CN111118158A - 检测rbm5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒 - Google Patents

检测rbm5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111118158A
CN111118158A CN202010060742.9A CN202010060742A CN111118158A CN 111118158 A CN111118158 A CN 111118158A CN 202010060742 A CN202010060742 A CN 202010060742A CN 111118158 A CN111118158 A CN 111118158A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rbm5
actin
probe
gene
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202010060742.9A
Other languages
English (en)
Inventor
李允章
刘赵玲
王淑一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN ADICON CLINICAL LABORATORIES Inc
Original Assignee
WUHAN ADICON CLINICAL LABORATORIES Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN ADICON CLINICAL LABORATORIES Inc filed Critical WUHAN ADICON CLINICAL LABORATORIES Inc
Priority to CN202010060742.9A priority Critical patent/CN111118158A/zh
Publication of CN111118158A publication Critical patent/CN111118158A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于检测RBM5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒，均涉及检测RBM5基因表达水平的引物RBM5‑F、RBM5‑R，探针RBM5‑Probe；检测内参基因Actin的引物Actin‑F，Actin‑R，探针Actin‑Probe。该引物和探针经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。本发明可快速检测样本中存在的RBM5基因及其表达量的多少，可为肺癌患者辅助制定个体化治疗方案和疾病预后判断。

Description

检测RBM5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及一种用于检测RBM5基因相对表达量的引物、探针、方法和试剂盒，采用荧光PCR技术，用于检测肿瘤患者体内RBM5基因的表达水平。
背景技术
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，其中80％～85％的病例为肺小细胞肺癌(NSCLC)。据统计，在欧洲，每年新发病例超过20万，其中死亡人数占所有癌症相关死亡的20％。在美国，每年约有15万患者死于肺癌。在中国大陆，肺癌的发病率和病死率均呈显著升高的趋势。尽管诊断手段，外科手术、化疗药物及放疗方法不断更新、发展，但在过去的30年里肺癌的5年生存率仍然只有13％～15％。吸烟是是肺癌的一个重要的危险因子，85％肺癌患者吸烟。分子学上认为非小细胞肺癌的形成缘于致癌基因的激活及抑癌基因的失活。
人类3号染色体短臂2区1带3亚带(3p21.3)缺失是肺癌最常见的基因改变，已证实在95％的小细胞肺癌和50％～80％的非小细胞肺癌的细胞中存在该区域中的基因杂合性缺失，这个区域共有19个基因，这19个基因都在不同程度上表现出了相应的肿瘤抑制作用，RNA结合基序蛋白5(RBM5)位于这19个基因的末端。RBM5主要分布于细胞核，具有识别、结合RNA，参与机体内RNA转录、翻译、基因表达、细胞增殖以及调控细胞周期及凋亡等功能，目前研究证实，RBM5是潜在的肿瘤抑制因子。RBM5基因至少编码4种不同选择性转录体，在调节细胞凋亡，尤其是在调节肿瘤细胞凋亡中起到重要作用。针对这个基因的结构、功能、肿瘤抑制机制的研究可能有助于人们在未来开发出诊断和治疗人类肿瘤的新方法。
检测RBM5等基因表达水平的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、实时定量PCR技术(RQ-PCR)等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。在Taqman技术中，RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。
发明内容
鉴于现有技术中检测RBM5基因的不足，本发明设计了检测内参与目的基因的引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术检测RBM5两种基因相对表达量。通过调整引物和探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，可使扩增效率和速率均达到最佳。
本发明提供了用于检测样本中RBM5基因相对表达量的引物和探针，所述引物和探针包括检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe，其碱基序列如下所示：
RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAA
RBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCAT
RBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA。
优选地，所述引物和探针还包括检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe，其碱基序列如下所示：
Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Actin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Actin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
优选地，RBM5-F、RBM5-R和RBM5-Probe的摩尔比为1:1:1。
优选地，Actin-F、Actin-R和Actin-Probe的摩尔比为1:1:1。
本发明还提供了一种检测样本中RBM5基因相对表达量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，并计算RBM5基因相对表达量，步骤(3)中的荧光PCR扩增是在检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe以及检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe的存在下进行的，其碱基序列如下所述：
RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAA
RBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCAT
RBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA；
Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Actin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Actin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
本发明还提供了一种检测样本中RBM5基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe，其碱基序列如下所示：
RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAA
RBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCAT
RBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA。
优选地，所述检测体系PCR反应液还包括检测内参基因Actin的上游引物
Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe，其碱基序列如下所示：
Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Actin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Actin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
优选地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有RBM5 cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有RBM5cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便，有助于检测人类肿瘤患者体内RBM5基因微量残留，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
本发明的有益效果：(1)本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因Actin和目的基因RBM5的定量标准曲线，检测受测者体内RBM5基因相对于内参基因的表达水平；(2)相比于以往的免疫组化方法和现今流行的△△CT法，该方法具有精度高，结果便于判读等优点；(3)加之将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率；(4)使用肺癌患者血清样本检测肺癌RBM5基因相对表达量，相较于常规检验中使用组织作为检验样本更容易获得，同时更有利于早期监控肺癌的发生；(5)本发明经过统计后发现使用血清RBM5基因相对表达量指标与组织RBM5基因相对表达量指标基本一致；(6)该引物和探针经测试特异性好，灵敏度高，操作简便；(7)RBM5基因相对表达量检测可以很好地评价治疗效果，监测肺癌，尽早提示复发，具有重要的临床研究应用价值。
附图说明
图1为PUC57-T/RBM5阳性质粒起线图。
图2为PUC57-T/RBM5阳性质粒和PUC57-T/Actin阳性质粒标准曲线。
图3为以部分健康体检人群外周血cDNA为模板检测RBM5与内参基因actin的扩增曲线示意图。
图4为正常体检人群外周血RBM5目的基因表达量/Actin内参基因表达量数值分布图。
图5为肺癌患者外周血cDNA为模板检测目的基因RBM5与内参基因actin的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
用于检测样本中RBM5基因相对表达量的核酸检测试剂盒，可用于评价肺癌治疗效果，监测肺癌进展，尽早提示复发。该试剂盒包括：样本RNA抽提试剂；RNA逆转录试剂；检测体系PCR反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
其中，样本RNA抽提试剂可以提取组织或血液中的RNA。样本RNA抽提试剂和RNA逆转录试剂可自行配制，也可购自TOYOBO公司相关试剂盒等商品化试剂，比如样本RNA抽提试剂可购买天根生化科技(北京)有限公司试剂盒RNAsimple T otal RNA Kit，RNA逆转录试剂可购买自Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒(T OYOBO公司)。
检测体系PCR反应液：THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)、RBM5上下游引物各0.4μM、RBM5探针0.4μM；Actin上下游引物各0.4μM、Actin-probe(探针)0.4μM；其中引物与探针序列为：
RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAA
RBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCAT
RBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA
Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Actin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Actin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
所述阳性对照品分别为含有对应RBM5 cDNA序列的质粒溶液；所述阴性对照品为不含有RBM5 cDNA序列的质粒溶液；所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
实施例2
1.血液样本RNA的制备。利用天根生化科技(北京)有限公司的RNAsimple TotalRNA Kit进行血液样本RNA制备，制备步骤如下：
(1)直接取新鲜血液250μl，加入3倍体积RZ；
(2)将匀浆样品在15～30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
(3)4℃12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可加此步骤离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖与高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。
(4)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。
(5)4℃12000rpm离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃12000rpm离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，请分两次转入吸附柱CR3中，4℃12000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液。
(7)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD(使用前请先检查是否已加入乙醇)，4℃12000rpm离心30sec，弃废液，将CR3放入收集管中。
(8)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，4℃12000rpm离心30sec，弃废液。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱放入2ml收集管中，4℃12000rpm离心2min，去除残余液体。注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RQ-PCR等实验操作。
(11)将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加30～100μl RNase-FreeddH2O，室温放置2min，4℃12000rpm离心2min。
2.将RNA逆转录为cDNA
参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA，从而获得cDNA溶液。
3.荧光定量PCR检测
(1)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份23μl分装：X＝23μl反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照品+1份阴性对照品+1份空白对照品)；
(2)加样：对血样样本而言，往检测体系PCR反应液中加入2μl cDNA溶液；对阳性对照品和阴性对照品而言，分别往检测体系PCR反应液中加入2μl阳性对照品和阴性对照品；对空白对照品而言，往检测体系PCR反应液中加入2μl生理盐水或不加任何物质。
(3)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
(4)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和Ct值自动计算出拷贝数，然后按照下列原则进行判断：
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；Ct＞36，为阴性。
实施例3阳性质粒检测和灵敏度检测
在制备阳性质粒时，先直接合成出RBM5 cDNA和Actin cDNA，再分别将合成出的RBM5 cDNA插入到事先选择的质粒(这里以PUC57-T质粒为例进行说明)中，这样就可制备PUC57-T/RBM5阳性质粒和PUC57-T/Actin阳性质粒。将制备出的PUC57-T/RBM5阳性质粒进行梯度稀释，获得拷贝数为108、107、106、105、104、103、102、10copies/μl的阳性质粒，并以这些不同浓度的PUC57-T/RBM5阳性质粒作为模板，按实施例2进行检测，结果如图1所示。此外，将制备出的PUC57-T/Actin阳性质粒进行梯度稀释，获得拷贝数为108、107、106、105、104、103、102、10copies/μl的阳性质粒。
在图1中各条扩增曲线对应的PUC57-T/RBM5阳性质粒从左至右分别为108、107、106、105、104、103、102、101。由图1可知，不同浓度的PUC57-T/RBM5阳性质粒均能起线，这说明本发明的引物和探针检测灵敏度为10copies/μl。
随后，以不同浓度的PUC57-T/RBM5阳性质粒和PUC57-T/Actin阳性质粒对数值作为横坐标，以利用每种浓度的PUC57-T/RBM5阳性质粒和PUC57-T/Actin阳性质粒按实施例2进行检测获得的Ct值作为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。经计算可知，图2中Actin与RBM5的标准曲线的斜率在-3.58～-3.10之间，扩增效率在90％～103％之间，R2>99.8％，由此可见发现本发明对PUC57-T/RBM5阳性质粒和PUC57-T/Actin阳性质粒的扩增效率均能达到要求。
实施例4检测健康血液样本
采用本发明的方法检测健康体检人群外周血样本。
取送检的健康体检人群外周血样本20例，按实施例2所述方法提取RNA、进行逆转录、配制试剂并进行荧光定量PCR检测。
对每份样本而言，取2μL经逆转录获得的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性对照、阴性对照、空白对照各一份，内参基因与目的基因的标准曲线各两份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测16份样本，每份样本重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。检测时间仅为90分钟。
检测结果如图3所述，以正常人血液cDNA为模板检测RBM5和内参基因actin，图中显示Ct值均小于36，结果有效。
对20例健康体检人RBM5表达量/β-actin内参表达量比值进行统计(表1)，同时观察其散点分布情况(图4)，得到健康人群RBM5的表达范围为0.073～0.110。
由此得评判标准：
当RBM5/Actin<0.073时，为低表达。
当0.073<RBM5/Actin<0.110时，为中表达。
当RBM5/Actin>0.112时，为高表达。
表1 20例健康体检血液样本RBM5表达水平
Figure BDA0002374373320000081
Figure BDA0002374373320000091
实施例5检测临床血液样本
采用本发明的方法检测肺癌患者外周血样本。
取送检的肺癌患者外周血样本20例，按实施例2所述方法提取RNA、进行逆转录、配制试剂并进行荧光定量PCR检测。
对每份样本而言，取2μL经逆转录获得的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性对照、阴性对照、空白对照各一份，内参基因/目的基因的标准曲线各两份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测16份样本，每份样本重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。检测时间为90分钟。
观察Actin与RBM5基因的起线情况(图5)，统计癌症样本检测结果(表2)显示：20例患者中有15例表达量低于正常表达范围，有5例落在正常表达范围内，其中RBM5基因低于正常表达的概率为75％。
实验结果证实本发明可快速检测样本中是否存在RBM5基因及其表达量的多少。利用本发明完成的检测结果准确且灵敏，可为肺癌患者辅助制定个体化治疗方案和疾病预后判断。
表2 20例肺癌血液样本RBM5 mRNA表达水平
Figure BDA0002374373320000092
Figure BDA0002374373320000101
序列表
<110> 武汉艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测RBM5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctcagacct tcacaagcaa a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcggtctc ggtatttcat 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggacatcta tcgacgatcc aggctga 27
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatacgaagg gagggtgtac ca 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcggccagg gtgttgaa 18
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcttctgatg gcaagctcta cgtctcct 28

Claims (8)

1.用于检测样本中RBM5基因相对表达量的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe，其碱基序列如下所示：
RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAA
RBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCAT
RBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述引物和探针还包括检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe，其碱基序列如下所示：
Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Actin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Actin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，RBM5-F、RBM5-R和RBM5-Probe的摩尔比为1:1:1。
4.如权利要求2所述引物和探针，其特征在于，Actin-F、Actin-R和Actin-Probe的摩尔比为1:1:1。
5.一种检测样本中RBM5基因相对表达量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，并计算RBM5基因相对表达量，其特征在于，步骤(3)中的荧光PCR扩增是在检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe以及检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe的存在下进行的，其碱基序列如下所述：
RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAA
RBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCAT
RBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA；
Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Actin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Actin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
6.一种检测样本中RBM5基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe，其碱基序列如下所示：
RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAA
RBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCAT
RBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征还在于，所述检测体系PCR反应液还包括检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe，其碱基序列如下所示：
Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Actin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Actin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
8.如权利要求6～7之一所述的试剂盒，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有RBM5 cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有RBM5 cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
CN202010060742.9A 2020-01-19 2020-01-19 检测rbm5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒 Withdrawn CN111118158A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010060742.9A CN111118158A (zh) 2020-01-19 2020-01-19 检测rbm5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010060742.9A CN111118158A (zh) 2020-01-19 2020-01-19 检测rbm5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111118158A true CN111118158A (zh) 2020-05-08

Family

ID=70491104

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010060742.9A Withdrawn CN111118158A (zh) 2020-01-19 2020-01-19 检测rbm5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111118158A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112266959A (zh) * 2020-10-19 2021-01-26 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 一种定量检测样品中mTOR mRNA相对表达量的试剂及检测方法
CN112609001A (zh) * 2021-01-11 2021-04-06 福州艾迪康医学检验所有限公司 检测tp63-ntrk2融合基因及其相对表达水平的引物、探针和方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112266959A (zh) * 2020-10-19 2021-01-26 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 一种定量检测样品中mTOR mRNA相对表达量的试剂及检测方法
CN112609001A (zh) * 2021-01-11 2021-04-06 福州艾迪康医学检验所有限公司 检测tp63-ntrk2融合基因及其相对表达水平的引物、探针和方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106119393B (zh) 一种与食管鳞癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
CN114150066B (zh) 外泌体cda、hmgn1等在肺癌诊断中的应用
CN111118158A (zh) 检测rbm5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒
CN108866187B (zh) 一种与肺癌辅助诊断相关的长链非编码rna标志物及其应用
CN110699454A (zh) 检测样本中mll5基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒
CN105648075A (zh) 一种肝癌诊断组合及含有该组合的试剂盒
CN111424085B (zh) tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用
CN105671179B (zh) 血清microRNA在肝癌诊断中的应用及诊断试剂盒
CN107164531A (zh) 一种肺癌筛查相关的血清LncRNA标志物及其应用
CN117106919B (zh) 外泌体miRNA组合在早期肺癌检测中的应用
CN115058514A (zh) 检测环状rna和/或所述环状rna表达量的制剂在制备结直肠癌诊断试剂中的应用
CN117448452A (zh) 一种肝细胞肝癌（hcc）的检测分子标志物及其应用
CN117660653A (zh) 一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒
CN113481301A (zh) 检测样本中laptm4b基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20200508