一目的在于提供所述血清miRNA标志物组合的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于高通量测序数据的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合筛选方法，包括如下步骤：

本发明首先对The Cancer Genome Atlas数据库(TCGA数据库)中的乳腺癌miRNA组织高通量测序数据进行处理，通过生物信息分析技术获得与乳腺癌发生相关的miRNA并利用大型计算机对上述miRNA的全排列组合进行组织特异性和灵敏度分析，从而筛选出高特异性和高灵敏度以及尽量降低检测成本的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合，最后采用实时荧光定量PCR技术验证血清miRNA标志物组合的有效性。

优选的，所述的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合为3个有价值的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合，具体的，该miRNA标志物组合包括has-miR-21-5p、has-miR-10b-5p、has-miR-99a-5p。

一种早期乳腺癌血清miRNA标志物组合，包括的3个miRNA分别为：has-miR-21-5p、has-miR-10b-5p、has-miR-99a-5p。

所述的has-miR-21-5p的序列为：5′-uagcuuaucagacugauguuga-3′；

所述的has-miR-10b-5p的序列为：5′-uacccuguagaaccgaauuugug-3′；

所述的has-miR-99a-5p的序列为：5′-aacccguagauccgaucuugug-3′；

所述的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合在制备试剂盒或检测方法中的应用；所述试剂盒或检测方法的用途为乳腺癌早期诊断。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用生物信息技术优势，基于大规模高通量组织测序数据，结合血清样本的验证，快速筛选出能有效检测出早期乳腺癌的血清miRNA组合。此筛查方法可以大大降低数据获得成本和减少早期乳腺癌血清标志物筛选过程的时间。

(2)本发明提供的包括3个miRNA的血清标志物组合，应用标志物组合作为检测靶标，可达到降低检测成本和提高乳腺癌病人的早期检出率的目的。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、高通量测序数据来源：

从TCGA数据库(网址https://cancergenome.nih.gov/)下载87例正常人及409例乳腺癌早期病人(I期或II期)miRNA组织测序数据集。

2、血清miRNA标志物筛选：

a)将高通量数据分成正常数据集和早期乳腺癌数据集，进行差异表达分析，选择符合校正后p值小于0.05，拷贝数均值高于100，变化倍数大于4的20个miRNA；

b)结合相关文献中正常人血清测序数据，进一步选取拷贝数较低的11个miRNA为候选的血清miRNA标志物，接着将选取的miRNA进行全组合，根据高通量测序数据计算每个组合的特异性及灵敏度；

c)考虑标志物组合需要高特异性和高灵敏度以及尽量降低检测成本，选择了一组由3个miRNA组成的血清miRNA标志物组合，分别是has-miR-21-5p、has-miR-10b-5p、has-miR-99a-5p。详见表1。

表1 3个血清miRNA标志物的序列及其组织特异性和灵敏度

名称	序列(5′-3′)	特异性	灵敏度
				has-miR-21-5p	uagcuuaucagacugauguuga	93.1％	97.3％
has-miR-10b-5p	uacccuguagaaccgaauuugug	97.7％	91.7％
				has-miR-99a-5p	aacccguagauccgaucuugug	93.1％	92.6％
以上标志物的组合		98.8％	94.4％

3、血清miRNA标志物在血清样本中的验证

a、血清样本来源：

健康个体血清样本(27份)从广东省中医院二沙岛分院检验科收集，早期乳腺癌病人血清样本(24份)从中山大学附属肿瘤医院检验科收集。血清样本常温下13400g离心10分钟，重新吸取上清到无核酶EP管中，于-80℃储存。

b、血清样本的全RNA提取参照QIAGEN公司生产的miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒的说明书进行操作；

c、全RNA逆转录成cDNA的过程参照宝生物工程(大连)有限公司生产的Mir-X^TMmiRNA First Strand Synthesis Kit试剂盒的说明书进行操作；

d、实时荧光定量PCR反应参照赛默飞世尔科技公司生产的PowerUp^TMSYBR^TM GreenMaster Mix试剂盒的说明书进行操作，检测平台使用Roche 480高通量实时荧光定量PCR系统；

e、PCR引物由天根生化科技(北京)有限公司设计合成购买；

f、以每个样本的基因组DNA作为模板进行PCR反应，PCR反应体系(20μL)如表2。

表2实时荧光定量PCR反应体系

混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为：

表3 3个血清miRNA标志物的相对表达量及其血清特异性和灵敏度

名称	相对表达量(2^-△△Ct)	特异性	灵敏度
				has-miR-21-5p	0.687±0.313	82.4％	78.6％
has-miR-10b-5p	0.706±0.235	76.5％	71.4％
				has-miR-99a-5p	0.62±0.348	58.8％	92.9％
以上标志物的组合		82.4％	85.7％

从表3中可知，以组合的方式使用标志物，可以有效地综合各个标志物的优势，相对于单独的标志物，标志物组合可同时获得高的特异性和灵敏度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 用于早期乳腺癌筛查的血清miRNA标志物组合及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> has-miR-21-5p

<400> 1

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> has-miR-10b-5p

<400> 2

uacccuguag aaccgaauuu gug 23

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> has-miR-99a-5p

<400> 3

aacccguaga uccgaucuug ug 22

Claims

1.一种基于高通量测序数据的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合筛选方法，其特征在于包括如下步骤：

首先对The Cancer Genome Atlas数据库中的乳腺癌miRNA组织高通量测序数据进行处理，通过生物信息分析技术获得与乳腺癌发生相关的miRNA并利用大型计算机对上述miRNA的全排列组合进行组织特异性和灵敏度分析，从而筛选出高特异性和高灵敏度以及尽量降低检测成本的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合，最后采用实时荧光定量PCR技术验证血清miRNA标志物组合的有效性。

2.根据权利要求1所述的基于高通量测序数据的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合筛选方法，其特征在于：

所述的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合为3个有价值的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合。

3.根据权利要求1或2所述的基于高通量测序数据的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合筛选方法，其特征在于：

所述的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合包括has-miR-21-5p、has-miR-10b-5p、has-miR-99a-5p。

4.一种早期乳腺癌血清miRNA标志物组合，其特征在于包括的3个miRNA分别为：has-miR-21-5p、has-miR-10b-5p、has-miR-99a-5p。

5.根据权利要求4所述的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合，其特征在于：

所述的has-miR-21-5p的序列为：5′-uagcuuaucagacugauguuga-3′；

所述的has-miR-10b-5p的序列为：5′-uacccuguagaaccgaauuugug-3′；

所述的has-miR-99a-5p的序列为：5′-aacccguagauccgaucuugug-3′。

6.权利要求4或5所述的早期乳腺癌血清miRNA标志物组合在制备试剂盒或检测方法中的应用，其特征在于：所述试剂盒或检测方法的用途为乳腺癌早期诊断。