CN107937514A - circZFY在肺结核病生物标志物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种circZFY在肺结核病生物标志物中的应用,利用环状RNA表达谱芯片技术,通过差异分析,筛选到一条在肺结核患者血浆中显著高表达的circRNA,即circZFY,其转录区域位于12号染色体,全长1909bp。与健康对照者血浆相比,circZFY在肺结核患者血浆中显著高表达,并在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实肺结核患者血浆circZFY表达水平显著高于健康对照者。肺结核患者血浆circZFY表达水平在抗结核治疗后6月后显著降低。本发明制备了筛查circZFY的引物,circZFY将为研究肺结核的发病机制提供新的思路,也为肺结核的早期诊断及预后监测提供了新的靶标。
Description
技术领域
本发明属于天然核糖核苷酸的用途,涉及circZFY在肺结核病生物标志物中的应用。
背景技术
结核病是严重危害人类健康的慢性感染性疾病。WHO的报告显示,2015年约有1040万结核病新发病例,140万人因该病死亡。我国是全球30个结核病流行严重的国家之一,现有结核病患者人数居全球第三位。结核病的预防、诊断和治疗是结核病控制的三个主要环节,考虑到目前全球已有众多的感染者,早期发现和早期诊断结核病病人、及时给予有效治疗,是减少结核病传播机会、控制结核病疫情的关键环节。
目前,临床常用的结核病实验室诊断方法主要包括:影像学检查、涂片抗酸染色、结核菌培养、分子生物学及免疫学技术等。典型X线改变对肺结核有诊断价值,但X线胸片诊断肺结核特异性低;在资源匮乏地区,常规抗酸染色涂片对结核病的诊断发挥至关重要的作用,但其敏感度较低,而传统的结核菌培养法则耗时太长,难以满足临床需求。通过检测结核菌及其特异性DNA片段的PCR等分子生物学方法,可用于快速诊断结核菌感染,但存在一定假阳性和假阴性,且检测成本较高。目前发展的以T细胞应答为基础的γ-干扰素释放试验(IGRAs),相比于结核菌素皮试实验或有更高的敏感性与特异性,但IGRAs涉及操作步骤多、收费昂贵,且无法区分活动性结核病和结核潜伏感染。因此,寻找更为精确的特征性的生物标志物是早期诊断结核病的当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供circZFY在肺结核病生物标志物中的应用,以及检测circZFY的引物。
本发明利用环状RNA(circRNA)表达谱芯片技术,通过差异分析,筛选到一条在人肺结核病患者血浆中显著高表达的circRNA,即circZFY,其转录区域位于12号染色体,全长1909bp。与健康人群血浆相比,circZFY在人肺结核患者血浆中显著高表达。在大样本荧光定量PCR实验中进一步证实肺结核患者血浆circZFY表达水平显著高于健康对照者、肺炎患者和肺癌患者。肺结核患者血浆circZFY表达水平在抗结核治疗后6个月后显著降低,与健康对照人群血浆circZFY表达水平差异无统计学意义。这一新型的circZFY将为进一步研究肺结核的发病机制提供新的思路,也为肺结核的早期诊断及预后监测提供了新的靶标。
本发明提供了鉴别可能患有肺结核病对象的方法及其引物序列结构。
所述方法包括检测来自所述对象的样品中的circZFY量,其中较高量的circZFY与所述对象患有肺结核病的可能性增加相关。
本发明的有益效果有:1)提出了circZFY的用途;2)circZFY是一种新型生物标志物,区别传统生物标志物,不仅稳定、微创、易于检测,且定量精确,将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。circZFY在肺结核病人的血浆和健康对照者血浆中表达量存在差异,因此,circZFY具有成为肺结核诊断标志物的应用前景。
附图说明
图1为circRNA芯片检测结果图;
图2为使用circZFY筛查引物对肺结核患者和健康对照者血浆样品表达量筛查的结果图;
图3为肺结核患者血浆样本circZFY表达量与肺结核病人肺部损伤程度相关性图;
图4为抗结核治疗前后患者血浆样本circZFY检测结果图;
图5为ROC曲线分析图。
具体实施方式
环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类具有稳定闭合环状结构的内源性RNA分子,在哺乳动物中普遍存在,具有丰度高、结构稳定和组织特异性表达等特征。近年研究表明,circRNA可在转录及转录后水平调控基因表达功能,与多种疾病的发生及发展密切相关。随着circRNA研究的进一步深入,越来越多的证据表明circRNA表达谱会随着疾病进程发生变化。研究已经证实血清/血浆中存在着几百种circRNAs,这些circRNA分子性质稳定,含量丰富且不会降解,易于定量检测,并存在着显著的疾病特异性。血清/血浆circRNA作为疾病诊断和预后分子标志物不仅创伤小,方法便捷,还能改进疾病诊断,预后估计、疗效及复发预测的准确度。目前已有文献报道,circRNA可以作为癌症诊断标志物,但尚未见有关circRNA作为肺结核病诊断标志物的报道。
下面结合具体实验步骤对本发明进行进一步描述。
实施例1:人肺结核患者与健康对照者血浆的circZFY芯片表达分析
一、对象和方法
1.对象
江西省胸科医院结核科收治的肺结核患者3例,其中男2例,女1例。肺结核的诊断依据按照2005年中华医学会《临床诊疗手册(结核病分册)》诊断标准。所有肺结核患者均为初治患者,且痰涂片抗酸均为阳性。健康对照者3例为同期于南昌大学第一附属医院保健科体检者,胸片未见异常,近期无接触结核病史者,IFN-γELISPOT检测结果为阴性,其中男2例,女1例。所有对象均排除合并肿瘤、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制药物的患者;排除HBV、HCV、HIV感染者或(和)AIDS患者;排除孕妇或哺乳期妇女。
2.方法
(1)样本采集:清晨采集研究对象空腹静脉血,EDTA抗凝,4℃,2000×g离心5min;12000×g离心5min后分离得到血浆,-80℃保存备用。
(2)血浆总RNA提取:按Qiagen公司的RNA提取试剂盒(RNeasy MicroKit,货号74004)说明书提取研究对象血浆的总RNA。
(3)对样品RNA进行Cy5荧光标记(委托上海康成生物工程有限公司进行“ArrayStar Human CircRNA Microarray V1.0Service”进行标记服务)
(4)circZFY表达谱分析:根据试剂盒操作步骤,将每个样本的总RNA采用RNase R处理,去除线性RNA分子,然后采用随机引物扩增、反转录为荧光标记的cRNA,然后在芯片上杂交,洗片后,在扫描仪上扫描。提取circZFY芯片原始数据,用R软件包对数据进行归一化及后续数据处理,寻找2组样本间差异表达的circZFY,通过倍数变化(Fold Change)和P值进行筛选,采用t检验方法,差异circZFY的标准为LPS诱导组与空白对照组表达比值≥1.5倍且P<0.05。
3.结果
关于人肺结核患者血浆的circZFY芯片聚类分析见图1。芯片筛查发现多条表达上调和表达下调的circRNAs。其中circZFY在肺结核患者血浆中表达显著上调,鉴于其可能在人肺结核的血浆中存在特异性高表达,本发明通过以下实施例采用大规模样本进行验证。
实施例2:实时荧光定量PCR检测circZFY在肺结核患者血浆中的表达
一、对象与方法
1.对象
(1)肺结核组:收集江西省胸科医院结核科收治的初治活动性肺结核患者70例,男40例,女30例,平均年龄(36.7±10.4)岁。肺结核的诊断依据按照2005年中华医学会《临床诊疗手册(结核病分册)》诊断标准,并除外心、肝、肾等脏器并发症。所有肺结核患者均在抗结核治疗前采血。肺结核患者给予规范化治疗:异烟肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺2个月,异烟肼+利福平4个月。20例肺结核患者均在规范化抗结核治疗6个月后采血。
(2)健康对照组:收集同期南昌大学第一附属医院进行体检的健康人40例,其中男22例,女18例,平均年龄(38.5±11.2)岁。入组对象胸部影像学检查均正常,无结核病接触史。所有对象均排除合并高血压、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制药物的患者;排除HBV、HCV、HIV感染者或(和)AIDS患者;排除孕妇或哺乳期妇女。
2.方法
(1)样本采集:采集研究对象空腹静脉血,EDTA抗凝,4℃,2000×g离心5min;12000×g离心5min后分离得到血浆,-80℃保存备用。
(2)血浆总RNA提取及cDNA合成:向250μl血浆中加入750μl Trizol LS试剂,按Trizol LS试剂说明书提取血浆样本总RNA,DEPC处理过的蒸馏水溶解。
1)基因组DNA的去除
依次加入下表中的试剂,并混匀(配置反应液均在冰上操作)。
反应条件:42℃,2min。
2)逆转录反应
配置制反转录体系,并混匀(配置反应液均在冰上操作)。
反应条件:37℃,15min;85℃,5sec。
逆转录所得cDNA立即用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应或于-80℃保存。
(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证:采用SYBR法进行实时荧光定量PCR检测,检测步骤及反应条件参照试剂盒说明书(Premix Ex TaqTM,大连宝生物TaKaRa公司)进行。
circZFY上游引物为:5'-ACCTGCTCCTCTGATTCTGCT-3';
circZFY下游引物为5'-GGTGAGTGGCAAGTGAGAGA-3';
内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因上游引物为5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3';
内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因下游引物为5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。
qRT-PCR反应(配置反应液均在冰上操作,每个样本重复3次):
加样结束后,将PCR反应板置于ABI 7500 PCR扩增仪上检测。
反应条件:95℃ 30sec(1个循环);95℃ 5sec(40个循环);60℃ 30sec。
溶解曲线:95℃ 15sec;60℃ 1min;95℃ 15sec。
取平均Ct值做为该样本最后Ct值,以GAPDH基因作为内参基因,计算2-△△Ct值反映circZFY表达水平。
3.结果
qRT-PCR检测结果显示,肺结核组患者血浆circZFY的表达水平显著高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.001),见附图2。肺结核患者根据肺部病理损伤情况分为:重度、中度和轻度,相关性分析结果显示,肺结核患者血浆circZFY的表达水平与患者肺部病理损伤呈正相关,即表达水平越高,患者肺部病理损伤越重(见附图3)。对已收治的20例初治肺结核患者均进行了6个月的随访,检测患者接受抗结核治疗6个月后血浆中circZFY的表达变化。随访结果显示,随访患者抗结核治疗效果良好。qRT-PCR检测结果显示,与治疗前circZFY表达水平相比,治疗6个月后血浆circZFY的表达水平显著下降(P<0.001),见附图4。接受治疗6个月组血浆circZFY水平与健康对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。为了评估血浆中circZFY的诊断价值,绘制了肺结核患者区别于健康对照者的ROC曲线,见附图5。曲线下面积(AUC)显示,血浆circZFY在用于区别肺结核患者和健康人群时,具有较好的诊断价值(AUC=0.895)。最佳临界点的灵敏度为88.70%,特异度为80.12%,以证明circZFY能灵敏地作为肺结核患者诊断的分子标志物。
序列表
<110> 南昌大学第一附属医院
<120> circZFY在肺结核病生物标志物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> SEQ ID NO.1
<211> 1909
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID NO.1
O 2
Claims (7)
1.circZFY在制备肺结核病生物标志物中的应用,其特征在于,所述circZFY长1909bp,位于人类的第12条染色体上,所述circZFY的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用,其包括检测被检测对象的样品中的circZFY含量,其中所述circZFY的量与所述被检测对象患有肺结核病的概率成正相关关系。
3.如权利要求1或2所述的应用,肺结核病患者在抗结核治疗后circZFY含量降低表示治疗起作用。
4.如权利要求2或3所述的应用,其中所述circZFY的含量是从被检测对象的血浆样品中确定的。
5.一种引物,其特征在于,所述引物用于检测circZFY,所述circZFY长1909bp,位于人类的第12条染色体上,所述circZFY的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
6.如权利要求5所述的引物,其特征在于,所述引物用于获得被检测对象的血浆的circZFY的表达量。
7.如权利要求5或6所述的引物,其特征在于,所述引物由以下序列构成:
上游引物序列:5’-ACCTGCTCCTCTGATTCTGCT-3’;下游引物序列5’-GGTGAGTGGCAAGTGAGAGA-3’。
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