CN109182514A

CN109182514A - 肺癌诊断或转移诊断标志物LncRNA Loc729658和试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109182514A
Application number: CN201810982669.3A
Authority: CN
Inventors: 黎孟枫; 蔡俊超; 张乐; 连容; 许笑南; 冯显明; 李旭; 刘夕梦; 刘蕾; 朱勋; 管洪宇; 吴珏珩
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-08-27
Filing date: 2018-08-27
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2038-08-27
Also published as: CN109182514B

Abstract

本发明属于疾病诊断预防技术领域，具体公开了一种用于肺癌诊断或转移诊断标志物Lnc RNA Loc729658和试剂盒及其应用。所述Lnc RNA Loc729658的序列如SEQ ID NO:1所示，可通过检测患者血清中Lnc RNA Loc729658的表达水平来判断患者是否患有肺癌，当检测发现Lnc RNA Loc729658表达量显著高于正常人时，可作为判定其为肺癌的诊断依据，从而指导临床医生进行早期干预和治疗，提高患者的生存率和生存质量，具有较大的应用前景。

Description

肺癌诊断或转移诊断标志物LncRNA Loc729658和试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术及医学领域，更具体地，涉及一种用于肺癌诊断或转移诊断标志物Lnc RNA Loc729658和试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌不仅是当前全球发病率最高而且是死亡病例数最多的恶性肿瘤。全国第三次死因回顾和国家癌症中心最新发布的调查报告显示，由肺癌导致的死亡病例数为各种肿瘤致死数之首，占恶性肿瘤分类构成的20％以上。虽然近年来诊断方法、手术技术以及化疗药物和靶向治疗药物方面均有新的发展，但肺癌患者总体5年生存率仍非常低，仅为15％左右，传统的肺癌检测方法需要可观的临床组织样本，往往只有术后或者多次穿刺的患者样本能够满足需求，商业化抗体的检测敏感性和特异性有待进一步提高，临床上亟需建立一种快速有效的可以直接通过检测血液，兼顾灵敏性和特异性的检测方法，因此寻找新型肿瘤标志物一直是肿瘤研究领域的重要课题。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)被认为是在进化过程中累积的“垃圾序列”而未予关注。随着基因组深度测序技术的发展，研究人员发现基因组近74％的转录产物为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，在ncRNA中，绝大多数转录本的长度大于200个碱基，被称为“长链非编码RNA”，它们能够在转录、转录后和翻译后水平上调节蛋白编码基因的表达，从而广泛地参与细胞分化和个体发育等重要生命过程，其异常表达与包括肿瘤在内的多种人类重大疾病的发生发展密切相关，近年来成为基础研究的热点。目前，在肿瘤组织中陆续发现了一些异常表达的IncRNA，其作为肿瘤标志物、肿瘤治疗靶点的潜力更是日渐显现，为探索IncRNA在肺癌中的作用和肺癌的诊断治疗以及机制研究提供了新策略。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有肺癌检测技术的不足，提供一种与肺癌发生发展相关的生物标志物，通过检测该分子标志物的表达水平来判断患者是否患有肺癌，从而指导临床医生进行早期干预和治疗，提高患者的生存率和生存质量。

本发明的第一个目的是提供一种肺癌诊断标志物LncRNA Loc729658。

本发明的第二个目的是提供一种用于诊断肺癌的试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种肺癌诊断或转移诊断标志物LncRNA Loc729658，所述LncRNA Loc729658的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述标记物不仅限于上述序列，理论上，只要是含有SEQ IDNO:1所述核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物应都在本发明保护内。

本发明经过前期大量研究发现，SEQ ID NO:1所示LncRNA Loc729658的表达量与肺癌相关，可以将其作为临床判定肺癌的诊断标志物。

因此，本发明请求保护SEQ ID NO:1所示LncRNA Loc729658在制备肺癌诊断或转移诊断试剂盒中的应用。

同时，本发明还提供一组用于检测上述标志物LncRNA Loc729658的引物对和探针，所述引物对包括上游引物F和下游引物R，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:2～3所示，所述探针为SEQ ID NO:4～9中的任意一种，所述探针的5’末端结合有荧光物质，3’末端结合有淬灭物质；

优选地，所述荧光物质为FAM、HEX、CY5中的至少一种；所述淬灭物质为BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种。

更优选地，所述LncRNA Loc729658荧光探针的5’末端结合有荧光物质FAM，3’末端结合有淬灭物质BHQ1。

LncRNA Loc729658-F(SEQ ID NO:2)：5’-TACCTTCCCAGATCATTT-3’；

LncRNA Loc729658-R(SEQ ID NO:3)：5’-CTTGAAGAATGGATAGGATT-3’。

LncRNA Loc729658探针：

5’-FAM-CTCCGTCCTCATTCATTCACTCTT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:4)；

5’-FAM-TCCGTCCTCATTCATTCACTCTTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO:5)；

5’-FAM-CCGTCCTCATTCATTCACTCTTCA-BHQ1-3’(SEQ ID NO:6)；

5’-FAM-CCTCCGTCCTCATTCATTCACT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:7)；

5’-FAM-CCTCCGTCCTCATTCATTCACTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO:8)；

5’-FAM-CTCCGTCCTCATTCATTCACTCT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:9)。

本发明还请求保护上述标志物LncRNA Loc729658的引物和探针在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。

一种肺癌诊断制剂或试剂盒，含有上述LncRNA Loc729658的特异性扩增引物。

优选地，所述特异性扩增引物包括引物对和探针，所述引物对包括上游引物F和下游引物R，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:2～3所示，所述探针为SEQ ID NO:4～9中的任意一种。

LncRNA Loc729658-F(SEQ ID NO:2)：5’-TACCTTCCCAGATCATTT-3’；

LncRNA Loc729658-R(SEQ ID NO:3)：5’-CTTGAAGAATGGATAGGATT-3’。

LncRNA Loc729658探针：

5’-FAM-CTCCGTCCTCATTCATTCACTCTT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:4)；

5’-FAM-TCCGTCCTCATTCATTCACTCTTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO:5)；

5’-FAM-CCGTCCTCATTCATTCACTCTTCA-BHQ1-3’(SEQ ID NO:6)；

5’-FAM-CCTCCGTCCTCATTCATTCACT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:7)；

5’-FAM-CCTCCGTCCTCATTCATTCACTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO:8)；

5’-FAM-CTCCGTCCTCATTCATTCACTCT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:9)；。

优选地，所述试剂盒还含有用于扩增内参基因的引物对和探针，包括上游引物F和下游引物R和探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:10～12所示，所述内参基因荧光探针的5’末端结合有荧光物质CY5，3’末端结合有淬灭物质BHQ2。

ACTB Sense primer(SEQ ID NO:10)：

5’-ATCACCATTGGCAATGAG-3’；

ACTB Antisense primer(SEQ ID NO:11)：

5’-GATGGAGTTGAAGGTAGTT-3’；

ACTB TaqMan Probe(SEQ ID NO:12)：

5’-CY5-CACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-BHQ2-3’。

优选地，所述试剂盒还含有阳性对照液和阴性对照液。

优选地，所述试剂盒还包括述荧光定量PCR反应液：dNTP、Mg2、Taq酶及buffer缓冲液等。

优选地，所述试剂盒的荧光定量PCR反应体系为cDNA 2μL，Taqman Mix(Roche480)10μL，Forward Primer 1μL，Reverse Primer 1μL，Probe 1μL，3d H₂O 5μL。

优选地，所述所述试剂盒的荧光定量PCR的反应程序：95℃15min；95℃15sC；60℃45s，重复45次。

优选地，所述试剂盒还含有提取样本总RNA所需的试剂。

本发明还提供一种体外检测样本中Loc729658基因表达水平的基因芯片，包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性识别Loc729658。

上述试剂盒的使用方法为：

S1.提取样品总RNA：采集血液，提供血浆中的总RNA。

S2.制备样品DNA模板：将提取的总RNA反转录合成cDNA。

S3.扩增Loc729658：将反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。

用SPSS 18.0统计软件对受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve，ROC)进行分析，确定样品的cutoff值；若样品的cutoff值大于0.784，则判定为肺癌患者。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种肺癌诊断或转移诊断相关的Lnc RNA Loc729658标志物，所述Lnc RNA Loc729658的序列如SEQ ID NO:1所示，可通过检测患者血清中Lnc RNALoc729658的表达水平来判断患者是否患有肺癌，当检测发现Lnc RNA Loc729658表达量显著高于正常人时，可作为判定其为肺癌的诊断依据，本发明血清中IncRNA Loc729658分子对肺癌的诊断效能达0.957(95％CI 0.929一0.985)。同时提供了一种用于检测Lnc RNALoc729658表达量从而进行肺癌诊断或转移诊断的试剂盒，通过对阳性样品的检测，本发明定量试剂盒检测准确率为83％～87％，连续3次重复实验，实验结果稳定，从而指导临床医生进行早期干预和治疗，提高患者的生存率和生存质量，具有较大的应用前景。

附图说明

图1：本发明试剂盒敏感性评价结果；

图2：本发明试剂盒特异性评价结果；

图3：血清中IncRNA Loc729658对肺癌的诊断价值。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

本发明人团队经过前期的大量研究发现，SEQ ID NO:1所示Lnc RNA Loc729658与肺癌的诊断、转移相关，推测其可作为肺癌诊断或转移诊断标志物。

下面通过荧光定量PCR检测Lnc RNA Loc729658在待测样本中的表达量来进行验证。步骤如下：

(1)病例资料：

中山大学附属第一医院收治的肺癌患者113例，所有患者均经组织病理学确诊，且为初次诊断，之前未接受任何治疗。同时选择同期在中山大学附属第一医院查体的健康体检者101例作为对照，所有受试者均未合并疾病，肝心肾功能正常，既往无肿瘤病史两组间性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

(2)血清标本采集：血清收集于促凝管内，4℃1600×g离心10min，然后进一步4℃16000×g离心10min，收集血清，置-80℃冻存待测。

(3)将上述样品进行逆转录，操作如下：

①按以下说明加样(一个反应体系)：

表1反应体系

组分	体积
		Random Primer(10μM)	1μL
RNA template	1μg
		RNase-free H<sub>2</sub>O	至13μL

置于PCR仪中，70℃5min，然后立即在冰上冷却5min。

②在上述反应体系中加入以下试剂进行逆转录反应：

表2逆转录反应体系

轻轻混匀后，置于PCR仪中，40℃1h；70℃5min。逆转录产物置于4℃短暂保存，或者进行后续操作。

(3)实时定量PCR检测Lnc RNA Loc729658的表达量

①实时定量PCR检测引物和探针

Loc729658Sense primer：5’-TACCTTCCCAGATCATTT-3’；

Loc729658Antisense primer：5’-CTTGAAGAATGGATAGGATT-3’。

Loc729658TaqMan Probe(任选其一)：

5’-FAM-CTCCGTCCTCATTCATTCACTCTT-BHQ1-3’；

5’-FAM-TCCGTCCTCATTCATTCACTCTTC-BHQ1-3’；

5’-FAM-CCGTCCTCATTCATTCACTCTTCA-BHQ1-3’；

5’-FAM-CCTCCGTCCTCATTCATTCACT-BHQ1-3’；

5’-FAM-CCTCCGTCCTCATTCATTCACTC-BHQ1-3’；

5’-FAM-CTCCGTCCTCATTCATTCACTCT-BHQ1-3’。

ACTB Sense primer：5’-ATCACCATTGGCAATGAG-3’；

ACTB Antisense primer：5’-GATGGAGTTGAAGGTAGTT-3’；

ACTB TaqMan Probe：5’-CY5-CACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-BHQ2-3’。

②一个反应体系需按下说明加样：

表3荧光定量PCR反应体系

反应条件：95℃15min；95℃15s，60℃45s，重复45个循环。

(4)试剂盒敏感性评价

首先提取A549肺癌细胞系总RNA，逆转录为cDNA，随后进行10倍倍比梯度稀释，得到10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍稀释的cDNAs，再次采用该试剂盒及方法检测IncRNA Loc729658，并与传统实时荧光定量PCR方法比较。如图1所示，结果表明：采用该试剂盒及方法IncRNA Loc729658检测限可达到10⁷倍稀释，而传统方法检测限仅可达到10⁴倍稀释；另外，本试剂盒及方法的灵敏度比传统方法高1000倍。

(5)试剂盒特异性评价

对最终PCR的产物进行正向和反向测序，其中正向测序序列为：

5'—CTCAGACACCCTCCGTCCTCATTCATTCACTCTTCAATTGTCCAACAAATATTTGTTGCTCATGCAACCTGGATCACCCA

CATAGTTTCAAGACTGCATCTTCTAAACTATTTAAATCCTATCCATTCTTCAAG—3'

反向测序序列为：

5'—AGTTTAGAAGATGCAGTCTTGAAACTATGTGGGTGATCCAGGTTGCATGAGCAACAAATATTTGTTGGACAATTGAAGAG

TGAATGAATGAGGACGGAGGGTGTCTGAGATCAGGAAAATGATCTGGGAAGGTA—3'

将正、反向测序序列进行拼接，经BLAST分析，结果如图2所示，发现扩增产物与GeneBank数据库(https//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中IncRNA Loc729658序列完全匹配，说明本试剂盒扩增的最终PCR产物的确为IncRNA Loc729658分子。

(6)血清分泌型IncRNA Loc729658对肺癌的诊断价值

以113肺癌患者作为阳性组，101例健康体检者作为阴性组，SPSS 18.0统计软件的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)分析，如图3所示，结果表明：血清中IncRNA Loc729658分子对肺癌的诊断效能可达0.957(95％CI 0.929～0.985)，最大约登指数(灵敏度+特异度-1)对应最佳cut off值为0.784。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 肺癌诊断或转移诊断标志物LncRNA Loc729658和试剂盒及其应用

<141> 2018-08-27

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2235

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

agacccaagc tggctagcga aatcaattca acaacaactg ccccggtgct tccccgtaga 60

tagcaccgct ggtcagttcg ggaggggatg ggacattgag gagcaggaca gtcttcagga 120

agcttacagt ctgctttggg ttgtttcagg aacacagtca tccctcagaa atggattggg 180

tgacaagtgg tctgcatgct gcacacgggc actgggtctc tgaatgtaac caaattgttc 240

tcctcttatc attcccattc actggtgtac ttgtttgtgg agcctgcaga actgcctttt 300

tcaagaatgg cagcttggcc tctaaatctg cttcccactg atgggaagag ctgacagaag 360

ctttagagag gcacagggtg agttcctaaa accagagtca acacacactc ttcatctgtt 420

ttgtgcttca ctccctgctc atcttcctaa aacactgagt ttggtcatat catgtcctac 480

aagttgtcaa tgatttccca tgatcttgtc ttcaggataa agttccttag tcaaaagcaa 540

tgaagacctg acctaatctg taaggcaaaa tcaacacttt ttagcctggc cttccatgcc 600

cttccatgcc cttcgagccc ccagagcacc catggcagtc catctctctc tacttgtcca 660

gagggacact ctcttagagc cagtggctcc tactcacggt tccccgaaca cgtcgtggga 720

atgtttgcct tcataccttc ccagatcatt ttcctgatct cagacaccct ccgtcctcat 780

tcattcactc ttcaattgtc caacaaatat ttgttgctca tgcaacctgg atcacccaca 840

tagtttcaag actgcatctt ctaaactatt taaatcctat ccattcttca agaaatgttt 900

catgacgctt ccttaactgc taaggacccg cagattctct tcctcttggg actcacacac 960

tgactcatct cccgatcttt tggtgctcag caaagtggag gcttctgttt tggacttaga 1020

gtcaagacca ttaaataaga ctatgctcta aaaagtacac ctccgtggcc cggaacgagt 1080

gaattaacat ctatgagttt ccatttcctt gtctataaaa ttgtgaaatt gcaacttaag 1140

attagttctg aagattaaat gaggtaacat aggtgaaaat gctacattta tgtaagaaat 1200

tactctttca taaggatgtc aatgtttaaa tacgcatttt ctcaattttg ttaatgaaat 1260

actttgaaat tcttttttct aatgaaacct gctgaatgta aaagagaccc gtactaaaga 1320

aagataccac atgaagcacc aagggtctct ttctggatct atcatgactc ttgtgactgt 1380

ttcagcagca cagaaattaa aggcgattgt tattctggag gaagacaatg agtctcatct 1440

atatcttgtt tgggttgatt ttgtaaacag aacattccaa agatcattct tgccttttgt 1500

ttccactgag aactagaata aagtaaaaca aactatcaat ttaaggaaag cctcgaaatt 1560

gttagcaatt tcttcagtaa ctttcatcca tcaactgatt ttatgaacac aaatttgcag 1620

aaatgggcaa gaaaaactac ttaactcatt ggtgggaagc agtgggctct ctaaggaggg 1680

agagatagca gtgatttcac caccggaccg tggaacacaa agagcctgga agagtctatc 1740

actttcaact gaaaccgcaa gaagaactaa gtaggttaag ccctaagaat gttcctaggt 1800

aacctacttg agttgaaatt tgactaagaa tccttacacc ctacctaaga gaggtaacgc 1860

tattaggatc ggaagtgatt ggaagctttg tttcagatct cgtccaaaag ggagaacggt 1920

caatgacaaa gctgctgtga atagtattct gggggcgtgg tggaaccccg attcactgct 1980

atctcccgaa tcagcaactt gacagagcgc gcctcccggg ccttggaagc cttccattcc 2040

gagctggctg ggtgggactc aggttttacg gtatgctgga ctttttcccc gtgagttaaa 2100

acacatttat agtaactaag tggttaatga tgagaaaaaa ccccaaacta ctgtactaat 2160

aatcaacctc tgctatttgg tttgtaaaaa acaaaaatac atctataaaa agggttggcc 2220

ggaaaaaaaa aaaaa 2235

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

taccttccca gatcattt 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

cttgaagaat ggataggatt 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

ctccgtcctc attcattcac tctt 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

tccgtcctca ttcattcact cttc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

ccgtcctcat tcattcactc ttca 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

cctccgtcct cattcattca ct 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

cctccgtcct cattcattca ctc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

ctccgtcctc attcattcac tct 23

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

atcaccattg gcaatgag 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

gatggagttg aaggtagtt 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 12

cactcttcca gccttccttc c 21

Claims

1.一种肺癌诊断或转移诊断标志物LncRNA Loc729658，其特征在于，所述LncRNALoc729658的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.SEQ ID NO:1所示LncRNA Loc729658在制备肺癌诊断或转移诊断试剂盒中的应用。

3.一组用于检测权利要求1所述标志物LncRNA Loc729658的引物对和探针，其特征在于，所述引物对包括上游引物F和下游引物R，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:2～3所示，所述探针为SEQ ID NO:4～9中的任意一种，探针的5’端结合有荧光物质FAM，3’端结合有淬灭物质BHQ1。

4.权利要求3所述标志物引物组在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。

5.一种肺癌诊断制剂或试剂盒，其特征在于，包含定性或定量检测LncRNA Loc729658表达量的试剂。

6.根据权利要求5所述的制剂或试剂盒，其特征在于，试剂为特异性扩增LncRNALoc729658的引物对和探针，所述引物对包括上游引物F和下游引物R，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:2～3所示，所述探针为SEQ ID NO:4～9中的任意一种，探针的5’端结合有荧光物质FAM，3’端结合有淬灭物质BHQ1。

7.根据权利要求6所述的制剂或试剂盒，其特征在于，还含有用于扩增内参基因的引物对和探针，包括上游引物F和下游引物R和探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:10～12所示，所述探针的5’端结合有荧光物质FAM，3’端结合有淬灭物质BHQ1。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有阳性对照液和阴性对照液。

9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有RNA逆转录所需试剂。