CN110699454A - 检测样本中mll5基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒 - Google Patents

检测样本中mll5基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供检测样本中MLL5基因相对表达量的方法、试剂盒和寡核苷酸，均涉及检测用上游引物MLL5‑F、检测用上游引物MLL5‑R和检测用探针MLL5‑Probe，以及针对内参基因ABL的上游引物ABL‑F、下游引物ABL‑R和探针ABL‑Probe。本发明能够快速检测临床样本中MLL5基因相对表达量，可用于评价治疗效果和预测预后。

Description

检测样本中MLL5基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒
技术领域
本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中MLL5基因相对表达量的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，用于检测肿瘤患者体内MLL5基因的表达水平。
背景技术
急性髓细胞白血病(AML)是一种异质性疾病，其特征是不同的复发性细胞遗传学异常，为诊断提供最重要的预后信息。近年来，在AML中发现了FLT3、NPM1、CEBPA、IDH和WT1等多个基因的不同突变。其中的一些基因突变与细胞遗传学正常的AML的治疗结果有关，因而可作为分子指导的风险评估和分级治疗的基础。此外，对增殖、生存和分化具有重要意义的基因表达的正常调控与否也可用于预测正常核型AML患者的预后，比如MN1、BAALC、ERG和WT1。然而，大多数AML患者的预后仍不乐观，需要寻找新的危险分层和治疗靶向标志物。
MLL5基因定位于人染色体7q22区域，由25个外显子组成，表达后的蛋白含有1858个氨基酸，而在髓细胞恶性肿瘤患者的肿瘤细胞中，它通常缺失。MLL5蛋白被划分为MLL蛋白家族功能性成员之一，在结构上与MLL蛋白家族有一定相似性，均包含SET结构域的同源序列，MLL5蛋白缺少MLL蛋白家族中共有的A-T钩和甲基转移酶同源结构域，因而并不是典型的MLL蛋白家族成员。MLL5在调节造血和发育的不同方面起着重要的作用，近年来，功能分析显示MLL5参与调节造血分化和干细胞自噬。另外，根据组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)残基的组蛋白甲基转移酶活性，MLL5被证明能够促进维甲酸诱导的人早幼粒细胞形成。
Damm等人通过采用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)全面评估MLL5基因表达水平对509例重症AML患者和48例健康个体的影响，并结合其他预后分子标志物(NPMl、FLT3及CEBPA等)检测MLL5的预后价值。研究结果表明示，MLL5基因高表达的AML患者要比低表达者有更高的完全缓解率、更长的无病生存期期和更长的总生存期。此外，该研究还对采用大剂量化疗方案获得初次完全缓解后接受异体造血干细胞移植治疗的患者与无骨髓捐献者的疗效进行分析发现，MLL5基因高表达的AML患者中，行异体造血干细胞移植的AML患者的总生存期较无骨髓捐献的AML患者明显缩短；而对于MLL5基因低表达的AML患者，接受异体造血干细胞移植治疗的AML患者的总生存期似乎比无骨髓捐献者更长。
Lucena—Araujo等人对急性早幼粒细胞白血病(APL)在全反式维A酸联合蒽环类药物化疗基础上，MLL5基因表达水平对APL患者预后影响进行分析结果显示，MLL5基因低表达的APL患者的完全缓解率，2年总生存率及2年无病生存率均显著低于高表达者，且差异均有统计学意义，且MLL5基因低表达的APL患者的2年累积复发率则显著高于高表达者，提示了MLL5低表达可能预示着APL患者预后不良。
还有研究发现，MLL5基因在多种造血系统肿瘤中表达下降，如AML、急性淋巴细胞白血病(ALL)和MDS等。MLL5基因表达与细胞周期调控、DNA去甲基化的敏感程度、某些肿瘤抑制因子(比如P53和BRCA1等)的激活、血液系统的发育、造血干细胞的成熟及机体内稳态等有一定关联性。
综上研究所述，MLL5基因在AML患者中表达下调。采用相关措施使MLL5基因表达水平升高，可增加AML患者对部分化疗药物的敏感性。随着对MLL5基因表达水平与影响AML患者预后研究的深入，将为利用MLL5基因表达对AML进行危险分层、预后评估及疗效评价提供理论依据。
检测MLL5等基因表达水平的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、实时定量PCR技术(RQ-PCR)等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。在Taqman技术中，RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。
发明内容
本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因ABL和目的基因MLL5的定量标准曲线，检测目的基因MLL5相对于内参基因ABL的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够实现对MLL5基因表达水平的检测，用于评价治疗效果、预测预后。
本发明提供用于检测样本中MLL5基因相对表达量的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括检测用上游引物MLL5-F、检测用上游引物MLL5-R和检测用探针MLL5-Probe，其碱基序列如下所示：
MLL5-F：CCTTTACCAACACCAGCTACAG
MLL5-R：GTTCCACTGAAGTTGAGGCAGT
MLL5-Probe：FAM-TGAACCAGAAGTTCAATGGACTGCCTC-TAMRA。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe，其碱基序列如下所示：
ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
本发明还提供一种检测样本中MLL5基因相对表达量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，并计算MLL5基因相对表达量，步骤(3)中的荧光PCR扩增是在检测用上游引物MLL5-F、检测用上游引物MLL5-R、检测用探针MLL5-Probe以及针对内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe的存在下进行的，其碱基序列如下所述：
MLL5-F：CCTTTACCAACACCAGCTACAG
MLL5-R：GTTCCACTGAAGTTGAGGCAGT
MLL5-Probe：FAM-TGAACCAGAAGTTCAATGGACTGCCTC-TAMRA；
ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
本发明还提供一种检测样本中MLL5基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括检测用上游引物MLL5-F、检测用上游引物MLL5-R和检测用探针MLL5-Probe，其碱基序列如下所示：
MLL5-F：CCTTTACCAACACCAGCTACAG
MLL5-R：GTTCCACTGAAGTTGAGGCAGT
MLL5-Probe：FAM-TGAACCAGAAGTTCAATGGACTGCCTC-TAMRA。
进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括针对内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe，其碱基序列如下所示：
ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有MLL5 cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有MLL5cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因ABL和目的基因MLL5的定量标准曲线，检测受测者体内MLL5基因相对于内参基因的表达水平。相比于以往的免疫组化方法和现今流行的△△CT法，该方法具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于检测人类肿瘤患者体内MLL5基因微量残留，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
附图说明
图1为以MLL5阳性质粒为模板检测MLL5制成的标准曲线图。
图2为以MLL5阳性质粒为模板检测MLL5制成的标准扩增曲线图。
图3为以ABL阳性质粒为模板检测内参基因ABL制成的标准曲线图。
图4为以ABL阳性质粒为模板检测内参基因ABL制成的标准扩增曲线图。
图5为以10例正常人血液cDNA为模板检测MLL5与对应内参基因ABL的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
用于检测样本中MLL5相对表达量的核酸检测试剂盒，可用于辅助临床上人类肿瘤的早期预防、早期诊断以及预后的辅助性指标，还可对高危人群进行较为准确的筛查。该试剂盒包括：样本抽提试剂；RNA逆转录试剂：ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)；检测体系PCR反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
其中，样本抽提试剂可以提取组织或血液中的RNA。样本抽提试剂和RNA逆转录试剂可自行配制，也可购自TOYOBO公司相关试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR反应液：THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)、MLL5-F、MLL5-R、MLL5-Probe、ABL-F、ABL-R、ABL-Probe；其中引物与探针序列为：
MLL5-F：CCTTTACCAACACCAGCTACAG
MLL5-R：GTTCCACTGAAGTTGAGGCAGT
MLL5-Probe：FAM-TGAACCAGAAGTTCAATGGACTGCCTC-TAMRA
ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
所述阳性对照品分别为含有对应MLL5 cDNA序列的质粒溶液；所述阴性对照品为不含有MLL5 cDNA序列的质粒溶液；所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
实施例2
1.样本血液总RNA提取操作流程：
(1)采集抗凝新鲜血液1ml，登记好年龄、性别；
(2)在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；
(3)5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；
(4)再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；
(5)向细胞中加入0.2ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，将5管TRIzol消化液混在1管中，室温静止5min；
(6)加入0.2ml氯仿，震荡均匀；
(7)14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中(不要吸取白色中间层)；
(8)加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；
(9)14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；
(10)14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；
(11)室温干燥10-15min，加入20ulRNase-free水，从而获得提取出的血液中RNA溶液。
此外，可以在NanoDrop仪器上测定RNA浓度和纯度。
2.将RNA逆转录为cDNA
参考TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将(1)中获得的RNA逆转录为cDNA。
3.荧光定量PCR检测
(1)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各XμL，每人份23μL分装：
X＝23μL检测体系PCR反应液×(8份Abl内参基因校准品+8份目的基因校准品+n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；其中，这8份MLL5基因校准品指的是每份MLL5基因校准品具有一个不同的浓度梯度，每份MLL5基因都需要检测一次，用于绘制针对MLL5基因的标准曲线(如图1所示)和标准扩增曲线图(如图2所示)；这8份Abl内参基因校准品指的是每份Abl内参基因校准品具有一个不同的浓度梯度，每份Abl内参基因校准品都需要检测一次，用于绘制针对Abl内参基因的标准曲线(如图3所示)和标准扩增曲线图(如图4所示)。
(2)加样：加入检测体系PCR反应液中2μL cDNA；阳性对照和阴性对照直接加2μL阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μL生理盐水或不加任何物质。
(3)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃ 15s，58℃ 35sec 40个循环，荧光信号于58℃ 35sec时采集。
(4)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数，然后按照下列原则进行判断：
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)样本结果有效性判断标准：Ct<35，有效结果；Ct>36，无效结果。
实施例4
采用本发明检测试剂盒检测正常人和血液样本。
取送检的正常人和血液样本各10例，按实施例2所述方法提取RNA、进行逆转录、配制试剂并进行荧光定量PCR检测。
对每份样本而言，取2μL经逆转录产生的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性、空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测20份样本，每份样本重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。检测时间仅为100分钟。
检测结果如图5所述，以正常人血液cDNA为模板检测MLL5和内参基因ABL，图中显示Ct值均小于35，结果有效。
如表1所示，在阴性和阳性对照无误的情况下，检测结果显示MLL5基因相对表达量如下：
表1血液样本的检测结果
Figure BDA0002248503370000081
通过对10例临床样本FC(Fold Change)值(血样MLL5表达量/正常血样MLL5表达量平均值)的统计，排除异常值，得到结果显示为当血样FC值小于1时为MLL5表达降低，当FC值大于1时为MLL5表达升高。而10例临床样本的结果刚好和临床诊断标准相符，临床诊断显示1，2，3，6，8号样本是白血病样本。
序列表
<110> 北京艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 检测样本中MLL5基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctttaccaa caccagctac ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttccactga agttgaggca gt 22
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaaccagaa gttcaatgga ctgcctc 27
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatacgaagg gagggtgtac ca 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcggccagg gtgttgaa 18
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcttctgat ggcaagctct acgtctcct 29

Claims (6)

1.用于检测样本中MLL5基因相对表达量的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括检测用上游引物MLL5-F、检测用上游引物MLL5-R和检测用探针MLL5-Probe，其碱基序列如下所示：
MLL5-F：CCTTTACCAACACCAGCTACAG
MLL5-R：GTTCCACTGAAGTTGAGGCAGT
MLL5-Probe：FAM-TGAACCAGAAGTTCAATGGACTGCCTC-TAMRA。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括针对内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe，其碱基序列如下所示：
ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
3.一种检测样本中MLL5基因相对表达量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，并计算MLL5基因相对表达量，其特征在于，步骤(3)中的荧光PCR扩增是在检测用上游引物MLL5-F、检测用上游引物MLL5-R、检测用探针MLL5-Probe以及针对内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe的存在下进行的，其碱基序列如下所述：
MLL5-F：CCTTTACCAACACCAGCTACAG
MLL5-R：GTTCCACTGAAGTTGAGGCAGT
MLL5-Probe：FAM-TGAACCAGAAGTTCAATGGACTGCCTC-TAMRA；
ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
4.一种检测样本中MLL5基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括检测用上游引物MLL5-F、检测用上游引物MLL5-R和检测用探针MLL5-Probe，其碱基序列如下所示：
MLL5-F：CCTTTACCAACACCAGCTACAG
MLL5-R：GTTCCACTGAAGTTGAGGCAGT
MLL5-Probe：FAM-TGAACCAGAAGTTCAATGGACTGCCTC-TAMRA。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征还在于，所述检测体系PCR反应液还包括针对内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe，其碱基序列如下所示：
ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
6.如权利要求4～5之一所述的试剂盒，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有MLL5 cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有MLL5 cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
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