CN109371126A - 检测样本中tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于筛查和鉴定样本中TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒，其包括用于筛查和鉴定ASPL‑TFE3、PRCC‑TFE3、NonO‑TFE3、PSF‑TFE3和CLTC‑TFE3的上下游引物和探针，以及针对β‑actin内参基因的上下游引物和探针。本发明可快速检测样本中是否存在TFE3融合基因及其表达量的多少。利用本发明完成的检测结果准确且灵敏，可为人类Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者辅助制定个体化治疗方案。

Description

检测样本中TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
技术领域
本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中PTFE3融合基因的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，检测人类Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者体内TFE3融合基因的表达水平。
背景技术
Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌(简称Xp11.2易位性肾癌)是2004年WHO新分类出的一种肾癌独立亚型，临床罕见，恶性程度较高。Xp11.2易位性肾癌的特征为Xp11.2位点上TFE3基因发生断裂，并与PRCC、ASPL、PSF、CLTC、NonO等相关基因发生平衡易位形成新的融合基因。据统计，Xp11.2易位性肾癌的发病率在儿童肾癌患者中约占1/3，占45岁以下肾癌的15％，对儿童及青少年患者有极大影响。Xp11.2易位性肾癌在分子遗传学、治疗和预后等方面明显不同于其他肾细胞癌，目前国内对该类型肾细胞癌认识还很有限。
Xp11.2易位性肾癌主要发生于青少年人群，约占儿童肾癌的1/3，45岁以下肾癌中的15％，成年肾癌的1.6％左右。最新数据统计分析显示，我国肾癌总体发病率为3.35/10万。
Xp11.2易位性肾癌所涉及的融合基因至少有8种，但明确位点的目前只有5种，分别为t(x；17)(p11.2；q25)染色体易位，形成ASPL-TFE3融合基因；t(x；1)(p11.2；q21)染色体易位，形成PRCC-TFE3融合基因；inv(x)(p11；q12)染色体易位，形成NonO-TFE3融合基因；t(x；1)(p11.2；p34)染色体易位，形成PSF-TFE3融合基因；t(x；17)(p11.2；q23)染色体易位，形成CLTC-TFE3融合基因。t(x；3)(p11.2；q23)融合型肾癌、t(x；10)(p11.2；q23)融合型肾癌及t(x；19)(p11.2；q13.1)融合型肾癌尚未明确染色体易位位点。每例Xp11.2肾细胞癌仅有单一的易位形式。
Xp11.2易位性肾癌具有特征性的基因改变，其诊断、治疗以及预后亦有特殊之处，而其组织形态与肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌较为相似，常规诊断极易误诊和漏诊。因此，检测5种TFE3融合基因(ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、NonO-TFE3、PSF-TFE3和CLTC-TFE3)对Xp11.2易位性肾癌的分类诊断及个体化治疗均有重要意义。
目前临床上已经将TFE3融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。TFE3融合基因检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、实时定量PCR技术(RQ-PCR)等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR Green I染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。在Taqman技术中，RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。
发明内容
本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和检测TFE3融合基因(ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、NonO-TFE3、PSF-TFE3和CLTC-TFE3)的定量标准曲线，检测目的基因TFE3融合基因相对于内参基因β-actin的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够满足TFE3融合基因的检测，用于评价治疗效果、预测预后。
本发明中的“TFE3融合基因cDNA序列”指的是ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、NonO-TFE3、PSF-TFE3和CLTC-TFE3融合基因分别经转录后产生的mRNA经逆转录后产生的cDNA序列，或者分别根据这5种融合基因对应的cDNA序列通过化学合成手段直接合成出。将不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的TFE3融合基因cDNA序列插入到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。
本发明提供用于筛查样本中TFE3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括如SEQID NO:1～18所述的引物和探针。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:19～21。
本发明还提供用于鉴定样本中TFE3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括：(1)用于鉴定1型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:7、8和10；(2)用于鉴定2型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:7、9和10；(3)用于鉴定3型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1、11和3；(4)用于鉴定4型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、12和6；(5)用于鉴定1型ASPL-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、17和6；(6)用于鉴定2型ASPL-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ IDNO:1、18和3；(7)用于鉴定1型NonO-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、13和6；(8)用于鉴定2型NonO-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:14、15和3；(9)用于鉴定1型PSF-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1、2和3；(10)用于鉴定2型PSF-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、5和6；(11)用于鉴定CLTC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、16和6。
进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:19～21。
本发明还提供一种检测样本中TFE3融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，进行TFE3融合基因的筛查；(4)若根据步骤(3)的初步筛查结果，确定所述样本不存在TFE3融合基因，则检测结束；若根据步骤(3)的初步筛查，确定所述样本存在TFE3融合基因，则再通过荧光PCR扩增确定TFE3融合基因的具体类型，其中用于步骤(3)中的荧光PCR扩增的引物和探针的碱基序列为SEQ ID NO:1～21。
本发明还提供一种筛查样本中TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括用于筛查样本中TFE3融合基因的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1～18。
本发明还提供一种鉴定样本中TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，所述检测体系PCR反应液包括用于鉴定样本中TFE3融合基因的引物和探针，其包括：(1)用于鉴定1型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:7、8和10；(2)用于鉴定2型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:7、9和10；(3)用于鉴定3型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1、11和3；(4)用于鉴定4型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、12和6；(5)用于鉴定1型ASPL-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、17和6；(6)用于鉴定2型ASPL-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1、18和3；(7)用于鉴定1型NonO-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ IDNO:4、13和6；(8)用于鉴定2型NonO-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:14、15和3；(9)用于鉴定1型PSF-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1、2和3；(10)用于鉴定2型PSF-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、5和6；(11)用于鉴定CLTC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、16和6。
进一步地，所述引物和探针还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:19、20和21。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有TFE3融合基因cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有TFE3融合基因cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
进一步地，所述阳性质粒包括含有1型PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒、含有2型PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒、含有3型PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有4型PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒；含有1型ASPL-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型ASPL-TFE3cDNA序列的阳性质粒；含有1型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒；含有1型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒；含有CLTC-TFE3cDNA序列的阳性质粒。
进一步地，所述试剂盒还包括样本RNA提取试剂，所述样本RNA提取试剂包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。
进一步地，所述样本RNA提取试剂还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钠和12.5μmol/L EDTA-Na2。
进一步地，所述试剂盒的检测体系PCR反应液还包括THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)(TOYOBO公司)。
进一步地，所述试剂盒还包括样本提取试剂，所述样本提取试剂可选自组织RNA抽提试剂或血液RNA抽提试剂。组织RNA抽提试剂可购买自TOYOBO和QIAGEN等公司的商业化试剂盒，当然也可自行配制；血液RNA抽提试剂包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水，其中红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钠和12.5μmol/L EDTA-Na2。当然，血液RNA抽提试剂也购买自TOYOBO和QIAGEN等公司的商业化试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括RNA逆转录试剂，所述RNA逆转录试剂可自行配制，也可购买自TOYOBO等公司的商业化试剂盒，如TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒。
本发明的有益效果：将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和目的基因TFE3融合基因的定量标准曲线，检测受测者体内TFE3融合基因的表达。相比于以往的FISH和△△CT法等检测手段，该方法具有精确度高，结果便于判读等优点。加之该方法将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该方法经测试特异性好，灵敏度高，操作简便，可为人类Xp11.2易位/TFE3融合基因相关性肾癌患者的治疗提供参考和依据，有助于个体化医疗方案的制定。
此外，在5种TFE3融合基因中，根据TFE3基因的断裂位点的不同，ASPL-TFE3可分为2种类型：1型ASPL-TFE3(ASPL氨基末端的273氨基酸与TFE3羧基末端的280氨基酸融合)和2型ASPL-TFE3(ASPL氨基末端的273氨基酸分别与TFE3羧基末端的315氨基酸融合)；NonO-TFE3融合基因可分为2种类型：1型NonO-TFE3(NonO基因的第10外显子与TFE3基因的第6外显子融合在一起)和2型NonO-TFE3(NonO基因的第12外显子与TFE3基因的第5外显子融合在一起)；PSF-TFE3融合基因目前主要发现两种融合形式：1型PSF-TFE3(PSF基因的第9外显子与TFE3基因的第5外显子融合在一起)和2型PSF-TFE3(PSF基因的第9外显子与TFE3基因的第6外显子融合在一起)；PRCC-TFE3融合基因可分为4种不同的类型：1型PRCC-TFE3、2型PRCC-TFE3、3型PRCC-TFE3和4型PRCC-TFE3，以及这5种TFE3融合基因的序列特征，让1型PSF-TFE3、3型PRCC-TFE3和2型ASPL-TFE3共用一条上游引物，让2型PSF-TFE3、4型PRCC-TFE3、1型NonO-TFE3、1型ASPL-TFE3和CLTC-TFE3共用一条上游引物，让1型PRCC-TFE3和2型PRCC-TFE3共用一条上游引物，让1型PSF-TFE3、3型PRCC-TFE3、2型NonO-TFE3和2型ASPL-TFE3共用同一条探针，让2型PSF-TFE3、4型PRCC-TFE3、1型NonO-TFE3、CLTC-TFE3和1型ASPL-TFE3共用一条探针，让1型PRCC-TFE3和2型PRCC-TFE3共用一条探针，这样就可显著减少引物和探针的使用数量，从而降低检测成本。鉴于Xp11.2易位性肾癌发病率比较低(最新数据统计分析显示，我国肾癌总体发病率为3.35/10万，而Xp11.2易位性肾癌仅占肾癌病例总数的一小部分)，在大规模盲选(检测1000例随机获取的临床样本时，Xp11.2易位性肾癌样本很可能1例都没有)时，可事先通过单管检测判断是否存在这5种TFE3融合基因中的至少一种(即初始筛选)，若存在，再分别针对每种TFE3融合基因进行检测，就可判断存在哪种或哪些TFE3融合基因(即鉴定)，这样就不用从一开始就对每种TFE3融合基因分别进行检测，从而大量节约引物和探针等试剂的使用量，大幅降低检测成本。
附图说明
图1为阳性质粒扩增曲线图：(a)PMD18-T/PRCC-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)PMD18-T/PRCC-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图；(c)PMD18-T/PRCC-TFE3-3阳性质粒扩增曲线图；(d)PMD18-T/PRCC-TFE3-4阳性质粒扩增曲线图。
图2为灵敏度检测结果图：(a)100copies/μL PMD18-T/PRCC-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)100copies/μL PMD18-T/PRCC-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图；(c)100copies/μLPMD18-T/PRCC-TFE3-3阳性质粒扩增曲线图；(d)100copies/μL PMD18-T/PRCC-TFE3-4阳性质粒扩增曲线图。
图3为阳性质粒扩增曲线图：(a)为PMD18-T/ASPL-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)PMD18-T/ASPL-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图。
图4为灵敏度检测结果图：(a)100copies/μL PMD18-T/ASPL-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)100copies/μL PMD18-T/ASPL-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图。
图5为阳性质粒扩增曲线图：(a)为PMD18-T/NONO-TFE3-1阳性质粒在不同浓度下的扩增曲线图；(b)PMD18-T/NONO-TFE3-2阳性质粒在不同浓度下的扩增曲线图。
图6为灵敏度检测结果图：(a)100copies/μL PMD18-T/NONO-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)10copies/μL PMD18-T/NONO-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(c)100copies/μLPMD18-T/NONO-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图；(d)10copies/μL PMD18-T/NONO-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图
图7为阳性质粒扩增曲线图：(a)为PMD18-T/PSF-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)PMD18-T/PSF-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图。
图8为灵敏度检测结果图：(a)100copies/μL PMD18-T/PSF-TFE3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)100copies/μL PMD18-T/PSF-TFE3-2阳性质粒扩增曲线图。
图9为PMD18-T/CLTC-TFE3阳性质粒在不同浓度下的扩增曲线图。
图10为PMD18-T/CLTC-TFE3阳性质粒作为标准品在不同浓度下制成的标准图。
图11为100copies/μL PMD18-T/CLTC-TFE3阳性质粒的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
TFE3融合基因(ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、NonO-TFE3、PSF-TFE3和CLTC-TFE3)本发明所使用的引物和探针SEQ ID NO:1～21的碱基序列如表1所示。
表1.引物和探针的序列
实施例2
本发明方法的操作流程：
(1)抽提血液样本中的组织RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml实施例1中的红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀，室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml实施例1中的红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中(不要吸取白色中间层)；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10～15min，加入20ulRNase-free水溶解沉淀。采用NanoDrop2000(购自ThermoScientific公司)检测制备出的RNA浓度及纯度，-30℃保存备用。
此外，也可提取肾组织样本的RNA，其制备方法为：切取组织或者刮取石蜡玻片样本于1.5ml离心管中，加入1ml组织透明液(杭州西奈山生物科技有限公司)，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，加入500ml组织透明液(杭州西奈山生物科技有限公司)，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，加入1ml无水乙醇，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，置于37℃金属浴至干燥(开盖)。加入150ul PKD buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)，振荡混匀。加入10ul PK(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)，上下颠倒混匀。在56℃金属浴15min，后80℃金属浴15min。冰上放置3min后，13200rpm离心15min，吸取上清至新的1.5ml EP管，加入DNase Booster buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)16ul和DNase1(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN)10ul振荡混匀后低速离心，室温静置15min。加入320ul RBC buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)混匀后加入720ul无水乙醇混匀。向层析柱(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)内加入700ul前一步液体，10000rpm15s，弃去管中液体，向层析柱内加入剩下液体，10000rpm 15S，弃去管中液体。向层析柱内加入500ul RPE buffer(来自RNeasy FFPE KIT，QIAGEN公司)，10000rpm 15s，弃去废液。向层析柱内加入500ul RPE buffer，10000rpm 2min，弃去废液，打开盖子，全速离心5min。将层析柱置于新的1.5ml EP管，向层析柱中加入30ul DEPC水，静置2min后，全速离心1min。采用NanoDrop 2000(购自Thermo Scientific公司)检测RNA浓度及纯度，-30℃保存备用。
(2)cDNA制备：参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将(1)中制备出的RNA反转为cDNA。
(3)试剂配制：按检测人份数配制检测体系PCR反应液各XμL，每人份23μL分装，如表2所示：
X＝23μL反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
表2PRCC-TFE3反应体系
其中当分别检测时，Forward Primer、Reverse Primer和Taqman Probe分别选自PRCC-TFE3-1/2-F、PRCC-TFE3-1-R和PRCC-TFE3-1/2-Probe，或者PRCC-TFE3-1/2-F、PRCC-TFE3-2-R和PRCC-TFE3-1/2-Probe，或者PRCC-TFE3-3-F、PRCC-TFE3-3-R和PRCC-TFE3-3-Probe，或者PRCC-TFE3-4-F、PRCC-TFE3-4-R和PRCC-TFE3-4-Probe，或者CLTC-TFE3-F、CLTC-TFE3-R和CLTC-TFE3-Probe，或者NonO-TFE3-1-F、NonO-TFE3-1-R和NonO-TFE3-1-Probe，或者NonO-TFE3-2-F、NonO-TFE3-2-R和NonO-TFE3-2-Probe，或者PSF-TFE3-1-F、PSF-TFE3-1-R和PSF-TFE3-1-Probe，或者PSF-TFE3-2-F、PSF-TFE3-2-R和PSF-TFE3-2-Probe，或者ASPL-TFE3-1-F、ASPL-TFE3-1-R和ASPL-TFE3-1-Probe，或者ASPL-TFE3-2-F、ASPL-TFE3-2-R和ASPL-TFE3-2-Probe，或者β-actin-F、β-actin-R和β-actin-Probe；当单管检测时，Forward Primer、Reverse Primer和Taqman Probe指的是表1中的所有引物和探针，每条上游引物取0.8ul(10uM)、每条下游引物取0.8ul(10uM)和每条探针取0.6ul(10uM)，THUNDERBIRD Probe qPCR Mix用量为12.5ul，ROX Reference Dye(50*)用量为5ul，通过添加RNase-free H2O的用量，确保反应总体积为50ul。
(4)加样：将(3)中配制的检测体系PCR反应液和步骤(2)中制备出的cDNA2μl加入到96孔板的孔或者反应管中；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(5)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和Ct值自动计算出拷贝数。
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次
验证；Ct＞38，为阴性。
实施例3阳性质粒检测和灵敏度检测
在制备阳性质粒时，可先直接合成出1型PRCC-TFE3cDNA、2型PRCC-TFE3cDNA、3型PRCC-TFE3cDNA和4型PRCC-TFE3cDNA，再分别插入到事先选择的质粒(这里以PMD18-T质粒为例进行说明)中，这样就可制备出PMD18-T/PRCC-TFE3-1阳性质粒、PMD18-T/PRCC-TFE3-2阳性质粒、PMD18-T/PRCC-TFE3-3阳性质粒和PMD18-T/PRCC-TFE3-4阳性质粒。当也可事先从阳性样本中分离出每种类型PRCC-TFE3的mRNA，经逆转录后产生cDNA，再将所产生的cDNA添加到质粒中，也可制备出所需的阳性质粒。分别以106copies/μL浓度的阳性质粒PMD18-T/PRCC-TFE3-1、PMD18-T/PRCC-TFE3-2、PMD18-T/PRCC-TFE3-3和PMD18-T/PRCC-TFE3-4作为模板，结果如图1所示，PRCC-TFE3(1型PRCC-TFE3、2型PRCC-TFE3、3型PRCC-TFE3和4型PRCC-TFE3)和β-actin均起线，本发明的引物和探针可用来检测阳性质粒，说明本发明可以检测这4种类型的阳性质粒。以质粒浓度为103、102、10copies/μL作为模板进行实验，每个浓度重复10次，结果如图2所示。由图2可知，100copies/μL的质粒都能全部出现扩增，而10copies/μL的质粒未能全部出现扩增，因此本发明对这4种类型的阳性质粒的检测下限均为100copies。
类似地，针对1型ASPL-TFE3和2型ASPL-TFE3，也制备出PMD18-T/ASPL-TFE3-1阳性质粒和PMD18-T/ASPL-TFE3-2阳性质粒。分别以106copies/μL浓度的阳性质粒PMD18-T/ASPL-TFE3-1和PMD18-T/ASPL-TFE3-2作为模板，结果如图3所示，ASPL-TFE3和β-actin均起线，本发明的引物和探针可用来检测阳性质粒，说明本发明可以检测这两种类型的阳性质粒。以质粒浓度为103、102、10copies/μL作为模板进行实验，每个浓度重复10次，结果发现这两种类型的阳性质粒的检测下线均为100copies，结果如图4。
类似地，针对1型NonO-TFE3和2型NonO-TFE3，也制备出PMD18-T/NonO-TFE3-1阳性质粒和PMD18-T/NonO-TFE3-2阳性质粒。以初始浓度为1×1011copies/uL的阳性质粒作为模板，按10-1、10-2……10-10比例稀释，分别作为模板进行实验，其中选择浓度为108、107、106、105、104、103、102copies/uL的模板进行实验，结果如图5所示，其中，在图5中各条扩增曲线对应的阳性质粒浓度从左至右分别为108、107、106、105、104、103、102copies/uL。由图5可知，本发明的引物和探针能够检测这两种类型的阳性质粒：PMD18-T/NonO-TFE3-1和PMD18-T/NonO-TFE3-2。以浓度为102、10copies/μL的阳性质粒作为模板进行实验，每个浓度重复10次，检测结果如图6所示。由图6可知，当阳性质粒的浓度为102copies/μL时，这10次重复检测均能检测出，而当阳性质粒的浓度为10copies/μL时，在这10次重复中，有些能够检测出，有些不能够检测出，因此，本发明对这两种类型的阳性质粒(PMD18-T/NonO-TFE3-1和PMD18-T/NonO-TFE3-2)的检测下线均为102copies。
类似地，针对1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3，也制备出PMD18-T/PSF-TFE3-1阳性质粒和PMD18-T/PSF-TFE3-2阳性质粒。以浓度106copies/μL的阳性质粒(PMD18-T/PSF-TFE3-1和PMD18-T/PSF-TFE3-2)作为模板，结果如图7所示，PSF-TFE3-1、PSF-TFE3-2和β-actin均起线，说明本发明的引物和探针可用来检测阳性质粒。以质粒浓度为103、102、10copies/μL作为模板进行实验，每个浓度重复10次，结果发现本发明对这两种阳性质粒(PMD18-T/PSF-TFE3-1和PMD18-T/PSF-TFE3-2)的检测下限均为100copies，结果如图8。
类似地，针对CLTC-TFE3，也制备出PMD18-T/CLTC-TFE3阳性质粒。将制备出的PMD18-T/CLTC-TFE3阳性质粒进行梯度稀释，获得拷贝数为108、107、106、105、104、103、102copies/μl的阳性质粒，并以这些不同浓度的阳性质粒作为模板，按实施例2进行检测，结果如图9所示，其中，在图9中各条扩增曲线对应的阳性质粒浓度从左至右分别为108、107、106、105、104、103、102copies/uL。由图9可知，CLTC-TFE3和β-actin均起线，本发明的引物和探针可用来检测PMD18-T/CLTC-TFE3阳性质粒。随后，以不同浓度的阳性质粒对数值作为横坐标，以通过每种浓度的阳性质粒按实施例2进行检测获得的Ct值作为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图10所示。经计算可知，图10中的标准曲线的斜率为-3.51，扩增效率为92.75％，由此可见发现本发明对阳性质粒的扩增效率能达到要求。将102、101、100copies/μl的PMD18-T/CLTC-TFE3阳性质粒按实施例2进行检测，每种不同浓度的阳性质粒重复检测10次，结果如图11所示，由图11可知，本发明对这种阳性质粒的检测下限为100copies。
实施例4检测健康体检人群外周血样本
取待检的健康体检外周血样本10例，按实施例2所述方提取RNA、法制备cDNA、配制试剂并检测。
每份样本加入检测体系PCR反应液中2μL。同时做阳性，阴性及空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测10份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照，检测时间仅为100分钟。10例筛查样本中所有样本的β-actin均起线，但是对4种类型的PRCC-TFE3(1型PRCC-TFE3、2型PRCC-TFE3、3型PRCC-TFE3和4型PRCC-TFE3)、两种类型的ASPL-TFE3(1型ASPL-TFE3和2型ASPL-TFE3)、两种类型的NonO-TFE3(1型NonO-TFE3和2型NonO-TFE3)、两种类型的PSF-TFE3(1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3)和CLTC-TFE3而言，未有样本出现起线。
实施例5检测肾组织临床样本
取待检的临床样本10例，按实施例2所述方法提取RNA并制备cDNA、配制试剂并检测。
每份样本加入检测体系PCR反应液中2μL。同时做阳性，阴性及空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测10份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照，检测时间仅为100分钟。10例筛查样本中所有样本的β-actin均起线，但是对4种类型的PRCC-TFE3(1型PRCC-TFE3、2型PRCC-TFE3、3型PRCC-TFE3和4型PRCC-TFE3)、两种类型的ASPL-TFE3(1型ASPL-TFE3和2型ASPL-TFE3)、两种类型的NonO-TFE3(1型NonO-TFE3和2型NonO-TFE3)、两种类型的PSF-TFE3(1型PSF-TFE3和2型PSF-TFE3)和CLTC-TFE3而言，未有样本出现起线。
序列表
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测样本中TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcctgtgg tgcctccg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagcaacca tgagtggttc 20
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctgagcat ttcatcattg taactggac 29
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgccacgcct tgactactgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccaccagca accatgagtg 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acacatcaag cagattccct gacaca 26
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgagtgtgg tggacaggta 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccccagatg cctccttc 18
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggattatt acagtggtgg ctac 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgttgggttc tccagatggg tct 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggaaagagc ccgtgaagat 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaggaagat gaacccacaa ag 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggcagcaag aagaaatgat 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcagtcctgt ggtgcctcc 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cactatgatg ccggatggaa c 21
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccaatgtga tctggaactt attaa 25
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gccaaagaag tccaagtcgg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cctccaagcc aaagaagtcc 20
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgagcgaggc tacagctt 18
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tccttgatgt cgcgcacgat tt 22
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
accaccacgg ccgagcgg 18

Claims (10)

1.用于筛查样本中TFE3融合基因的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括如SEQID NO:1～18所述的引物和探针。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:19～21。
3.用于鉴定样本中TFE3融合基因的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括：(1)用于鉴定1型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:7、8和10；(2)用于鉴定2型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:7、9和10；(3)用于鉴定3型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1、11和3；(4)用于鉴定4型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、12和6；(5)用于鉴定1型ASPL-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、17和6；(6)用于鉴定2型ASPL-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ IDNO:1、18和3；(7)用于鉴定1型NonO-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、13和6；(8)用于鉴定2型NonO-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:14、15和3；(9)用于鉴定1型PSF-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ IDNO:1、2和3；(10)用于鉴定2型PSF-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ IDNO:4、5和6；(11)用于鉴定CLTC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、16和6。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:19～21。
5.一种检测样本中TFE3融合基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，进行TFE3融合基因的筛查；(4)若根据步骤(3)的初步筛查结果，确定所述样本不存在TFE3融合基因，则检测结束；若根据步骤(3)的初步筛查，确定所述样本存在TFE3融合基因，则再通过荧光PCR扩增确定TFE3融合基因的具体类型，其中用于步骤(3)中的荧光PCR扩增的引物和探针的碱基序列为SEQ ID NO:1～21。
6.一种筛查样本中TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括用于筛查样本中TFE3融合基因的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1～18。
7.一种鉴定样本中TFE3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括用于鉴定样本中TFE3融合基因的引物和探针，其包括：(1)用于鉴定1型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:7、8和10；(2)用于鉴定2型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:7、9和10；(3)用于鉴定3型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1、11和3；(4)用于鉴定4型PRCC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、12和6；(5)用于鉴定1型ASPL-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、17和6；(6)用于鉴定2型ASPL-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1、18和3；(7)用于鉴定1型NonO-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ IDNO:4、13和6；(8)用于鉴定2型NonO-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:14、15和3；(9)用于鉴定1型PSF-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:1、2和3；(10)用于鉴定2型PSF-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、5和6；(11)用于鉴定CLTC-TFE3的引物和探针，其碱基序列为SEQ ID NO:4、16和6。
8.根据权利要求6～7之一所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为SEQ ID NO:19、20和21。
9.根据权利要求6～7之一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有TFE3融合基因cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有TFE3融合基因cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒包括含有1型PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒、含有2型PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒、含有3型PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有4型PRCC-TFE3cDNA序列的阳性质粒；含有1型ASPL-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型ASPL-TFE3cDNA序列的阳性质粒；含有1型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型NONO-TFE3cDNA序列的阳性质粒；含有1型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒和含有2型PSF-TFE3cDNA序列的阳性质粒；含有CLTC-TFE3cDNA序列的阳性质粒。
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