CN108588209A - 一种用于诊断心血管疾病的分子标志物Nlrp3及其应用 - Google Patents

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陈扬
王蕾
连大卫
袁慧琦
王韵廷
周星
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Abstract

本发明公开了一种诊断心血管疾病的分子标志物，所述分子标志物为Nlrp3。本发明还公开了所述分子标志物在筛选或制备用于诊断心血管疾病的试剂中的用途以及所述试剂在制备用于诊断心血管疾病试剂盒中的用途。本申请发明人发现Nlrp3的mRNA表达水平在心血管疾病患者血液中明显升高，可以作为心血管疾病检测的分子指标，具有无创、快速、灵敏和特异性高等优点。

Description

一种用于诊断心血管疾病的分子标志物Nlrp3及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于诊断心血管疾病的分子标志物Nlrp3及其应用。
背景技术
随着当今社会的老龄化，脑血管病已成为危害人类健康最重要的疾病之一，在我国死于脑血管病者多于心脏病及癌症，居三大死因首位。其中，尤其是脑梗塞对国民健康和经济发展构成威胁，所以日益受到政府和医学界的重视。心血管疾病在早期无明显临床症状，病人常在体检或出现典型的症状才被确诊，往往会错过治疗的最佳时期。如果在心血管疾病早期就能够及时发现并通过改变生活方式或药物干预会很大程度上改善患者的预后效果。目前心血管疾病临床诊断指标主要包括：同型半胱氨酸(HCY)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肌酸激酶(CK)、肌红蛋白(Mb/Myo)、脑钠肽(BNP)和内皮素(ET)等但这些指标多用于罹患心血管疾病的的诊断和分型，无法进行心血管疾病早期和不同阶段诊断。
血液中存在丰富的mRNA，便于检测，指标灵敏，且与特异性疾病存在显著的关联性。因此通过无创性的手段，快速，灵敏，特异性的定量检测方法，筛选心血管疾病患者血液中特异性表达或异常表达的mRNA作为分子标志物，研制心血管疾病的早期和不同阶段辅助诊断试剂盒，用于检测心血管疾病易感人群，评估罹患风险并采取有效的干预措施，对于遏制当前日益增长的心血管疾病发病趋势有显著的社会价值。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于诊断心血管疾病的试剂盒，其以Nlrp3作为心血管疾病检测的分子指标，具有无创、快速、灵敏和特异性高等优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种用于诊断心血管疾病的试剂盒，包含如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。
SEQ ID NO.1:5'-GGAGAGACCTTTATGAGAAAGCAA-3'。
SEQ ID NO.2:5'-GCTGTCTTCCTGGCATATCACA-3'。
优选地，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂和荧光染料。
优选地，所述荧光染料为SYBR。
本发明还提供了Nlrp3的mRNA作为分子标志物在筛选或制备用于诊断心血管疾病的试剂中的用途。
Nlrp3的mRNA可作为分子标志物用于筛选或制备用于诊断心血管疾病的试剂。
本发明还提供了检测Nlrp3的mRNA的试剂在制备用于诊断心血管疾病的试剂盒中的用途。
检测Nlrp3的mRNA的试剂可用于制备用于诊断心血管疾病的试剂盒。
优选地，所述检测Nlrp3的mRNA的试剂包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。
本发明还提供了Nlrp3蛋白作为分子标志物在筛选或制备用于诊断心血管疾病的试剂中的用途。
Nlrp3蛋白可作为分子标志物用于筛选或制备用于诊断心血管疾病的试剂。
本发明还提供了检测Nlrp3蛋白的试剂在制备用于诊断心血管疾病的试剂盒中的用途。
检测Nlrp3蛋白的试剂可用于制备用于诊断心血管疾病的试剂盒。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本申请发明人首次发现Nlrp3的mRNA表达水平在心血管疾病患者血液中明显升高，可以作为心血管疾病检测的分子指标，具有无创、快速、灵敏和特异性高等优点；(2)本发明提供的Nlrp3检测引物具有灵敏度高和特异性好等优点。
附图说明
图1为正常对照组(Control)和心血管疾病组(CVD)患者血液中Nlrp3的mRNA表达水平检测结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明用于诊断心血管疾病的试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包含以下组分：
(1)检测引物：所述检测引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
(2)总RNA提取试剂：Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC水；
(3)逆转录试剂；
(4)实时荧光定量RCR试剂。
所述检测引物通过常规方式合成，按说明配制成母液，可利用ddH2O稀释为工作浓度；
所述总RNA提取试剂均可通过购买获得；
所述逆转录试剂为FastQuant RT Kit，购于TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.，货号为03326；
所述实时荧光定量RCR试剂为Super Real Pre Mix×Plus(SYBR Green)，购于TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.，货号为03120。
实施例2
本实施例利用实施例1所述试剂盒对待检测者血液样本中Nlrp3的mRNA表达水平进行检测。
(一)检测方法
1、临床样本采集
整个收集及后续试验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料保密原则，研究样本的采样、分装、保存条件抑制。通过对病人病历资料整理，选择出由年龄超过35年没有心血管疾病的历史的109人作为正常对照组(Control)；由医生诊断有心血管疾病的150名患者作为心血管疾病组(CVD)。
2、血液中总RNA提取
取1ml新鲜血液样本，常温静置2h后，2500rpm离心20分钟，取分离后的上层血清200μl，加入1mlTrizol，吹打均匀后静置5min。加入200μl氯仿，手动反复震摇约15-20次，接着12000g，15min，4℃离心。离心完成后取出上层150μl含有RNA的溶液，加入500μl异丙醇，室温静置10min以分离RNA，接着12000g，10min，4℃离心，沉淀分离RNA。去除上清后，加入1ml预冷的75乙醇，反复颠倒至RNA沉淀漂起以去除残留的苯酚等杂质。7500g，5min，4℃离心，去上清，于超净台内高速风吹15min。加入20μl的DEPC水溶解RNA。按照1:10的比例，稀释样品检测RNA含量及纯度。以A260/A280在1.8-2.0为合格样品。
3、cDNA合成
测定合格的RNA样品，使用DEPC水调整浓度至500ng/μl。取2μl进行逆转录成为cDNA。逆转录体系和程序如表1所示。
表1逆转录体系和程序
4、Nlrp3的mRNA表达水平检测
根据预试结果，所有样品稀释5倍进行基因表达量测定，利用ACTB作为内参基因，其检测引物分别为：上游引物：5′-ATTGGCAATGAGCGGTTCC-3′；下游引物：5′-GGTAGTTTCGTGGATGCCACA-3′。扩增体系和条件分别如表2和表3所示。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)扩增程序按照荧光定量检测试剂盒进行操作，在Bio-rad荧光定量PCR仪上扩增。分析结果，得出各组内参基因和目的基因Ct值，运用2-△△Ct公式计算。
表2扩增体系
表3扩增条件
(二)检测结果
采用SPSS20.0统计软件进行结果的统计分析，组间比较采用最小显著性差异法(LSD)分析。结果如图1所示，心血管疾病组中Nlrp3的mRNA表达水平明显高于正常对照组(P<0.01)。由此可以确定Nlrp3的mRNA水平在心血管疾病患者血液中明显升高，可以作为心血管疾病检测的分子标志物。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州中医药大学（广州中医药研究院）
<120> 一种用于诊断心血管疾病的分子标志物Nlrp3及其应用
<130> 2018.4.9
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggagagacct ttatgagaaa gcaa 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gctgtcttcc tggcatatca ca 22

Claims (8)

1.一种用于诊断心血管疾病的试剂盒，其特征在于，包含如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂和荧光染料。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为SYBR。
4.Nlrp3的mRNA作为分子标志物在筛选或制备用于诊断心血管疾病的试剂中的用途。
5.检测Nlrp3的mRNA的试剂在制备用于诊断心血管疾病的试剂盒中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述检测Nlrp3的mRNA的试剂包括如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。
7.Nlrp3蛋白作为分子标志物在筛选或制备用于诊断心血管疾病的试剂中的用途。
8.检测Nlrp3蛋白的试剂在制备用于诊断心血管疾病的试剂盒中的用途。
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