CN113186295A - 一种TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒，包括荧光定量PCR引物和探针、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为TM4SF1基因阳性对照为表达TM4SF1基因的肿瘤细胞系，所述阴性对照为无菌水，所述荧光定量PCR引物和探针包括组分1和组分2，所述组分1包括用于扩增TM4SF1基因的上游引物F1和下游引物R1、用于扩增对照基因GADPH的上游引物F2和下游引物R2，所述组分2包括用于检测TM4SF1基因的探针Probe1和用于检测对照基因GADPH的探针Probe2。本发明的优点在于样本来源简单，操作简单，并且因为外周血样本获取简便，对病人的伤害小，更易于在病人的每个病程中获取，从而能够实现动态检测肿瘤状态，准确了解病人的病情。
Description
技术领域
本发明涉及mRNA核酸检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒和检测方法。
背景技术
TM4SF1(Transmembrane 4L six family member 1)是一种低分子量糖蛋白，相对分子量约为21KDa～28KDa，1992年由Marken克隆并鉴定，全长为202氨基酸，编码TM4SF1的基因位于人3号染色体(3q21-3q25)。TM4SF1具有四个跨膜结构域的表面蛋白，是四次跨膜蛋白超家族(TM4SFs)的一员，又称为肿瘤相关抗原L6(tumor associated antigen L6，TAL6)。作为一个“肿瘤特异性”的抗原，在卵巢癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌等多种上皮性恶性肿瘤以及肿瘤血管内皮细胞高表达，在正常组织中低表达或不表达，具有调控血管内皮细胞的功能，与肿瘤病理血管的生成相关，调控肿瘤细胞的生长、黏附、侵袭、转移，并参与肿瘤细胞新陈代谢及微环境的形成，且在肿瘤干细胞的自我更新中扮演着非常重要的角色，是一个非常有潜力的抗肿瘤治疗靶点。因其在癌细胞中选择性表达的特性而受到广泛关注。
临床研究表明，TM4SF1表达水平检测对癌症患者接受抗肿瘤治疗具有明显的指导意义。因此，对TM4SF1表达量准确、定量地检测，有利于临床医生及时、准确、合理的制定个体化治疗方案。
另外，目前应用较广的核酸检测技术为以荧光标记探针为基础的实时荧光定量PCR技术。该检测过程主要为：在PCR扩增体系中，在加入一对引物的同时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，该探针包含5’端报告荧光基团和3’端淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而基于免疫组织化学技术的蛋白检测技术，存在肿瘤组织样本难以获取、有创、无法实时动态监测等问题。
因此发明人对外周血样本进行荧光定量PCR检测，可以更加快速检测TM4SF1mRNA的表达量，便于临床医生合理评估和筛选患者进行抗肿瘤治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测TM4SF1的表达量，能够定量、标准化检测mRNA的检测盒和检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
一种TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒，包括荧光定量PCR引物和探针、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为TM4SF1基因阳性对照为表达TM4SF1基因的肿瘤细胞系，所述阴性对照为无菌水，所述荧光定量PCR引物和探针包括组分1和组分2，所述组分1：包括用于扩增TM4SF1基因的上游引物F1和下游引物R1、用于扩增对照基因GADPH的上游引物F2和下游引物R2，上述4条引物的核苷酸序列分别为：
F1：5’-CCGCTTCGTGTGGTTCTTT-3’
R1：5’-CCAGCCCAATGAAGACAAATG-3’
F2：5’-ATTCCACCCATGGCAAATTC-3’
R2：5’-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’；
所述组分2：包括用于检测TM4SF1基因的探针Probe1和用于检测对照基因GADPH的探针Probe2，上述2条探针的核苷酸序列分别为：
Probe1：5’-FAM-CATCGTAGGAGGTGGC-BHQ1-3’
Probe2：5’-VIC-CCGTTCTCAGCCTTGACGGTGC-BHQ1-3’。
为了达到最优的检测效果，所述用于扩增TM4SF1基因的上游引物F1和下游引物R1以及用于检测TM4SF1基因的探针Probe1的高通量比为F1:R1:Probe1为9:9:2.5。
优选地，所述用于扩增对照基因GADPH的上游引物F2和下游引物R2以及用于检测对照基因GADPH的探针Probe2的高通量比为F2:R2:Probe2为9:9:2.5。
优选地，还包括用于进行PCR试验的常规试剂，所述常规试剂包括5×MLV逆转录缓冲液，50μM逆转录引物Oligo-dT，2.5mMdNTPs溶液，10U/μl MLV逆转录酶，10×定量PCR缓冲液，2U/μl TaqDNA聚合酶。
利用TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1)取外周血样本，采用RNA提取试剂盒，利用过柱法从待测外周血中提取总RNA，测RNA的浓度；2)使用常规试剂配制逆转录体系，将步骤1)所得RNA逆转录为待测cDNA；3)分别以步骤2)所得待测cDNA、TM4SF1基因阳性对照所得cDNA以及阴性对照为模板，进行荧光定量PCR；4)在荧光定量PCR扩增仪中扩增，收集FAM、VIC荧光信号；5)扩增结束后，根据荧光曲线判断样本中是否存在TM4SF1的表达。
优选地，所述步骤2)的转录体系包括：5×MLV逆转录缓冲液10μL，10U/μLMLV逆转录酶2μL，50μM逆转录引物Oligo-dT2μL，2.5mMdNTPs溶液8μL，RNA模板14μL，RNAse抑制剂2μL，DEPC水12μL。
优选地，所述步骤2)的逆转录反应的处理时间及温度为：37℃，1h。
优选地，所述步骤3)的PCR体系包括：10×定量PCR缓冲液2μL，Taq酶0.8μL，荧光定量PCR引物和探针组分3.2μL，cDNA样本4μL，2.5mMdNTPs溶液1.8μL，DEPC水8.2μL。
优选地，所述荧光定量PCR引物和探针组分包括：TM4SF1-上游引物F1 18μL，TM4SF1-下游引物R1 18μL，TM4SF1-探针Probe1 5μL，GAPDH-上游引物F2 18μL，GAPDH-下游引物R2 18μL，GAPDH-探针Probe2 5μL，无菌水118μL。
优选地，所述步骤4)的扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s秒、55℃退火60s，共进行40个循环。
与现有技术相比，本发明的优点在于样本来源简单，操作简单，并且因为外周血样本获取简便，对病人的伤害小，更易于在病人的每个病程中获取，从而能够实现动态检测肿瘤状态，准确了解病人的病情。
附图说明
图1为阳性参考品的扩增曲线。
图2为灵敏度试验结果示意图。
图3为临床试验中乳腺癌患者1的检测示意图。
图4为临床试验中乳腺癌患者2的检测示意图。
图5为临床试验中乳腺癌患者3的检测示意图。
图6为临床试验中乳腺癌患者4的检测示意图。
图7为临床试验中乳腺癌患者5的检测示意图。
图8为临床试验中肺癌患者1的检测示意图。
图9为临床试验中肺癌患者2的检测示意图。
图10为临床试验中肺癌患者3的检测示意图。
图11为临床试验中肺癌患者4的检测示意图。
图12为临床试验中肺癌患者5的检测示意图。
图13为临床试验中阳性对照的检测示意图。
图14为临床试验中阴性对照的检测示意图。
图15为临床试验中健康人的检测示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明的一种TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒采用荧光PCR技术，设计特异性探针，实现对TM4SF1的分子检测。引物和探针的设计采用primer3.0专用探针设计软件，将设计的引物和探针在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。该检测盒包括以下组分：荧光定量PCR引物和探针、阳性对照和阴性对照。具体包括：
1、阳性对照和阴性对照：TM4SF1基因阳性对照为表达TM4SF1基因的肿瘤细胞系，阴性对照为无菌水。
2、荧光定量PCR引物和探针：组分(1)：包括用于扩增TM4SF1基因的上游引物F1和下游引物R1、以及用于扩增对照基因GADPH的上游引物F2和下游引物R2，所述4条引物的核苷酸序列分别为：
F1：5’-CCGCTTCGTGTGGTTCTTT-3’
R1：5’-CCAGCCCAATGAAGACAAATG-3’
F2：5’-ATTCCACCCATGGCAAATTC-3’
R2：5’-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’
组分(2)：包括用于检测TM4SF1基因的探针Probe1和用于检测对照基因GADPH的探针Probe2，所述2条探针的核苷酸序列分别为：
Probe1：5’-FAM-CATCGTAGGAGGTGGC-BHQ1-3’
Probe2：5’-VIC-CCGTTCTCAGCCTTGACGGTGC-BHQ1-3’
其中经高通量筛选试验发现，各引物和探针在以下配比下，可达到最理想的检测效果：检测TM4SF1基因的引物和探针比F1:R1:Probe1为9:9:2.5；优选的，引物F1为900nM，R1为900nM，探针Probe1为250nM；检测GAPDH基因的引物和探针比F2:R2:Probe2为9:9:2.5；优选的，引物F2为900nM，R2为900nM，探针Probe2为250nM。
3、本发明的一种TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒还可包括用于进行PCR试验的常规试剂，常规试剂也可在检测过程中另外加入。常规试剂包括MLV逆转录缓冲液(5×)，Oligo(dT)引物(50μM)，dNTPs溶液(2.5mM)，MLV逆转录酶，10X定量PCR缓冲液，2U/μl TaqDNA聚合酶。
其中MLV逆转录缓冲液(5×)包括50mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、50mmol/L KCl、4mmol/L MgCl2和10mmol/L DTT等；
逆转录引物Oligo-(dT)为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸；
dNTPs溶液为dATP(脱氧腺苷三磷酸)的混合水溶液；
PCR反应液包括Taq酶和PCR缓冲液，所述的Taq酶为热启动Taq酶，所述定量PCR缓冲液为常规定量PCR缓冲液，如10×定量PCR缓冲液。
利用本发明的一种TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)提取样本RNA：取1ml外周血样本，利用RNA提取试剂盒，利用过柱法从待测外周血中提取总RNA，测RNA的浓度。具体操作为：取1ml血液，离心后留取200ul上清液及所有沉淀，加入140ul裂解液PKD和20ul蛋白酶K震荡混匀，短暂离心后放置55℃孵育15分钟后80℃孵育15分钟，再加入320ul结合液RBC,充分吹打混匀，将液体转入基因组DNA清除柱中离心1分钟(13000转)，保留液体，往保留的液体中加入720ul无水乙醇。立即吹打混匀不要离心，将液体转入RNA吸附柱中，13000转离心30秒，弃废液，吸附柱中加漂洗液500ul,13000转离心30秒，弃废液，洗2次，再将吸附柱空离2分钟，加入RNA洗脱液30ul，即可提取外周血中的总RNA，测量RNA浓度；
2)将所得RNA逆转录为cDNA：按照下述表1，使用常规试剂配制转录体系50μL并混匀后，放置于PCR仪完成逆转录反应，其中逆转录反应的处理时间及温度为：37℃*1h；逆转录反应所得的待测cDNA，可在4℃下保存备用。转录体系如表1所示：
表1转录体系50μL
| MLV逆转录缓冲液(5×) | 10μL |
| MLV逆转录酶 | 2μL |
| Oligo(dT)引物(50μM) | 2μL |
| dNTPs溶液(2.5mM) | 8μL |
| RNA模板 | 14μL |
| RNAse抑制剂 | 2μL |
| DEPC水 | 12μL |
3)分别以步骤2)所得待测cDNA、TM4SF1基因阳性对照所得cDNA以及阴性对照为模板，进行荧光定量PCR。PCR体系如表2所示，其中PCR体系中的荧光定量PCR引物和探针按照表3配制。
表2 PCR体系20μL
| 反应液组分 | 加量/1人份 |
| 10X定量PCR缓冲液 | 2μL |
| Taq酶 | 0.8μL |
| 荧光定量PCR引物和探针组分 | 3.2μL |
| cDNA样本 | 4μL |
| dNTPs溶液(2.5mM) | 1.8μL |
| DEPC水 | 8.2μL |
表3荧光定量PCR引物和探针组分
4)在荧光定量PCR扩增仪中扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s秒、55℃退火60s，共40个循环，在55℃下收集FAM、VIC荧光信号。
5)扩增结束后，根据荧光曲线判断样本中是否存在TM4SF1的表达。TM4SF1和GAPDH的扩增曲线如图1所示。
灵敏性试验
将阳性对照品的对应cDNA依次按照初始浓度，稀释10倍，100倍，1000倍，10000倍后的浓度作为模板，采用本发明试剂盒进行检测。检测结果如图2所示，随着参考品初始浓度的倍比降低，Ct值分别为20.02，23.65，27.07，30.27，34.97，呈梯度增加表明随着参考品浓度的降低，TM4SF1的表达量依次降低。
试验结果表明本试剂盒对TM4SF1 mRNA的检测具有较高的灵敏性。
临床试验
本发明的TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒，能够检测TM4SF1基因表达的所有肿瘤，包括卵巢癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤。因肿瘤种类过多，故本临床试验选择其中2类肿瘤进行临床验证。
邀请37-69岁的乳腺癌患者5名、37-69岁的肺癌患者5名和1名35岁的健康人(女)，其中患者患病时长为3个月～15个月。分别取11人的外周血1ml，按照TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒的检测方法进行检测，其TM4SF1表达情况如图3-10，汇总结果如表4所述。
表4临床试验结果
结果分析：如表4及图3-15所示，10名患者的ΔCt值(TM4SF1 Ct值-GAPDH Ct值)，其中3名患者不表达TM4SF1基因，7名患者存在TM4SF1基因表达，且该基因的表达量随着患者患病时间增加而增加，与肿瘤种类无关。
另外，乳腺癌患者5和肺癌患者5患病时间均为3个月，本发明的试剂盒即能够准确检测并得到相应的CT值，由此表明本发明的试剂盒的检测灵敏度高。
综合上述验证实验可知，本发明的TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒能够简便、高灵敏度、定量的检测TM4SF1的表达量，从而能够实时检测癌症患者的TM4SF1表达情况。
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 上海科医联创医学检验所有限公司
<120> 一种TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒和检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ccgcttcgtg tggttcttt 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ccagcccaat gaagacaaat g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
attccaccca tggcaaattc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gatgggattt ccattgatga ca 22
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
catcgtagga ggtggc 16
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ccgttctcag ccttgacggt gc 22
Claims (10)
1.一种TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒，其特征在于：包括荧光定量PCR引物和探针、阳性对照和阴性对照，
所述阳性对照为TM4SF1基因阳性对照为表达TM4SF1基因的肿瘤细胞系，
所述阴性对照为无菌水，
所述荧光定量PCR引物和探针包括组分1和组分2，所述组分1：包括用于扩增TM4SF1基因的上游引物F1和下游引物R1、用于扩增对照基因GADPH的上游引物F2和下游引物R2，上述4条引物的核苷酸序列分别为：
F1：5’-CCGCTTCGTGTGGTTCTTT-3’
R1：5’-CCAGCCCAATGAAGACAAATG-3’
F2：5’-ATTCCACCCATGGCAAATTC-3’
R2：5’-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’；
所述组分2：包括用于检测TM4SF1基因的探针Probe1和用于检测对照基因GADPH的探针Probe2，上述2条探针的核苷酸序列分别为：
Probe1：5’-FAM-CATCGTAGGAGGTGGC-BHQ1-3’
Probe2：5’-VIC-CCGTTCTCAGCCTTGACGGTGC-BHQ1-3’。
2.如权利要求1所述的TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒，其特征在于：所述用于扩增TM4SF1基因的上游引物F1和下游引物R1以及用于检测TM4SF1基因的探针Probe1的高通量比为F1:R1:Probe1为9:9:2.5。
3.如权利要求1所述的TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒，其特征在于：所述用于扩增对照基因GADPH的上游引物F2和下游引物R2以及用于检测对照基因GADPH的探针Probe2的高通量比为F2:R2:Probe2为9:9:2.5。
4.如权利要求1所述的TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括用于进行PCR试验的常规试剂，所述常规试剂包括5×MLV逆转录缓冲液，50μM逆转录引物Oligo-dT，2.5mMdNTPs溶液，10U/μl MLV逆转录酶，10×定量PCR缓冲液，2U/μl TaqDNA聚合酶。
5.利用TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)取外周血样本，采用RNA提取试剂盒，利用过柱法从待测外周血中提取总RNA，测RNA的浓度；2)使用常规试剂配制逆转录体系，将步骤1)所得RNA逆转录为待测cDNA；3)分别以步骤2)所得待测cDNA、TM4SF1基因阳性对照所得cDNA以及阴性对照为模板，进行荧光定量PCR；4)在荧光定量PCR扩增仪中扩增，收集FAM、VIC荧光信号；5)扩增结束后，根据荧光曲线判断样本中是否存在TM4SF1的表达。
6.如权利要求5所述的利用TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤2)的转录体系包括：5×MLV逆转录缓冲液10μL，10U/μLMLV逆转录酶2μL，50μM逆转录引物Oligo-dT2μL，2.5mMdNTPs溶液8μL，RNA模板14μL，RNAse抑制剂2μL，DEPC水12μL。
7.如权利要求5所述的利用TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤2)的逆转录反应的处理时间及温度为：37℃，1h。
8.如权利要求5所述的利用TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤3)的PCR体系包括：10×定量PCR缓冲液2μL，Taq酶0.8μL，荧光定量PCR引物和探针组分3.2μL，cDNA样本4μL，2.5mMdNTPs溶液1.8μL，DEPC水8.2μL。
9.如权利要求8所述的利用TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR引物和探针组分包括：TM4SF1-上游引物F1 18μL，TM4SF1-下游引物R1 18μL，TM4SF1-探针Probe1 5μL，GAPDH-上游引物F2 18μL，GAPDH-下游引物R2 18μL，GAPDH-探针Probe2 5μL，无菌水118μL。
10.如权利要求5所述的利用TM4SF1基因mRNA核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤4)的扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s秒、55℃退火60s，共进行40个循环。
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