CN107354214A - CA15‑3基因mRNA核酸检测试剂盒（PCR‑荧光探针法） - Google Patents
CA15‑3基因mRNA核酸检测试剂盒（PCR‑荧光探针法） Download PDFInfo
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Abstract
本发明为一种CA15‑3基因mRNA核酸检测试剂盒（PCR‑荧光探针法）。该试剂盒含有9种组分，分别为：红细胞裂解液（10×）、无RNA酶的水、反转录缓冲液、PCR缓冲液、逆转录酶、阳性质控品、阴性质控品、RNA提取液、2×106copies/µl参考品主要成份组成。通过对新鲜抗凝外周血总RNA的提取，逆转录（RT）将样品中的mRNA逆转录得到相应的cDNA，再利用本试剂盒特定的引物和探针，结合实时荧光定量PCR检测技术，可以准确检测样本中CA15‑3基因mRNA的表达量。此种检测方法可以对肿瘤患者的外周血及肿瘤组织等样本中的CA15‑3 mRNA的表达进行定量分析，临床上可以用以辅助诊断和评价预后的治疗效果。为原发性乳腺癌的早期诊断，转移，复发，治疗提供有效的参考依据，具有一定的临床价值。
Description
技术领域：
本发明涉及一种CA15-3基因mRNA核酸检测试剂盒在体外诊断试剂中检测CA15-3基因mRNA表达量上的应用。
背景技术：
很多文献资料表明，癌抗原15-3是一种糖蛋白，它的抗原决定簇一部分是糖，一部分是多肽。在乳腺癌患者的血清中可见CA15-3的水平明显升高，所以CA15-3的水平量大小可以作为是乳腺癌的辅助诊断指标。同时有相关临床数据表明，CA15-3作为是乳腺癌的最重要的特异性标志物，30％-50％的乳腺癌患者的CA15-3明显升高，其含量的变化与治疗效果密切相关，是乳腺癌患者诊断和监测术后复发、观察疗效的最佳指标。CA15-3动态测定有助于II期和III期乳腺癌病人治疗后复发的早期发现；当CA15-3大于100U/ml时，可认为有转移性病变。
以上检测均是对CA15-3的蛋白水平上的检测，目前蛋白检测已经成为临床通用的检测手段，但由于蛋白的表达一般在mRNA表达之后，所以蛋白指标在乳腺癌早期检测中敏感性不高，而基因检测的表达发生在蛋白表达之前，其检测在时间上更具有先进性。因此CA15-3基因mRNA表达量的测定可以更好的反应出乳腺癌病人病程中的病况检测。
TaqMan荧光定量PCR作为一种体外诊断技术，可以检测基因水平的变化，其结果可靠，重复性好，可以解决一些常规检测方法所不能解决的问题。常规的组织病理检测，可通过细胞形态学检查可直接观测到肿瘤细胞，但活检创伤大；免疫组织化学方法技术生产复杂，且需要特异性的抗体，而且假阳率高。另外由于有些肿瘤可转录特异性mRNA，但无相应蛋白合成，故蛋白检测有时可能具有延迟性，干扰临床诊断结果。荧光定量PCR可以进行mRNA量上的检测，应用范围较蛋白广泛；另外只要知道待测基因序列，即可设计合成引物探针进行逆转录及扩增，操作方便；同时该方法具有较高的灵敏度及可重复性，保证了医学检测结果的准确性。
CA15-3基因在正常乳腺组织和良性病变瘤组织中表达量很低，但在乳腺癌变组织中出现量上的异常表达，一般来说，在健康人外周血细胞中检测不到CA15-3基因mRNA，而在复发和转移的乳腺癌患者中，如果癌细胞脱落于血液中便可以检测到。应用TaqMan荧光定量PCR技术，有针对性的对乳腺癌患者外周血及肿瘤组织﹑骨髓等样本中的CA15-3基因mRNA的表达进行检测，可以对早期的乳腺癌患者血循环中的肿瘤细胞寻找，判断癌组织淋巴转移情况提供分析数据，获得较高的检测灵敏度。
发明内容：
本发明为一种CA15-3基因mRNA核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法),含有9种组分，分别为：红细胞裂解液(10×)、无RNA酶的水、反转录缓冲液、PCR缓冲液、逆转录酶、阳性质控品、阴性质控品、RNA提取液、2×106copies/μl参考品主要成份组成。
其中红细胞裂解液(10×)为Nacl，Tris-Hcl，MgCl2.6H2O配制溶液。
无RNA酶的水为DEPC-H2O。
反转录缓冲液和逆转录酶为TaKaRa宝生物反转录试剂盒配制溶液。
PCR缓冲液含有为invitrogenPCR缓冲液，检测探针，上下游引物混合液。
RNA提取液为Invitrogen Trizol原液。
2×106copies/μl参考品为含有目的片段的质粒。
检测用引物：上游引物：5’—GTTCCCCATCCCCACGTTAG—3’
下游引物：5’—AACCCACAGAAAGACCACGA—3’
荧光探针序列：5’—FAM—TTTTGCTCCCTGGCAGAT—TAMRA—3’
标准品序列(含酶切位点)：
GAATTCGTTCCCCATCCCCACGTTAGTTGTTGCCCTGAGGCTAAAACTAGAGCCCAGGGGCCCCAAGTTCCAGACTGCCCCTCCCCCCTCCCCCGGAGCCAGGGAGTGGTTGGTGAAAGGGGGAGGCCAGCTGGAGAACAAACGGGTAGTCAGGGGGTTGAGCGATTAGAGCCCTTGTACCCTACCCAGGAATGGTTGGGGAGGAGGAGGAAGAGGTAGGAGGTAGGGGAGGGGGCGGGGTTTTGTCACCTGTCACCTGCTCCGGCTGTGCCTAGGGCGGGCGGGCGGGGAGTGGGGGGACCGGTATAAAGCGGTAGGCGCCTGTGCCCGCTCCACCTCTCAAGCAGCCAGCGCCTGCCTGAATCTGTTCTGCCCCCTCCCCACCCATTTCACCACCACCATG ACACCGGGCACCCAGTCTCCTTTCTTCCTGCTGCTGCTCCTCACAGTGCTTACAGGTGAGGGGCACGAGGTGGGGAGTGGGCTGCCCTGCTTAGGTGGTCTTCGTGGTCTTTCTGTGGGTTGAATTC
质控品分为阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品为有CA15-3基因mRNA细胞裂解液样品，阴性为无CA15-3基因mRNA细胞裂解液样品。
本发明试剂盒的使用方法：每次检测应设立阳性和阴性质控。
一.实验准备
按实际需要量将红细胞裂解液用9倍体积的灭菌去离子水稀释成红细胞裂解液稀释液。
二.总RNA提取
1.待测样本处理
在50ml无菌离心管中，加入5ml新鲜抗凝血液及15ml红细胞裂解液稀释液，漩涡振荡混匀。冰浴10分钟，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，4℃，450g，离心5分钟沉淀有核细胞，倒掉含有裂解红细胞的上清液。用10ml红细胞裂解液稀释液洗涤沉淀的有核细胞，漩涡振荡以完全悬浮细胞，4℃，450g，离心5分钟，并再次倒掉上清液。用1ml红细胞裂解液稀释液重悬沉淀的有核细胞，转到无RNA酶的1.5ml EP管中，4℃，3000rpm，离心3分钟，倒掉上清液。
向细胞沉淀中加入1ml RNA提取液，上下颠倒使细胞完全裂解。-70℃保存，当到达8个测试后，再统一进行后续的测试。加入200μl氯仿，剧烈摇动15秒，冰上放置3分钟。4℃，12000g，离心15分钟。吸取500μl上清液至新的无RNA酶离心管中，注意不要吸取中间层，每管加入500μl异丙醇，反复颠倒3～5次，冰上放置10分钟。4℃，12000g，离心10分钟。倒掉Ep管中的液体，加入75％乙醇1ml，颠倒2～3次。4℃，7500g，离心5分钟，倒掉Ep管中的液体后，重复洗涤一次。倒掉管中液体，使用离心机短暂离心收集，室温下倒置5分钟，乙醇挥发之后，加入50μl的无RNA酶的水，溶解RNA，轻弹管底，促进溶解，室温溶解3分钟，冰上放置，备用。
2.质控品处理
将阳性质控品和阴性质控品从-20℃冰箱中取出，置于冰上缓慢融化，各自加入200μl氯仿，剧烈摇动15秒，冰上放置3分钟，然后按照总RNA提取步 骤进行总RNA的提取，备用。
三.RT-PCR
RNA预变性：将提取的总RNA溶液置于70℃水浴中保温5分钟，取出后迅速放置冰上，备用。将装有反转录缓冲液和逆转录酶的离心管从-20℃冰箱中取出，置于冰上待其缓慢融化后，短暂离心(1000rpm，5s～10s)，将反转录缓冲液全部转移至逆转录酶的离心管中，配制成反转录反应液，轻轻混匀，短暂离心，置于冰上备用。按表1配制反转录体系：
表1
反转录反应液 3.5μl
总RNA溶液 5.0μl
无RNA酶的水 1.5μl
反转录反应条件：37℃20分钟，95℃5分钟，样本取出置于冰上。
将装有PCR缓冲液的离心管从-20℃冰箱中取出，置于冰上待其缓慢融化后，短暂离心，置于冰上备用。在取出的若干PCR反应管中，按下列组成配制PCR反应液：
表2
反转录产物 5.0μl
PCR缓冲液 15.0μl
去离子水 5.0μl
将PCR反应管放入仪器样品槽。(仪器具体操作方法按照各自的使用说明书进行)PCR反应条件：1)50℃2分钟；2)95℃5分钟；3)95℃15秒→60℃1分钟，45个循环。
参考品的扩增
取参考品贮存液(2×106copies/μl)10μl，用去离子水梯度稀释为2×105，2×104，2×103，2×102，2×101copies/μl，连同参考品贮存液6个浓度，各取5μl为模板(其他组分同表2)同待测样本一同进行PCR扩增，以便绘制标准曲线。
阳性判断值：本试剂盒的阳性判断的临界值为102copies/ml(全血拷贝数)。
附图说明
图1为阳性参考品的扩增曲线图。
图2为20例临床病例CA15-3基因mRNA扩增曲线。
实施例1CA15-3基因mRNA核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)检测mRNA的表达
一.材料：
试剂盒组分材料来源：红细胞裂解液(10×)为Nacl，Tris-Hcl，MgCl2.6H2O配制溶液；无RNA酶的水为DEPC-H2O；反转录缓冲液和逆转录酶为TaKaRa宝生物反转录试剂盒配制溶液；PCR缓冲液为invitrogenPCR缓冲液，检测探针，引物混合液；RNA提取液为InvitrogenTrizol原液；2×106copies/μl参考品为有目的片段的质粒溶液；阳性质控品为有CA15-3基因mRNA细胞裂解液样品(阳性SK-BR-3细胞，购于上海细胞库，公司自培)；阴性为无CA15-3基因mRNA细胞裂解液样品(NKG细胞，中国科技大学生命科学院赠送，公司自培)；105阳性参考品(阳性SK-BR-3细胞，购于上海细胞库，公司自培)；普通PCR仪；ABI 7300实时荧光定量PCR仪。
二.引物和探针设计和合成：
以CA15-3基因全长cDNA序列(GenBank登录号：AC234582.3)为模板，使用ABI 7300型实时荧光定量PCR仪随机软件分析TaqMan引物和探针位点，同时考虑CA15-3基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合。引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。参考品溶液中的含目的基因的重组质粒由白奥斯生物合成。
PCR上游引物序列为：5’—GTTCCCCATCCCCACGTTAG—3’
下游引物序列为：5’—AACCCACAGAAAGACCACGA—3’
荧光探针序列为：5’—FAM—TTTTGCTCCCTGGCAGAT—TAMRA—3’
阳性参考品的扩增
取10支1.0ml/支的105copies/ml的阳性参考品，实验过程参考试剂盒的使用方法，提取总RNA后进行荧光定量扩增。阳性参考品的扩增结果如图1
经实验，上述扩增曲线与预期相符，本试剂盒可以完成含有CA15-3基因mRNA表达的检测。
实施例2 CA15-3基因mRNA核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)临床检测CA15-3基因mRNA的应用
一实验准备
实验组：10例病例诊断为乳腺癌的患者，其中确定10例临床确诊已经发生转移。对照组：10例非乳腺癌患者和健康人，其中健康人3例，乳腺炎4人，肺炎患者3。
其他实验准备材料参见实施例1材料准备
二标本检测
参照试剂盒使用方法，测定结果经仪器处理，根据标准曲线计算出检测标本的CA15-3基因mRNA的表达量，20例临床病例扩增曲线见图2。
三样品检测结果
表3 20例临床病例CA15-3基因mRNA拷贝数检测结果
实验表明：实验组10例发生转移的乳腺癌患者的外周血检测结果均为阳性，对照组健康人3例，乳腺炎4人，肺炎患者3人的外周血检测结果均为阴性。
上述结果表明本发明的试剂盒可以对CA15-3基因mRNA的表达进行较为准 确的定性和定量分析。
上游引物：5’— GTTCCCCATCCCCACGTTAG—3’
Claims (3)
1.一种CA15-3基因mRNA核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）, 含有9种组分，分别为：红细胞裂解液（10×）、无RNA酶的水、反转录缓冲液、PCR缓冲液、逆转录酶、阳性质控品、阴性质控品、RNA提取液、2×106copies/µl参考品主要成份组成。
2.试剂盒中的PCR缓冲液中含有特定的一对引物和探针：
检测用引物：上游引物：5’— GTTCCCCATCCCCACGTTAG—3’
下游引物：5’— AACCCACAGAAAGACCACGA—3’
荧光探针序列：5’—FAM—TTTTGCTCCCTGGCAGAT—TAMRA—3’
标准品序列（含酶切位点）：
GAATTCGTTCCCCATCCCCACGTTAGTTGTTGCCCTGAGGCTAAAACTAGAGCCCAGGGGCCCCAAGTTCCAGACTGCCCCTCCCCCCTCCCCCGGAGCCAGGGAGTGGTTGGTGAAAGGGGGAGGCCAGCTGGAGAACAAACGGGTAGTCAGGGGGTTGAGCGATTAGAGCCCTTGTACCCTACCCAGGAATGGTTGGGGAGGAGGAGGAAGAGGTAGGAGGTAGGGGAGGGGGCGGGGTTTTGTCACCTGTCACCTGCTCCGGCTGTGCCTAGGGCGGGCGGGCGGGGAGTGGGGGGACCGGTATAAAGCGGTAGGCGCCTGTGCCCGCTCCACCTCTCAAGCAGCCAGCGCCTGCCTGAATCTGTTCTGCCCCCTCCCCACCCATTTCACCACCACCATGACACCGGGCACCCAGTCTCCTTTCTTCCTGCTGCTGCTCCTCACAGTGCTTACAGGTGAGGGGCACGAGGTGGGGAGTGGGCTGCCCTGCTTAGGTGGTCTTCGTGGTCTTTCTGTGGGTTGAATTC。
3.一种CA15-3 基因mRNA核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法),其特征是：阳性质控品为有CA15-3 基因mRNA 细胞裂解液样品，阴性为无CA15-3 基因mRNA 细胞裂解液样品。
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|---|---|---|---|---|
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