CN109136379A - 检测样本中NonO-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒 - Google Patents

检测样本中NonO-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开用于检测样本中NonO‑TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒，其包括针对1型NonO‑TFE3的上下游引物和探针，针对2型NonO‑TFE3的上下游引物和探针，以及针对β‑actin内参基因的上下游引物和探针。本发明可快速检测样本中是否存在NonO‑TFE3融合基因及其表达量的多少。利用本发明完成的检测结果准确，灵敏，可辅助为Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者制定个体化治疗方案。

Description

检测样本中NonO-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
技术领域
本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中NonO-TFE3融合基因的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，检测人类Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者体内NonO-TFE3融合基因的表达水平。
背景技术
Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌(简称Xp11.2易位性肾癌)是2004年WHO新分类出的以Xp11.2位点上TFE3基因发生断裂，并与PRCC、ASPL、PSF、CLTC、NonO等相关基因发生平衡易位形成新的融合基因为特征的肾癌独立亚型。目前已知的基因融合类型至少有8种，但明确位点的只有5种，分别是t(X；1)(p11.2；q21)导致的PRCC-TFE3融合基因、t(X；17)(p11.2；q25)导致的ASPL-TFE3融合基因、t(X；17)(p11.2；q23)导致的CLTC-TFE3融合基因、t(X；1)(p11.2；p34)导致的PSF-TFE3融合基因以及inv(X)(p11；q12)导致的NonO-TFE3融合基因。这些融合基因似乎在mRNA剪接或有丝分裂中具有调节作用。
NonO和SFPQ都是pre-mRNA剪接因子，而PRCC也在剪接因子的复合物中发现，PRCC和CLTC都通过与MAD2B(一种促分裂复合物的调节剂)直接或间接相互作用牵涉到有丝分裂控制中。TFE3基因位于X染色体上，编码区由10个外显子组成。TFE3蛋白含有核酸激活结构域(AAD)和DNA结合结构域(bHLH；Z)，总长度为575个氨基酸。NonO基因同样位于X染色体上，编码区由13个外显子组成。NonO-TFE3融合基因由X染色体上的TFE3和NonO基因座的倒位产生，显示除易位之外的染色体重排可产生TFE3基因融合。NonO-TFE3融合基因表达产生的融合蛋白由NonO基因的部分p54nrb序列和TFE3转录因子C端部分碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)以及亮氨酸拉链组成的DNA结合结构域融合产生。在整个倒转的过程中，TFE3基因的断裂主要发生在启动子与主要功能域之间，发生倒转的包含了TFE3功能域的断裂点端粒侧的全部基因，而新的融合基因的启动子来源于与TFE3基因发生融合的启动子。在基因组内，与TFE3形成融合的ASPL、PRCC等均属于内参基因，由于其启动子的转录活性明显高于原TFE3基因启动子，使得融合后的TFE3基因表达量升高，因而肿瘤组织高表达TFE3蛋白，这种高表达的TFE3蛋白影响细胞对转录调节的干扰作用，促进肿瘤形成。
在疾病发生的早期使用针对性的靶向药物对此类疾病的治疗来说十分重要，但是由于对这类疾病缺乏足够认识，许多患者丧失最佳治疗时机。故融合基因NonO-TFE3的检测项目的开展有利于疾病的早期诊断和治疗。
目前临床上已经将NonO-TFE3融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。NonO-TFE3融合基因检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时定量PCR技术(RQ-PCR)等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯的RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。
实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR Green I染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。在Taqman技术中，RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点，因而能够满足NonO-TFE3融合基因的检测，用于评价治疗效果、预测预后。
发明内容
本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和目的基因NonO-TFE3的定量标准曲线，检测目的基因NonO-TFE3相对于内参基因β-actin的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。
本发明中的“NONO-TFE3cDNA序列”指的是NonO-TFE3融合基因经转录后产生的mRNA再经逆转录后产生的cDNA序列，或者根据这种cDNA序列通过化学合成手段直接合成出。将不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的cDNA序列插入到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。
NonO-TFE3融合基因可分为2种类型：1型NonO-TFE3，它是NonO基因的第10外显子与TFE3基因的第6外显子融合在一起；2型NonO-TFE3，它是NonO基因的第12外显子与TFE3基因的第5外显子融合在一起。
本发明提供了用于检测样本中NONO-TFE3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3；(2)针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ IDNO:4、5和6。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9。
本发明还提供了一种检测样本中NONO-TFE3融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用针对1型NONO-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的1型NONO-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3；利用针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的2型NONO-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9；
(4)根据(3)中的1型NONO-TFE3和2型NONO-TFE3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信号，确定样本中的1型NONO-TFE3和2型NONO-TFE3的相对表达量。
本发明还提供了一种检测样本中NONO-TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3；(2)针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6。
进一步地，所述引物和探针还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有NONO-TFE3cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
进一步地，所述阳性质粒包括含有1型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒。
进一步地，所述试剂盒还包括样本RNA提取试剂，所述样本RNA提取试剂包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。
进一步地，所述样本RNA提取试剂还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钠和12.5μmol/L EDTA-Na2。
本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和NonO-TFE3目的基因的定量标准曲线，检测受测者体内NonO-TFE3目的基因相对于内参基因的表达水平。相比于以往的FISH和△△CT法等检测手段，该方法具有精确度高，结果便于判读等优点。加之该方法将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该方法经测试特异性好，灵敏度高，操作简便，有助于检测Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者体内的NonO-TFE3融合基因微量残留，可为这些患者的治疗提供参考和依据，对及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、制定个体化医疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
附图说明
图1为阳性质粒扩增曲线图：(a)为PMD18-T/NONO-TFE3-1阳性质粒在不同浓度下的扩增曲线图；(b)PMD18-T/NONO-TFE3-2阳性质粒在不同浓度下的扩增曲线图。
图2为灵敏度检测结果图：(a)100copies/μL PMD18-T/NONO-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)10copies/μL PMD18-T/NONO-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(c)100copies/μLPMD18-T/NONO-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图；(d)10copies/μL PMD18-T/NONO-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图
图3为临床样本(样本2)的荧光PCR检测结果图：(a)2号血液样本的1型NONO-TFE3扩增曲线图；(b)2号血液样本的2型NONO-TFE3扩增曲线图；(c)2号肾组织样本的1型NONO-TFE3扩增曲线图；(d)2号肾组织样本的2型NONO-TFE3扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
用于检测样本中NONO-TFE3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；(2)针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ IDNO:4、5和6，如表1所示。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9，如表1所示。
用于检测样本中NONO-TFE3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)和(2)：(1)针对1型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；(2)针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6，如表1所示。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9，如表1所示。
表1.引物和探针序列
一种检测样本中NONO-TFE3融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取样本中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用针对1型NONO-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的1型NONO-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；利用针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的2型NONO-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6，如表1所示；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9，如表1所示；
(4)根据(3)中的1型NONO-TFE3和2型NONO-TFE3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信号，确定样本中的1型NONO-TFE3和2型NONO-TFE3的相对表达量。
一种检测样本中NONO-TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；(2)针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6，如表1所示。
一种检测样本中NONO-TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括(1)和(2)：(1)针对1型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3，如表1所示；(2)针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6，如表1所示。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9，如表1所示。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有NONO-TFE3cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。进一步地，阳性质粒包括含有1型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒。
所述试剂盒的检测体系PCR反应液还包括THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)(TOYOBO公司)。
所述试剂盒还包括样本提取试剂，所述样本提取试剂可选自组织RNA抽提试剂或血液RNA抽提试剂。组织RNA抽提试剂可购买自TOYOBO和QIAGEN等公司的商业化试剂盒，当然也可自行配制；血液RNA抽提试剂包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水，其中红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钠和12.5μmol/LEDTA-Na2。当然，血液RNA抽提试剂也购买自TOYOBO和QIAGEN等公司的商业化试剂盒。
所述试剂盒还包括RNA逆转录试剂，所述RNA逆转录试剂可自行配制，也可购买自TOYOBO等公司的商业化试剂盒，如TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒。
实施例2
本发明方法的操作流程：
(1)抽提血液样本中的组织RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml实施例1中的红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀，室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml实施例1中的红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中(不要吸取白色中间层)；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10～15min，加入20ulRNase-free水溶解沉淀。采用NanoDrop2000(购自ThermoScientific公司)检测制备出的RNA浓度及纯度，-30℃保存备用。
此外，也可提取肾组织样本的RNA，其制备方法为：切取组织或者刮取石蜡玻片样本于1.5ml离心管中，加入1ml组织透明液(杭州西奈山生物科技有限公司)，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，加入500ml组织透明液(杭州西奈山生物科技有限公司)，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，加入1ml无水乙醇，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，置于37℃金属浴至干燥(开盖)。加入150ul PKD buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)，振荡混匀。加入10ul PK(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)，上下颠倒混匀。在56℃金属浴15min，后80℃金属浴15min。冰上放置3min后，13200rpm离心15min，吸取上清至新的1.5ml EP管，加入DNase Booster buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)16ul和DNase1(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN)10ul振荡混匀后低速离心，室温静置15min。加入320ul RBC buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)混匀后加入720ul无水乙醇混匀。向层析柱(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)内加入700ul前一步液体，10000rpm15s，弃去管中液体，向层析柱内加入剩下液体，10000rpm 15S，弃去管中液体。向层析柱内加入500ul RPE buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)，10000rpm 15s，弃去废液。向层析柱内加入500ul RPE buffer，10000rpm 2min，弃去废液，打开盖子，全速离心5min。将层析柱置于新的1.5ml EP管，向层析柱中加入30ul DEPC水，静置2min后，全速离心1min。采用NanoDrop 2000(购自Thermo Scientific公司)检测RNA浓度及纯度，-30℃保存备用。
(2)cDNA制备：参考TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将(1)中制备出的RNA反转为cDNA。
(3)试剂配制：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装，如表2所示：
X＝23ul反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
表2 NonO-TFE3反应体系
其中Forward Primer、Reverse Primer和Taqman Probe分别选自NonO-TFE3-1-F、NonO-TFE3-1-R和NonO-TFE3-1-Probe，或者NonO-TFE3-2-F、NonO-TFE3-2-R和NonO-TFE3-2-Probe，或者β-actin-F、β-actin-R和β-actin Probe。
(4)加样：将(3)中配制的检测体系PCR反应液和步骤(2)中制备出的cDNA2μl加入到96孔板的孔或者反应管中；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(5)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和Ct值自动计算出拷贝数。
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次
验证；Ct＞38，为阴性。
实施例3阳性质粒检测和灵敏度检测
在制备阳性质粒时，可先直接合成出1型NonO-TFE3cDNA和2型NonO-TFE3cDNA，再分别插入到事先选择的质粒(这里以PMD18-T质粒为例进行说明)中，这样就制备出PMD18-T/NonO-TFE3-1阳性质粒和PMD18-T/NonO-TFE3-2阳性质粒。
以初始浓度为1×1011copies/uL的阳性质粒作为模板，按10-1、10-2……10-10比例稀释，分别作为模板进行实验，其中选择浓度为108、107、106、105、104、103、102copies/uL的模板进行实验，结果如图1所示，其中，在图1中各条扩增曲线对应的阳性质粒浓度从左至右分别为108、107、106、105、104、103、102copies/uL。由图1可知，本发明的引物和探针能够检测这两种类型的阳性质粒：PMD18-T/NonO-TFE3-1和PMD18-T/NonO-TFE3-2。
以浓度为102、10copies/μL的阳性质粒作为模板进行实验，每个浓度重复10次，检测结果如图2所示。由图2可知，当阳性质粒的浓度为102copies/μL时，这10次重复检测均能检测出，而当阳性质粒的浓度为10copies/μL时，在这10次重复中，有些能够检测出，有些不能够检测出，因此，本发明对这两种类型的阳性质粒(PMD18-T/NonO-TFE3-1和PMD18-T/NonO-TFE3-2)的检测下线均为102copies。
实施例4检测临床血液样本
取送检的血液样本10例，按实施例2和实施例3所述方法提取样本RNA、配制试剂并检测。
每份样本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测10份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。
实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样本检测的准确率。如表3所示，在阴性和阳性对照无误的情况下，检测结果显示两种NonO-TFE3融合基因类型都显示阴性结果。2号样本的检测结果如图3(a)和图3(b)所示。
表3两种NonO-TFE3融合基因类型检测结果
样本 NONO-TFE3-1(Ct值) NONO-TFE3-2(Ct值) β-actin(Ct值)
1 Undet(未检测出) Undet(未检测出) 28.11
2 Undet Undet 26.47
3 Undet Undet 27.2
4 Undet Undet 26.96
5 Undet Undet 26.87
6 Undet Undet 27.92
7 Undet Undet 29.7
8 Undet Undet 28.21
9 Undet Undet 27.75
10 Undet Undet 26.9
实施例5临床肾组织样本检测
取待检的肾组织临床样本10例，按实施例2所述方法提取样本RNA并制备cDNA、配制试剂并检测。
将2μL从每份样本制备出的cDNA加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性对照、阴性对照及空白对照，内参基因/目的基因(即NONO-TFE3)的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测10份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照，检测时间仅为100分钟。10例筛查样本中所有样本的β-actin均起线，但NONO-TFE3未有样本出现起线，即这10例临床样本为阴性样本。实验结果如下表4所示。2号样本的检测结果如图3(c)和图3(d)所示。
表4 10例临床样本NONO-TFE3mRNA表达水平
序列表
<110> 济南艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测样本中NonO-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgccacgcct tgactactgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcagcaag aagaaatgat 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acacatcaag cagattccct gacaca 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcagtcctgt ggtgcctcc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cactatgatg ccggatggaa c 21
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agctgagcat ttcatcattg taactggac 29
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgagcgaggc tacagctt 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccttgatgt cgcgcacgat tt 22
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accaccacgg ccgagcgg 18

Claims (9)

1.用于检测样本中NonO-TFE3融合基因的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型NonO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3；(2)针对2型NonO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ IDNO:4、5和6。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9。
3.一种检测样本中NonO-TFE3融合基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取样本中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用针对1型NonO-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的1型NonO-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3；利用针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针检测样本中的2型NONO-TFE3的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9；
(4)根据(3)中的1型NonO-TFE3和2型NonO-TFE3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信号，确定样本中的1型NONO-TFE3和2型NONO-TFE3的相对表达量。
4.一种检测样本中NONO-TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括(1)和(2)中的至少一种：(1)针对1型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:1、2和3；(2)针对2型NONO-TFE3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:4、5和6。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:7、8和9。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有NONO-TFE3cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒包括含有1型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本RNA提取试剂，所述样本RNA提取试剂包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述样本RNA提取试剂还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钠和12.5μmol/L EDTA-Na2。
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